謝全喜，亓秀曄，陳振，于佳民，徐輝，徐海燕，林顯華，谷巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

適宜母豬配合飼料發(fā)酵的菌種篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

謝全喜*，亓秀曄，陳振，于佳民，徐輝，徐海燕，林顯華，谷巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

通過測定發(fā)酵飼料pH值、活菌數(shù)、粗蛋白質(zhì)和總酸含量，篩選出適宜妊娠母豬配合飼料發(fā)酵的鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）BLCC2-0038和產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）BLCC4-0021，并對篩選出的鼠李糖乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母復(fù)配發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，BLCC2-0038單獨(dú)發(fā)酵48 h時pH值降至3.88，活菌數(shù)為69.5×108cfu/g，總酸含量高達(dá)27.38 mg/g；BLCC4-0021單獨(dú)發(fā)酵48 h時活菌數(shù)為544.0×107cfu/g，粗蛋白質(zhì)含量高出對照11.32%。最佳的混菌接種組合為BLCC2-0038∶BLCC4-0021=1.5%∶0.5%。使用最佳的菌種組合發(fā)酵妊娠母豬配合飼料的最佳工藝條件為：料水比1∶0.6、溫度28℃、發(fā)酵時間48 h，在此條件下乳酸桿菌活菌數(shù)為109.0×108cfu/g，酵母菌活菌數(shù)為46×106cfu/g和總酸含量為14.71 mg/g。

妊娠母豬；配合飼料；發(fā)酵；鼠李糖乳桿菌；產(chǎn)朊假絲酵母；活菌數(shù)；粗蛋白質(zhì)；總酸含量

微生物發(fā)酵飼料是指在人為可控制的條件下，以植物性農(nóng)副產(chǎn)品為主要原料，利用乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌等有益微生物對一種或多種飼料原料進(jìn)行厭氧或好氧發(fā)酵，達(dá)到提高飼料原料營養(yǎng)物質(zhì)利用率，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時有益微生物大量繁殖、富集，功能性初級、次級代謝產(chǎn)物大量生成的一種新型發(fā)酵生物飼料（林標(biāo)聲等，2015）。乳酸菌是應(yīng)用最早、最廣泛的益生菌，具有益生菌的效用，可維持腸道菌群平衡、提高免疫力、促生長和改善環(huán)境，且具有無殘留、無耐藥性和無毒害等，同時乳酸菌發(fā)酵飼料作為功能性飼料，還具有適口性好、飼喂簡便、功效穩(wěn)定等優(yōu)勢，具有良好的生產(chǎn)和應(yīng)用價值（王曉偉等，2015）。酵母菌固態(tài)發(fā)酵可將無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，并且在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的生物活性物質(zhì)如維生素及多種消化酶，可提高適口性，具有良好的應(yīng)用前景（劉壯壯等，2015）。酵母菌體及其代謝產(chǎn)物具有促生抗病功能（郭志英等，2015；黃亮等，2011；那日蘇等，2004）。本試驗研究混菌比例、水分、溫度和時間等關(guān)鍵因素對發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響，對其進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，并對發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分的變化進(jìn)行測定，以期能降低發(fā)酵飼料的生產(chǎn)成本，篩選出適宜乳酸菌和酵母菌復(fù)配發(fā)酵的最優(yōu)工藝，為實際生產(chǎn)提供理論支持。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1發(fā)酵基料玉米-豆粕型妊娠母豬配合飼料，購自山東泰安普瑞納飼料有限公司。

1.1.2發(fā)酵菌種及培養(yǎng)基乳酸桿菌（Lactic acid bacteria）：BLCC2-0038、BLCC2-0001、BLCC2-0111、BLCC2-0015和BLCC2-0112；酵母菌（Yeast）：BLCC4-0021、BLCC4-0038、BLCC4-0032、BLCC4-0037和BLCC4-0040。菌株均由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存。

乳酸桿菌發(fā)酵用MRS培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、檸檬酸銨0.2%、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.5%、硫酸錳0.02%、硫酸鎂0.05%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、酵母膏0.5%、吐溫-80 0.1%，pH 6.0。

酵母菌培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、酵母膏0.5%、蛋白胨1.0%、磷酸二氫鉀0.2%，pH自然。

1.2試驗方法

1.2.1種子液制備酵母菌種子液制備：取經(jīng)過兩次活化的斜面菌種一環(huán)約0.05 g于裝有50 mL酵母培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)15 h，待用。

乳酸桿菌種子液的制備：取經(jīng)過兩次活化的斜面菌種一環(huán)于裝有100 mL乳酸桿菌培養(yǎng)基的鹽水瓶中，于37℃靜止培養(yǎng)24 h。

1.2.2乳酸桿菌的篩選稱取一定量的基料按料水比1∶0.8（g/mL）配制好，裝袋量為100 g/袋，每個樣品設(shè)3個平行，分別按照2%接種量接入培養(yǎng)好的乳酸桿菌種子液，以不接種任何菌株的空白料為對照，壓實后于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行生料厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24、48 h和72 h取樣，測定pH值、活菌數(shù)和總酸含量。

1.2.3酵母菌的篩選稱取一定量的基料于500 mL三角瓶中，料水比為1∶0.8（g/mL），裝量50 g/瓶，每個樣品設(shè)3個平行，分別按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的酵母菌種子液，以不接種任何菌株的空白料為對照，均置于30℃培養(yǎng)箱進(jìn)行需氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24、48 h取樣，測定活菌數(shù)和粗蛋白質(zhì)含量。

1.2.4乳酸桿菌和酵母菌混合發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.4.1配合飼料混菌發(fā)酵菌種接種量組合試驗將2種菌種按照3個不同接種量進(jìn)行2因素3水平正交試驗，如表1所示。溫度設(shè)定為30℃，發(fā)酵時間為48 h，料水比為1∶0.8，測定發(fā)酵料pH值、乳酸桿菌和酵母菌活菌數(shù)和總酸含量，確定發(fā)酵配合飼料的菌種接種量最佳組合。

表1　混菌發(fā)酵接種量組合的正交試驗設(shè)計%

1.2.4.2混菌發(fā)酵配合飼料工藝優(yōu)化試驗（1）在確定最優(yōu)接種量組合的基礎(chǔ)上，將料水比分別設(shè)定為1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1，在30℃條件下進(jìn)行厭氧發(fā)酵72 h。分別在發(fā)酵24、48 h和72 h時取樣，測定發(fā)酵料pH、乳酸桿菌活菌數(shù)、酵母菌活菌數(shù)和總酸含量，考察物料不同水分含量對發(fā)酵結(jié)果的影響。

（2）在選定的最優(yōu)料水比基礎(chǔ)上，設(shè)置5個發(fā)酵溫度（25、28、32、37、42℃）進(jìn)行發(fā)酵，分別在發(fā)酵24、48、72 h時取樣，測定發(fā)酵料pH、乳酸桿菌活菌數(shù)、酵母菌活菌數(shù)和總酸含量，考察不同溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響。

（3）在選定的最優(yōu)料水比和發(fā)酵溫度條件下進(jìn)行發(fā)酵，分別在發(fā)酵24、48、72 h時取樣，測定發(fā)酵料pH、乳酸桿菌活菌數(shù)、酵母菌活菌數(shù)和總酸含量，以確定最優(yōu)的發(fā)酵時間。

1.2.5測定指標(biāo)及方法

1.2.5.1樣品pH測定取10 g樣品加入90 mL滅菌生理鹽水中，攪拌均勻后直接測定。

1.2.5.2酵母菌和乳酸桿菌數(shù)量的測定準(zhǔn)確稱取發(fā)酵飼料10.0 g至90 mL滅菌生理鹽水中，攪拌均勻后，用生理鹽水10倍遞增稀釋，采用平板菌落計數(shù)法測定發(fā)酵料中菌群數(shù)量。乳酸桿菌采用LBS培養(yǎng)基，酵母菌采用孟加拉紅培養(yǎng)基，分別于37、30℃培養(yǎng)48 h后，記錄菌落數(shù)，并換算成每克發(fā)酵料所含菌落數(shù)。

1.2.5.3粗蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法測定樣品中含氮量，即在催化劑作用下，用硫酸破壞有機(jī)物，使含氮物轉(zhuǎn)化成硫酸銨。加入強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，測出氮含量，乘以換算系數(shù)6.25，計算出粗蛋白質(zhì)含量。

1.2.5.4總酸含量的測定采用酸堿滴定法測定樣品中總酸含量。參照國標(biāo)GB/T 12456-2008，食品中總酸的測定，即根據(jù)酸堿中和原理，用堿液滴定試液中的酸，以酚酞為指示劑確定滴定終點(diǎn)，按堿液的消耗量計算食品中的總酸含量。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析試驗數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，LSD法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，“P＜0.05”表示差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1乳酸桿菌對發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響由表2可知，24 h和48 h時，BLCC2-0038發(fā)酵飼料的pH值均最低，顯著低于其余各菌株（P＜0.05），且活菌數(shù)均最高，顯著高于其余各菌株（P＜0.05）；且BLCC2-0038發(fā)酵妊娠母豬配合飼料在48 h時pH值達(dá)到最低，為3.88，活菌數(shù)維持在較高活菌數(shù)水平，為69.5×108cfu/g。24 h和48 h時BLCC2-0038總酸含量均最高，顯著高于其余各菌株（P＜0.05）。48 h時BLCC2-0038發(fā)酵妊娠母豬配合飼料總酸含量高達(dá)27.38 mg/g。綜合pH值、活菌數(shù)和總酸含量，以鼠李糖乳桿菌BLCC2-0038最適宜作為發(fā)酵妊娠母豬配合飼料的理想菌株。

表2　乳酸桿菌對發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響

2.2酵母菌對發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響由表3可知，24 h和48 h時，BLCC4-0021發(fā)酵飼料活菌數(shù)均最高，顯著高于其余各菌株（P＜0.05），在發(fā)酵48 h時活菌數(shù)為544.0×107cfu/g；24 h時BLCC4-0021粗蛋白質(zhì)含量最高，顯著高于對照和BLCC4-0040發(fā)酵組（P＜0.05），與BLCC4-0032、BLCC4-0037和BLCC4-0038發(fā)酵組差異不顯著（P＞0.05）。48 h時BLCC4-0021粗蛋白質(zhì)含量最高，高出對照11.32%（P＜0.05），顯著高于對照、BLCC4-0032和BLCC4-0040發(fā)酵組（P＜0.05），與BLCC4-0037和BLCC4-0038發(fā)酵組差異不顯著（P＞0.05）。綜合活菌數(shù)和粗蛋白質(zhì)含量，以BLCC4-0021產(chǎn)朊假絲酵母最適宜作為發(fā)酵妊娠母豬配合飼料的理想菌株。

表3　酵母菌對發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響

2.3乳酸桿菌和酵母菌混合發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1混菌發(fā)酵菌種的最佳組合由表4可知，總酸含量以試驗7組最高，顯著高于其余各試驗組（P＜0.05），其次是試驗4組；pH值以試驗4組和7組最低，顯著低于其余各試驗組（P＜0.05）；乳酸桿菌活菌數(shù)試驗2組、4組、7組和8組均顯著高于其余各組（P＜0.05），但該4組間差異不顯著（P＞0.05），其中以試驗7組最高；酵母菌活菌數(shù)方面試驗4組和7組顯著低于其余各組（P＜0.05），但各組間活菌數(shù)均在同一數(shù)量級。綜合各項指標(biāo)分析，混合菌種發(fā)酵的最佳菌種組合為：乳酸桿菌∶酵母菌=3%∶1%，在該組合下總酸產(chǎn)量達(dá)到最大值，為9.80 mg/g。

表4　混菌發(fā)酵各菌種接種量組合的正交試驗結(jié)果

2.3.2不同料水比對發(fā)酵結(jié)果的影響由表5可知，24 h時，pH值隨料水比增加而降低；乳酸桿菌活菌數(shù)在料水比為1∶0.2時最低，顯著低于其余各料水比一個數(shù)量級；酵母菌在料水比為1∶0.2時由于含水量太低，料太干不利于發(fā)酵，1∶0.4時活菌數(shù)最高，最適宜發(fā)酵，其次是料水比為1∶0.6，然后隨料水比增加活菌數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢；總酸含量在料水比為1∶0.8時最高，其次是料水比為1∶0.6和1∶1，均顯著高于其余兩個料水比組（P＜0.05）。結(jié)合考慮24 h pH值、乳酸桿菌、酵母菌活菌數(shù)和總酸含量優(yōu)先選擇料水比1∶0.6。

表5　料水比對混菌發(fā)酵結(jié)果的影響

48 h時，各料水比條件下pH值較24 h均有所下降，且隨料水比升高呈現(xiàn)下降趨勢；乳酸桿菌活菌數(shù)在料水比為1∶0.6、1∶0.8和1∶1時顯著高于其余兩個料水比組（P＜0.05）；酵母菌活菌數(shù)以料水比為1∶0.4時最高，其次是料水比1∶0.6，兩者間差異不顯著（P＞0.05），但均顯著高于料水比1∶0.8和1∶1（P＜0.05）；總酸含量隨料水比增加呈現(xiàn)遞增趨勢，以料水比為1∶1時最高。結(jié)合考慮48 h pH值、乳酸桿菌、酵母菌活菌數(shù)和總酸含量優(yōu)先選擇料水比1∶0.6。

72 h時酵母菌活菌數(shù)均低于106cfu/g，說明此時酵母菌不能夠生長。料水比越高，乳酸桿菌的生長繁殖速度越快。但在實際生產(chǎn)中，隨著料水比含量增大，其操作成本越高，主要體現(xiàn)在防止雜菌污染、收獲成品等方面。

綜合考慮24、48 h和72 h pH值、乳酸桿菌活菌數(shù)、酵母菌活菌數(shù)、總酸含量及操作成本，料水比1∶0.6為最佳。

2.3.3不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響由表6可知，24 h時，pH值隨發(fā)酵溫度的升高呈降低趨勢；乳酸桿菌活菌數(shù)較適發(fā)酵溫度為28、32℃和37℃，其中32℃和37℃時活菌數(shù)最高，顯著高于其余各溫度（P＜0.05）；酵母菌活菌數(shù)以28℃時最高，其次是25℃和32℃，均顯著高于37℃和42℃時（P＜0.05）；總酸含量以32℃和37℃時最高，其次是28℃和42℃，均顯著高于25℃（P＜0.05）。綜合考慮，24 h以溫度32℃為最適發(fā)酵溫度，其次是28℃。

表6　發(fā)酵溫度對混菌發(fā)酵結(jié)果的影響

48 h時，pH值隨發(fā)酵溫度的升高呈降低趨勢；乳酸桿菌活菌數(shù)以28℃和32℃時最高，顯著高于其余各溫度（P＜0.05）；總酸含量以32℃最高，其次是37℃和28℃，均顯著高于25℃和42℃（P＜0.05）；酵母菌活菌數(shù)以25℃和28℃較高，顯著高于32℃（P＜0.05），37℃和42℃時酵母菌活菌數(shù)顯著降低，降至105cfu/g以下，不適宜發(fā)酵。綜合考慮，發(fā)酵48 h時以溫度28℃為最適發(fā)酵溫度。

72 h時酵母菌活菌數(shù)在各溫度條件下均在106cfu/g的以下，說明發(fā)酵至72 h時乳酸桿菌和酵母菌不適宜復(fù)配發(fā)酵。

綜合考慮24 h和48 h pH值、乳酸桿菌活菌數(shù)、酵母菌活菌數(shù)和總酸含量，以28℃為最優(yōu)發(fā)酵溫度。

2.3.4優(yōu)化條件下發(fā)酵時間對發(fā)酵結(jié)果的影響在最優(yōu)的物料含水量和發(fā)酵溫度下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時間對發(fā)酵結(jié)果的影響如表7所示。由表7可知，發(fā)酵72 h總酸含量最高，但此時酵母菌活菌數(shù)顯著降低。48 h時乳酸桿菌活菌數(shù)和總酸含量顯著高于24 h，且此時酵母菌活菌數(shù)和24 h相比在相同數(shù)量級。因此選擇48 h為乳酸桿菌BLCC2-0038和酵母菌BLCC4-0021復(fù)合發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵時間。

表7　發(fā)酵時間對混菌發(fā)酵結(jié)果的影響

3　討論與結(jié)論

益生菌發(fā)酵飼料中含有大量的有益微生物菌群（乳酸菌和酵母菌等），其在豬生產(chǎn)上應(yīng)用可以起到減少腹瀉及改善腸道健康的功效（林標(biāo)聲等，2013）。益生菌中的乳酸菌可以有效促進(jìn)畜禽腸道內(nèi)有益菌的增殖，抑制有害菌。酵母菌體含有豐富蛋白質(zhì)、脂肪、多種酶和維生素等營養(yǎng)成分，具有提高日增重和飼料轉(zhuǎn)化率的作用（李曉暉，2002）。此外，微生物的代謝產(chǎn)物還可以降低飼料中毒素含量，產(chǎn)生促生長因子。

本試驗對適宜妊娠母豬配合飼料發(fā)酵的乳桿菌和酵母菌進(jìn)行了篩選，并對兩者復(fù)配發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：適宜妊娠母豬配合飼料發(fā)酵的乳酸桿菌為BLCC2-0038，在發(fā)酵48 h時pH值達(dá)到3.88，活菌數(shù)為69.5×108cfu/g，總酸含量高達(dá)27.38 mg/g；酵母菌為BLCC4-0021，在發(fā)酵48 h時活菌數(shù)為544.0×107cfu/g，粗蛋白質(zhì)含量高出對照11.32%；兩者復(fù)配發(fā)酵最佳工藝為接種比例BLCC2-0038∶BLCC4-0021=1.5%∶0.5%、料水比1∶0.6、溫度28℃、發(fā)酵時間48 h，在此條件下乳酸桿菌活菌數(shù)為109.0×108cfu/g，酵母菌活菌數(shù)為46×106cfu/g和總酸含量為14.71 mg/g。

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By determination of pH，viable count of bacteria，crude protein and total acid content of fermented feed，the Lactobacillus rhamnosus BLCC2-0038 and Candida utilis BLCC4-0021 was screened for compound feed of pregnant sows，and the fermentation condition of double-strains were researched.Results showed that at the condition of L.rhamnosus BLCC2-0038 single strain fermentation for 48 h，the feed pH reduced to 3.88，the viable count of bacteria reached to 69.5× 108cfu/g，and the total acid content was 27.38 mg/g.At the condition of Candida utilis BLCC4-0021 single strain fermentation for 48 h，the viable count of bacteria reached to 544.0×107cfu/g，the crude protein content was 11.32%higher than the control group.The best mixed bacteria combination was L.rhamnosus BLCC2-0038∶Candida utilis BLCC4-0021=1.5%∶0.5%. The optimum technology conditions of fermenting compound feed with the best bacteria combination were as follows：feedwater ratio of 1∶0.6，the fermentation temperature of 28℃，fermentation time of 48 h，under this condition，the L.rhamnosus viable count was 109.0×108cfu/g，the yeast viable count was 46×106cfu/g，and the total acid content was 14.71 mg/g.

pregnant sow；compound feed；fermentation；Lactobacillus rhamnosus；Candida utilis；viable count of bacteria；crude protein；total acid content

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161606

S816.6

A

1004-3314（2016）16-0023-05

泰安市科技發(fā)展計劃（201540701）