葉　青　胡　仁　周劍章　葉藝文　許朝曦　林昌健　林種玉,*(廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系，固體表面物理化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門6005；浙江師范大學(xué)初陽(yáng)學(xué)院，浙江金華004；廈門阿爾特系統(tǒng)工程有限公司，福建廈門6005)

BSA與羥磷灰石相互吸附的FTIR-ATR光譜

葉青2胡仁1周劍章1葉藝文1許朝曦3林昌健1林種玉1,*
(1廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系，固體表面物理化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361005；2浙江師范大學(xué)初陽(yáng)學(xué)院，浙江金華321004；3廈門阿爾特系統(tǒng)工程有限公司，福建廈門361005)

采用傅里葉變換紅外衰減全反射(FTIR-ATR)光譜法對(duì)牛血清白蛋白(BSA)在羥磷灰石(HA) [Ca10(OH)2(PO4)6]表面不同時(shí)間的相互吸附作用進(jìn)行了表征。在BSA溶液作用下，羥磷灰石表面的Ca2+、PO43－和OH－離子初始的溶解和再沉淀使得BSA與HA相互作用層層疊加，在HA表面形成從表層到次表層分子都包含有吸附的BSA的覆蓋層，從而加深兩者之間的相互作用。經(jīng)紅外差譜法處理過(guò)的相關(guān)ATR數(shù)據(jù)表明，BSA與HA之間的相互作用是快速的，并隨時(shí)間變化進(jìn)一步加強(qiáng)；來(lái)自HA上PO43－的P＝O基團(tuán)對(duì)蛋白質(zhì)肽鍵的酰胺II帶(―CNH)、多肽鏈的甲基(―CH3)和亞甲基(―CH2)上氫的吸附作用要比P―O快速而且強(qiáng)烈。Ca2+在該吸附過(guò)程中起了極其重要的作用，其快速與蛋白質(zhì)肽鍵的羰基氧發(fā)生作用，并誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由β-折疊向α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)象轉(zhuǎn)變；伴隨著這一構(gòu)象變化，蛋白質(zhì)多肽鏈上大多數(shù)肽鍵的―C＝O和H―N―活性基團(tuán)從鏈間氫鍵交聯(lián)中釋放出來(lái)，帶動(dòng)眾多的氫分別參與同HA表面的Ca2+、PO43－和OH－離子的相互吸附作用，并牢牢地結(jié)合于HA表面；這對(duì)硬組織的再生起著重要作用，促進(jìn)了HA的生物礦化過(guò)程。

生物材料；蛋白質(zhì)吸附作用；多肽；紅外光譜；FTIR-ATR；生物礦化作用

O646

doi:10.3866/PKU.WHXB201511301

1　引言

蛋白質(zhì)的吸附作用有強(qiáng)吸附和弱吸附1，強(qiáng)吸附作用對(duì)各種生物過(guò)程產(chǎn)生著重要的影響，首先是對(duì)植入材料的生物反應(yīng)的影響。相關(guān)作用的研究普遍側(cè)重于測(cè)定各種生物材料表面吸附蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象情況2－8。作為生物活性陶瓷的羥磷灰石與蛋白質(zhì)之間的相互吸附作用過(guò)程也已有諸多的報(bào)道6－10，但相關(guān)過(guò)程的分子作用機(jī)制以及吸附的蛋白質(zhì)是以何種分子構(gòu)象為主乃存在爭(zhēng)議，還有待進(jìn)一步探討。本文在前期工作10的基礎(chǔ)上，采用傅里葉變換紅外衰減全反射(FTIR-ATR)光譜法進(jìn)一步考察了牛血清白蛋白在HA表面的吸附作用，揭示它們之間在各不同時(shí)間的相互作用機(jī)理。FTIR-ATR光譜法直接提供了吸附于HA表面的蛋白質(zhì)的相關(guān)信息，但應(yīng)該注意的一個(gè)重要問(wèn)題是，由于ATR反射光透過(guò)深度(紅外漸消場(chǎng)在酰胺I和酰胺II帶區(qū)間的貫穿深度大約是400－600 nm)超過(guò)HA修飾層的厚度(約為20－40 nm)，而進(jìn)入BSA溶液中，該檢測(cè)所得到的是表面吸附的和非吸附的蛋白質(zhì)的混合光譜11。因此必須利用紅外差譜方法2,11減去那部分非吸附的蛋白質(zhì)的貢獻(xiàn)，才能得到準(zhǔn)確的吸附于HA表面的蛋白質(zhì)信息。此方法提供了可信賴的而且重現(xiàn)性較好的差減結(jié)果12。另外，由于水在1643 cm－1處有較強(qiáng)的羥基彎曲振動(dòng)吸收，在一定程度上干擾了蛋白質(zhì)酰胺I帶而影響觀察其吸收情況。本實(shí)驗(yàn)采用重水(D2O)代替水溶液。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1主要試劑

BSA(0903，99.0%)為上海生物工程有限公司生產(chǎn)的生化試劑。

2.2樣品制備

鍺晶體表面羥磷灰石的修飾按照文獻(xiàn)9,10報(bào)道的方法進(jìn)行。將幾何尺寸為50 mm×10 mm×3 mm的ATR鍺晶體側(cè)立浸泡于沸騰的飽和Ca(OH)2溶液40 min，再用20%的H3PO4溶液(pH 2.0－2.4)于90°C繼續(xù)浸泡30 min，之后將該晶體用去離子水沖洗2次在室溫下晾干。牛血清白蛋白用0.9% NaCl重水溶液配制成濃度為40 mg?mL－1的BSA溶液。

2.3FTIR-ATR檢測(cè)

使用美國(guó)Nicolet 740 SX FT-IR光譜儀，MCTB檢測(cè)器，衰減全反射附件。反射光束由鍺晶體45°斜面入射，在晶體內(nèi)產(chǎn)生多次的衰減全反射再經(jīng)聚焦反射到達(dá)檢測(cè)器檢測(cè)。先測(cè)定鍺晶體表面空白HA；之后往液池(帶有HA修飾層的鍺晶)中注入1 mL新鮮的BSA溶液，從0 min開始每隔1 min掃描收集數(shù)據(jù)至10 min，然后至15、30、60 min以及5、24和30h。掃描波長(zhǎng)范圍：4000－625cm－1，分辨率為4 cm－1，增益為1，掃描次數(shù)為128。為了檢驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性，確保檢測(cè)質(zhì)量，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)做3次。實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的數(shù)據(jù)是HA表面吸附的和非吸附的BSA的混合光譜。為了獲得準(zhǔn)確的吸附于HA表面的BSA的信息，利用紅外差譜法，調(diào)節(jié)各個(gè)差減因子(FCR)扣除那部分非吸附的蛋白質(zhì)的吸收。

3　結(jié)果與討論

3.1羥磷灰石及其對(duì)BSA的吸附作用

3.1.1鍺晶體表面羥磷灰石修飾層

圖1曲線1示出修飾于鍺晶體表面羥磷灰石[Ca10(OH)2(PO4)6]的FTIR-ATR光譜圖；與HA透射譜帶101100－1000 cm－1區(qū)間出現(xiàn)的各吸收帶頻率相比較基本上接近，說(shuō)明鍺晶體表面的修飾層的確為HA,這樣該修飾層含有Ca2+、PO34－和OH－羥磷灰石離子。其中1098和1026 cm－1吸收帶均與HA的PO基團(tuán)振動(dòng)有關(guān)13，可分別歸屬于P＝O和P―O的伸縮振動(dòng)帶。1656 cm－1的吸收為HA分子的O―H基團(tuán)的彎曲振動(dòng)帶(該吸收帶弱，并不影響觀察蛋白質(zhì)酰胺I帶的吸收情況)。

圖1曲線2和3分別為HA與BSA作用1 min和30 h的FTIR-ATR光譜圖。譜線2和3上的蛋白質(zhì)酰胺I帶(1652，1649 cm－1)、酰胺II帶(1548，1563 cm－1)以及蛋白質(zhì)多肽鏈上的亞甲基(1459和1455 cm－1)和甲基(1445和1443 cm－1)的C―H彎曲振動(dòng)帶13－15的吸收實(shí)際上均為HA表面吸附的和非吸附的BSA的混合吸收光譜。作用1 min的P＝O譜帶由空白時(shí)的1098 cm－1紅移至1094 cm－1，但作用了30 h該譜帶還是在1094 cm－1處；而空白HA的P―O基團(tuán)及其與BSA分別作用1 min和30 h的吸收均在1026 cm－1處。說(shuō)明曲線2和3所示的1094與1026 cm－1的吸收應(yīng)該分別來(lái)自HA分子中參與吸附和未參與吸附蛋白質(zhì)的P＝O與P―O各基團(tuán)的混合吸收帶。很可能由于參與吸附作用的PO(P＝O與P―O)各基團(tuán)含量較少，分別被還未參與吸附的各PO基團(tuán)(含量多)的吸收所掩蓋，因而看不出譜帶的紅移。1208 cm－1處的吸收歸屬于重水O―D的彎曲振動(dòng)帶。

圖1　鍺晶體表面HA修飾層及其與BSA作用不同時(shí)間的FTIR-ATR光譜Fig.1　FTIR-ATR spectra of HAcoated on Ge crystal and reacted with BSAfor different time

3.1.2羥磷灰石修飾層的溶解與再沉淀

圖2示出修飾于鍺晶體表面的空白HA(曲線1)及其分別與BSA相互作用5 min,0.5 h,24 h和30 h的FTIR-ATR光譜圖。由曲線2可以看出：加入BSA溶液的最初5 min，HA的P―O基團(tuán)吸收帶比曲線1明顯減弱。說(shuō)明加入BSA(NaCl/D2O)溶液后，HA修飾層與BSA發(fā)生了相互吸附作用；與此同時(shí)，BSA溶液中的Na+和Cl－很可能與涂層表面羥磷灰石離子進(jìn)行離子交換6,16使部分Ca2+、與OH－溶解進(jìn)入BSA溶液中；溶液中的蛋白質(zhì)很容易吸附(結(jié)合)溶解出的PO34－基團(tuán)，因此促使PO34－基團(tuán)的進(jìn)一步溶解(注意：這里PO34－基團(tuán)進(jìn)入溶液中的位置應(yīng)該超出ATR反射光的透過(guò)深度)，因此ATR檢測(cè)到的各PO基團(tuán)的吸收強(qiáng)度減弱?；鶊F(tuán)含有3個(gè)P―O鍵和1個(gè)P＝O鍵(空白HA的P―O吸收帶明顯比P＝O強(qiáng))，所以在最初5 min，隨著PO34－基團(tuán)的溶解，1026 cm－1處的P―O基團(tuán)吸收帶強(qiáng)度減弱要比P＝O明顯得多。文獻(xiàn)6報(bào)道在初始的相同時(shí)間段里，含有白蛋白的鹽溶液從磷酸鈣涂層釋放出的PO34－基團(tuán)比空白鹽溶液所釋放的要多得多(前者約為后者的2.5倍多)。顯然，蛋白質(zhì)的吸附作用是影響HA修飾層溶解的重要因素6,17。

圖2　HA修飾層及其與BSA作用不同時(shí)間的FTIR-ATR光譜Fig.2　FTIR-ATR spectra of HAcoating and reacted with BSAfor different time

隨后吸附于HA涂層表面的生物大分子繼續(xù)吸附溶液中的HA離子，使溶液中的Ca2+、和OH－離子快速沉淀下來(lái)。于是涂層上PO各基團(tuán)吸收帶逐漸增強(qiáng)(圖2曲線3－5)。這部分被吸附而覆蓋于蛋白質(zhì)表面的HA離子緊接著又與溶液中的BSA發(fā)生吸附作用。HA表面的Ca2+、PO34－和OH－離子的這種初始的溶解和再沉淀9,18,19使得BSA與HA相互作用層層疊加，在HA修飾層形成從表層到次表層分子都包含有吸附的BSA覆蓋層9，從而加深兩者之間的相互作用。

3.1.3羥磷灰石(PO43－基團(tuán))對(duì)BSA的吸附作用

為了得到準(zhǔn)確的參與吸附蛋白質(zhì)的PO各基團(tuán)的信息，利用IR差譜法扣除那部分還未參與吸附蛋白質(zhì)的PO各基團(tuán)的吸收。圖3曲線1是與BSA作用1 min的HA扣除空白HA譜線的差減結(jié)果。該曲線較為準(zhǔn)確地展示出作用1 min時(shí)參與吸附蛋白質(zhì)的PO各基團(tuán)的信息。譜線上HA的PO各基團(tuán)由于參與吸附蛋白質(zhì)，P＝O基團(tuán)的吸收由原來(lái)的1098 cm－1紅移至1091和1064 cm－1，而P―O由1026紅移至1015 cm－1。僅僅作用1 min時(shí)間，PO各吸收帶就出現(xiàn)明顯紅移，充分表明HA對(duì)BSA的作用是快速的化學(xué)吸附。圖3曲線2－5分別是與BSA作用30 min、60 min、5 h和30 h的HA減去空白HA的紅外光譜差譜。各曲線分別清楚地展示出參與吸附蛋白質(zhì)的P＝O基團(tuán)的紅移：由1090和1063 cm－1(30 min)分別至1089和1063 cm－1(60 min、5 h和30 h)以及P―O基團(tuán)由1013 cm－1(30 min)→1010 cm－1(60 min)→1009 cm－1(5 h)→1007 cm－1(30 h)。而且這些吸收帶強(qiáng)度隨時(shí)間變化明顯增強(qiáng)；1063和1089 cm－1譜帶增強(qiáng)尤為明顯，表明P＝O基團(tuán)與蛋白質(zhì)的相互吸附作用要比P―O基團(tuán)快速而且強(qiáng)烈。PO各基團(tuán)很可能是與蛋白質(zhì)多肽的―CH3、―CH2和肽鍵的―C―N―H基團(tuán)的氫發(fā)生吸附作用。從PO的價(jià)鍵結(jié)構(gòu)特征分析：P―O單鍵為σ鍵而P＝O雙鍵除含有σ鍵外還含有π鍵。由于π鍵在化學(xué)性能上比σ鍵更活潑，更容易接受―CH和―CNH上的氫原子，因此含有π鍵的P＝O基團(tuán)與氫的相互作用要比P―O更加迅速而強(qiáng)烈。這與紅外光譜檢測(cè)分析結(jié)果完全一致。P＝O基團(tuán)對(duì)蛋白質(zhì)的作用有強(qiáng)吸附(1063 cm－1)和弱吸附(1089 cm－1)兩種情況，其強(qiáng)吸附作用比弱吸附要快速得多。

圖3　與BSA作用不同時(shí)間的HA的FTIR-ATR光譜差譜Fig.3　FTIR-ATR subtraction results of HA reacted with BSAfor different time

圖4　與HA作用不同時(shí)間的BSA的FTIR-ATR光譜差譜Fig.4　FTIR-ATR difference spectra of BSAreacted with HAfor different time

3.2牛血清白蛋白在HA上的吸附作用

圖4曲線1－5分別為與HA作用1 min、30 min、60 min、5 h和30 h的BSA減去與HA作用0 min的BSA光譜差譜。這里0 min譜線是經(jīng)過(guò)128次掃描，歷時(shí)64 s獲得的，該譜線是HA表面吸附和非吸附的BSA混合光譜，但非吸附的占據(jù)大多數(shù)。減去該譜線時(shí)，雖然減去了一小部分初始吸附的BSA，但非吸附的BSA卻全被扣除。而各譜線都同樣扣除那一小部分初始吸附的BSA，并不影響各吸附的BSA譜線之間的對(duì)比分析結(jié)果。由于扣除了非吸附的BSA吸收的干擾，曲線1展示出與HA作用1 min后吸附于HA表面的蛋白質(zhì)吸收帶。1651 cm－1的吸收歸屬于肽鍵的酰胺I帶C＝O伸縮振動(dòng)，說(shuō)明該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是以α-螺旋構(gòu)象(這是蛋白質(zhì)中含量最豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)，體系中該譜帶的中心位置應(yīng)于1653 cm－1附近)成分為主3,20,21，應(yīng)該還包含有β-折疊構(gòu)象(這是蛋白質(zhì)中第二種最常見(jiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu))成分所對(duì)應(yīng)的振動(dòng)吸收子帶；該譜帶的中心大約位于1632 cm－1附近，在此與α-螺旋構(gòu)象所對(duì)應(yīng)的振動(dòng)吸收子帶重疊在一起2,3,12,21。1459和1445 cm－1的吸收分別為多肽的―CH2和―CH3的C―H彎曲振動(dòng)帶。曲線1－3示出在重水中(1－60 min)譜帶1540－1579 cm－1的吸收均處在肽鍵酰胺II帶的范圍內(nèi)13－15,21(酰胺II帶在酰胺質(zhì)子氫-氘交換后，產(chǎn)生大的紅移，移至1450 cm－1附近)，說(shuō)明由于該酰胺質(zhì)子處于內(nèi)埋或強(qiáng)的氫鍵作用而不容易交換，使氫-氘交換作用不完全21。

值得注意的是，圖4曲線2示出BSA與HA作用30 min后，位于1579、1570和1550 cm－1的酰胺II帶的吸收比作用1 min的各對(duì)應(yīng)吸收帶都有1－3 cm－1的藍(lán)移。該譜帶來(lái)自酰胺II帶的N―H彎曲振動(dòng)和C―N伸縮振動(dòng)強(qiáng)偶合產(chǎn)生的吸收帶13,14,21，譜帶的藍(lán)移說(shuō)明N―H和C―N的鍵力有所增強(qiáng)。文獻(xiàn)21,22表明，當(dāng)有金屬離子存在時(shí)，歸屬于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)β-折疊的酰胺II帶的吸收發(fā)生4－6 cm－1的藍(lán)移(酰胺I帶有1 cm－1的位移)；并進(jìn)一步指出，由于金屬離子的影響，使得蛋白質(zhì)(尤其是1634 cm－1處的β-折疊構(gòu)象)有很大一部分的氫鍵作用發(fā)生了變化。因此可以推斷體系中吸附的BSA的β-折疊的多肽鏈間氫鍵交聯(lián)已經(jīng)發(fā)生了變化。這里肽鍵的―C―N―H基團(tuán)中C―N和N―H鍵力增強(qiáng)，說(shuō)明體系中沒(méi)參與相鄰鏈間肽鍵(―N―H和O＝C―)的氫鍵交聯(lián)作用的―N―H含量增加了(可以確定沒(méi)參與氫鍵作用的O＝C―含量也隨之增加)；因?yàn)棣?折疊中所有的肽鍵都參與了多肽鏈間氫鍵的交聯(lián)作用23，這就是說(shuō)原來(lái)β-折疊中相鄰肽鏈間的氫鍵在Ca2+的作用下發(fā)生了斷裂，轉(zhuǎn)而由各自肽鏈結(jié)構(gòu)的―N―H和O＝C―形成5→1或4→1(肽單元)鏈內(nèi)氫鍵的α-螺旋或β-轉(zhuǎn)角23等的構(gòu)象。由于Ca2+極易與蛋白質(zhì)結(jié)合并誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)向α-螺旋轉(zhuǎn)變24－29；又由于α-螺旋構(gòu)象的規(guī)則性引起該螺旋折疊中的協(xié)同作用，一旦體系中形成鏈內(nèi)第一圈α-螺旋，隨后逐個(gè)殘基的加入(即螺圈的形成)就會(huì)變得更加容易而迅速23。因此曲線2酰胺II帶的藍(lán)移說(shuō)明體系中有一部分蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋。在這種情況下，由于沒(méi)參與氫鍵交聯(lián)的―C＝O基團(tuán)含量增加，酰胺I帶理應(yīng)藍(lán)移；但曲線2的酰胺I帶卻由原來(lái)的1651 cm－1紅移至1644 cm－1。文獻(xiàn)30指出：來(lái)自肽鏈側(cè)鏈帶負(fù)電荷的羧基氧和肽鍵上不帶電荷的羰基氧都能很好地結(jié)合于Ca2+上，因此酰胺I帶的紅移應(yīng)該是Ca2+與α-螺旋中沒(méi)參加氫鍵交聯(lián)作用的羰基氧發(fā)生了吸附作用，并進(jìn)一步形成配位鍵3,15,30，使得C＝O鍵力削弱，酰胺I帶紅移2,15,31。EDS檢測(cè)出空白HA表面的Ca/P比值為1.259，說(shuō)明該修飾層表面Ca2+的含量較高，能與較多酰胺I帶的氧發(fā)生作用。這里酰胺I帶的頻率位置主要取決于兩方面的因素：一是當(dāng)肽鏈由β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋時(shí)，由于沒(méi)參與氫鍵交聯(lián)作用的羰基氧含量增多，C＝O鍵力增強(qiáng)而引起譜帶藍(lán)移；二是Ca2+與羰基氧的絡(luò)合作用削弱C＝O鍵力，而導(dǎo)致該譜帶紅移。由于后者的作用更為強(qiáng)烈，兩者疊加的結(jié)果是C＝O鍵力削弱引起譜帶紅移。之前發(fā)表的論文，由于體系中Pt(IV)32以及Au(III)33的含量很少，因此金屬離子對(duì)羰基氧的作用所引起C＝O鍵力的削弱程度比起由于肽鏈構(gòu)象變化而釋放出相當(dāng)大一部分的羰基氧所引起的C＝O鍵力增強(qiáng)，前者的作用顯得微不足道(基本上可以忽略)；凈結(jié)果自然是C＝O鍵力增強(qiáng)，導(dǎo)致譜帶藍(lán)移。因此判斷蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象時(shí)，在金屬離子含量較多的情況下，應(yīng)該考慮到其與羰基氧的作用對(duì)C＝O鍵力的影響。曲線2的1644 cm－1的吸收應(yīng)該是吸附于HA表面的BSA中已經(jīng)參與和還未參與同Ca2+作用的α-螺旋的C＝O混合吸收帶。

圖4曲線3示出與HA作用60 min的BSA酰胺I帶有一部分由原來(lái)的1644 cm－1紅移至1639 cm－1處，而且酰胺II帶各吸收也比作用30 min時(shí)的有明顯紅移，說(shuō)明此時(shí)BSA與HA之間的相互作用進(jìn)一步增強(qiáng)。

圖4曲線4示出與HA作用5 h的BSA的酰胺I帶由1644 cm－1紅移至1643 cm－1，其原來(lái)的1639 cm－1的吸收應(yīng)該被包在1643 cm－1譜帶中。酰胺II帶比作用60 min的各有2－6 cm－1的藍(lán)移，說(shuō)明此時(shí)肽鏈β-折疊的鏈間氫鍵在Ca2+的作用下繼續(xù)斷裂而轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋構(gòu)象(與曲線2的情況相似)。

作用30 h的BSA(圖4曲線5)在1587 cm－1處的肩峰和1403 cm－1的吸收分別來(lái)自肽鏈側(cè)鏈及其C端的離子化羧基()的反對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收帶13,15,34－36，該吸收比作用5 h的明顯增強(qiáng)，說(shuō)明隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，吸附于HA表面的羧基陰離子的量進(jìn)一步增加。Ca2+應(yīng)該是通過(guò)強(qiáng)大的靜電作用力將羧基陰離子吸引到HA表面，兩者之間靠離子鍵維系15,21,34,35。羧基陰離子比酰胺I帶更容易與Ca2+發(fā)生配位作用24,25,36，形成配位羧基后，其反對(duì)稱伸縮振動(dòng)譜帶由原來(lái)的1587 cm－1藍(lán)移至1605 cm－1附近34,36；由于含量少(該紅外吸收大約只占酰胺I帶的10%－30%35,37)，被強(qiáng)的酰胺Ⅰ帶所掩蓋21。1668 cm－1處出現(xiàn)的新峰來(lái)自β-轉(zhuǎn)角構(gòu)象的羰基吸收20,21,38，這是由各自肽鏈上肽鍵的―C＝O與H―N―基團(tuán)之間形成4→1的分子內(nèi)氫鍵的又一種環(huán)形構(gòu)象23。此外還可清楚地看到歸屬于α-螺旋構(gòu)象的酰胺I帶分裂為1645和1639 cm－1兩個(gè)吸收峰(隨后將對(duì)此作詳細(xì)分析)；該吸收帶整體的強(qiáng)度隨時(shí)間變化明顯增強(qiáng)，說(shuō)明有更多α-螺旋的羰基氧參與了同Ca2+的相互作用。曲線5的酰胺II帶(1574、1562和1540 cm－1)以及1－5各條曲線的CH2(1459－1453 cm－1)和CH3(1446－1443 cm－1)的C―H彎曲振動(dòng)吸收帶也都隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，CH2吸收帶的增強(qiáng)尤為明顯(曲線5，1456 cm－1)；說(shuō)明隨著越來(lái)越多酰胺I帶與Ca2+的作用，帶動(dòng)更多肽鍵和碳?xì)滏I上的氫參與了同HA表面的PO和OH基團(tuán)的吸附作用，并且牢牢地結(jié)合于HA表面。在這一吸附過(guò)程中，酰胺II帶始終保持在正常的范圍內(nèi)；酰胺質(zhì)子的氘代作用難于在Ca2+負(fù)載的狀態(tài)下進(jìn)行，暗示Ca2與肽鍵的結(jié)合相當(dāng)緊密和堅(jiān)實(shí)。進(jìn)一步表明體系中的BSA與HA具有很強(qiáng)的相互作用能力。

圖5曲線1－7示出與HA作用30 h的BSA分別扣除與HA作用0、1、2、3、5、10、15 min的BSA的光譜差譜。這里主要觀察從0、1、2、3、5、10、15 min至30 h各不同時(shí)間段酰胺I帶的吸收情況。其中1668 cm－1(來(lái)自β-轉(zhuǎn)角構(gòu)象的羰基吸收，其含量明顯比較少)和1639 cm－1(主要來(lái)自與Ca2+發(fā)生作用的α-螺旋的酰胺I帶)兩處的吸收頻率并不隨各不同的時(shí)間段而變化，吸收強(qiáng)度也沒(méi)有明顯的改變；而1649 cm－1的吸收頻率和強(qiáng)度卻隨各不同的時(shí)間段而變化。此時(shí)(已經(jīng)作用了30 h)，體系中絕大多數(shù)的Ca2+都參加了與羧基陰離子和α-螺旋的羰基氧的配位作用，已經(jīng)達(dá)到了化學(xué)平衡；而肽鏈的α-螺旋還在形成。Chittur20指出，溶液中蛋白質(zhì)α-螺旋的吸收發(fā)生在較低的波數(shù)，大約在1650－1655 cm－1附近；而在重水中該吸收會(huì)降得更低。因此，1649 cm－1的吸收應(yīng)該主要來(lái)自這部分還沒(méi)與Ca2+發(fā)生絡(luò)合作用的α-螺旋的C＝O吸收帶的貢獻(xiàn)。從曲線1至7(時(shí)間段朝后靠)，該吸收呈增長(zhǎng)趨勢(shì)并由1645 cm－1(曲線1－4)→1646 cm－1(曲線5)→1648 cm－1(曲線6)→1649 cm－1(曲線7)呈現(xiàn)藍(lán)移；表明隨著時(shí)間段朝后推移，體系中沒(méi)與Ca2+發(fā)生作用的α-螺旋的―C＝O含量逐漸增多。這為該體系吸附的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化趨勢(shì)是由β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋(和一小部分β-轉(zhuǎn)角)提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

圖5　系列與HA作用30 h的BSA的FTIR-ATR光譜差譜Fig.5　FTIR-ATR subtraction results of BSA reacted with HAfor 30 h

3.3α-螺旋構(gòu)象促進(jìn)蛋白質(zhì)與HA之間的相互作用

Moulton等1觀察到吸附于TiO2表面免疫球蛋白的酰胺I帶(1636 cm－1)和酰胺II帶(1545 cm－1)在加入磷酸鹽緩沖液后兩譜帶吸收明顯減弱，而且酰胺I帶由1636 cm－1藍(lán)移至1651 cm－1。這是由于原先吸附于TiO2表面的酰胺I帶(1636 cm－1)是以β-折疊構(gòu)象成分為主而其中還含有一部分α-螺旋構(gòu)象成分所對(duì)應(yīng)的振動(dòng)吸收子帶。當(dāng)加入磷酸鹽緩沖劑后，PO各基團(tuán)參與了同TiO2表面該蛋白質(zhì)酰胺I帶的競(jìng)爭(zhēng)吸附作用；取代了吸附于該表面酰胺I帶中絕大部分的β-折疊(弱吸附)組分，導(dǎo)致1636 cm－1譜帶消失只剩下α-螺旋組分所對(duì)應(yīng)的吸收帶(1651 cm－1)。充分說(shuō)明α-螺旋構(gòu)象的蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的吸附能力，能牢牢地結(jié)合于TiO2生物材料表面。

β-折疊構(gòu)象中所有肽鍵的―N―H和O＝C―基團(tuán)都參加了多肽鏈間的氫鍵交聯(lián)作用；而α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角分別只有20%和25%的肽鍵參加鏈內(nèi)的氫鍵交聯(lián)。當(dāng)BSA蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象由β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋和β-轉(zhuǎn)角時(shí)，其肽鏈上分別有相當(dāng)多的―N―H和O＝C―活性基團(tuán)從鏈間氫鍵作用中釋放出來(lái)參與同HA作用；而且隨著肽鏈由伸展的折疊片向螺旋圈卷曲而引起該鏈及其側(cè)鏈上各化學(xué)官能團(tuán)的空間位置發(fā)生變化這一動(dòng)態(tài)過(guò)程，帶動(dòng)更多的羧基陰離子、肽鍵以及大量的氫共同參與對(duì)HA的吸附作用，大大提高該蛋白質(zhì)對(duì)HA的親合性。另外，由于α-螺旋0.54 nm的螺距與Ca2+在HA六方晶系中(001晶面)的0.545 nm原子間點(diǎn)陣間距十分接近39，這一有意義的構(gòu)象特征十分有利于蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)其自身與Ca2+的相互作用24,40,41。看來(lái)吸附的蛋白質(zhì)的α-螺旋構(gòu)象，其規(guī)律性間距的羰基氧和側(cè)鏈羧基陰離子與處于這種點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)的Ca2+形成了高度的互補(bǔ)。這應(yīng)該是蛋白質(zhì)能牢固地吸附并結(jié)合于HA表面的重要原因。體系中BSA正是通過(guò)肽鏈α-螺旋表面大量的活性基團(tuán)與HA之間的這種強(qiáng)的化學(xué)吸附作用來(lái)傳遞并調(diào)節(jié)細(xì)胞活性物質(zhì)對(duì)HA界面的基本反應(yīng)42,43，這對(duì)促進(jìn)硬組織的再生起著十分重要的作用8,44－46。

4　結(jié)論

IR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：吸附于HA表面的BSA在Ca2+的誘導(dǎo)作用下，其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋和一小部分β-轉(zhuǎn)角的圈形構(gòu)象，從而大大提高了蛋白質(zhì)對(duì)HA生物材料的吸附活性，使蛋白質(zhì)能牢牢地吸附并結(jié)合于HA表面。這樣有利于細(xì)胞活性物質(zhì)與HA界面的相互作用，從而引起和促進(jìn)了生物礦化過(guò)程。

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FTIR-ATR Spectrometry of BSA Adsorption on Hydroxyapatite

YE Qing2HU Ren1ZHOU Jian-Zhang1YE Yi-Wen1XU Zhao-Xi3LIN Chang-Jian1LIN Zhong-Yu1,*
(1State Key Laboratory of Physical Chemistry of Solid Surfaces,Department of Chemistry,College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,Fujian Province,P.R.China;2Chuyang Honors College,Zhejiang Normal University,Jinhua 321004,Zhejiang Province,P.R.China;3Xiamen AERTE System Engineering CO.,LTD,Xiamen 361005,Fujian Province,P.R.China)

The microcosmic process of bovine serum albumin(BSA)adsorbing onto hydroxyapatite(HA)for different time intervals was investigated by Fourier transform infrared attenuated total internal reflectance(FTIRATR)spectrometry.The initial dissolution and re-precipitation of PO43－,Ca2+,and OH－ions from the HAcoating led to the occurrence of the coating including adsorbed BSAon the HA from surface-to subsurface-molecular layers and to in-depth interaction between BSAand HA.The subtraction results gained in the adsorption regions of HAand BSAreveal that the binding of P＝O,from the phosphate(PO43－),tothehydrogenof amide II,methyl and methene of the BSA appears to be considerably more rapid and stronger than that of the P―O group.In addition,it is very likely that Ca2+plays an important role in the interaction of BSAwith HA.It appears that the binding of Ca2+to the carbonyl-oxygen of the peptide bond in BSAcaused a significant,molecular,conformationalrearrangement of polypeptide backbones from β-pleated sheet to helical circles of α-helix and β-turn.This change appears to have been followed by much hydrogen of polypeptides being driven to bind PO43－and OH－effectively and much―C＝O and H―N―groups of the peptide bond being freed from inter-chain hydrogenbonding to act on Ca2+and combine strongly with the HAsurface.This might reasonably be expected to promote hard tissue regeneration.BSA seems to be activated by the inductive effect of Ca2+via the molecular rearrangement of polypeptide backbones from pleated sheet to helical circles and in turn reacts strongly on the HA,resulting in profound effects on the course of biomineralization.

Biomaterial;Protein adsorption;Polypeptide;IR spectroscopy;FTIR-ATR;Biomineralization

July 2,2015;Revised:November 26,2015;Published on Web:November 30,2015.*Corresponding author.Email:stzylin@xmu.edu.cn;Tel:+86-592-2185956.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(51571169).

國(guó)家自然科學(xué)基金(51571169)資助項(xiàng)目

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