李葵花,李璐,嚴(yán)鵬,佟曉波,謝利德

(1.承德醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系,河北承德　067000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科,河北保定　071000)

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不同濃度尿酸對體外紅細(xì)胞流變學(xué)指標(biāo)的影響

李葵花,李璐,嚴(yán)鵬,佟曉波,謝利德

(1.承德醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系,河北承德067000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科,河北保定071000)

探討了不同濃度尿酸水平對體外紅細(xì)胞流變學(xué)指標(biāo)的影響.300、600、1 200 μmol/L的尿酸對體外紅細(xì)胞作用2 h后,測量紅細(xì)胞的流變學(xué)指標(biāo),并應(yīng)用SDS-PAGE對紅細(xì)胞膜蛋白成分進(jìn)行分析.隨尿酸濃度的增加,體外紅細(xì)胞的積分變形指數(shù)、松弛指數(shù)降低,紅細(xì)胞的破碎率升高.與對照組相比,紅細(xì)胞錨蛋白及帶3蛋白含量減少,1 200 μmol/L尿酸組的相關(guān)指標(biāo)具有明顯差別.提示高濃度尿酸可對紅細(xì)胞膜蛋白產(chǎn)生明顯的破壞作用,是引起紅細(xì)胞流變學(xué)特性改變的獨(dú)立因素.

尿酸；紅細(xì)胞；血液流變學(xué)；膜蛋白

隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改善,特別是富含蛋白質(zhì)和嘌呤食物攝入的增加,高尿酸血癥(Hyperuricemia,HUA)的發(fā)病率逐年上升,日益受到研究者的關(guān)注[1].大多數(shù)研究者認(rèn)為高尿酸血癥是很多疾病的危險因素,尿酸鹽沉積于腎臟、關(guān)節(jié)等部位容易引起尿酸腎結(jié)石和痛風(fēng),同時血尿酸水平升高使紅細(xì)胞聚集性增強(qiáng)、變形能力降低,需及時糾正高尿酸血癥[2]，但也有文獻(xiàn)報道血尿酸水平對紅細(xì)胞參數(shù)不存在影響,不需治療[3],由于HUA患者紅細(xì)胞流變參數(shù)的改變迥異,與其常伴發(fā)高血壓、高血脂、糖尿病、心腦血管等疾病有關(guān)[4].當(dāng)排除其他疾病因素后,高尿酸血癥患者紅細(xì)胞流變學(xué)特性是否發(fā)生變化對臨床高尿酸血癥的處理存在一定的指導(dǎo)作用.因此本文通過不同濃度尿酸作用于體外紅細(xì)胞,研究尿酸對紅細(xì)胞流變特性及膜蛋白的影響,為臨床高尿酸血癥的處理提供參考依據(jù).

1　材料和方法

1.1主要儀器和試劑

LBY-BX紅細(xì)胞變形儀(北京普利生儀器有限公司)；UNICO UV-2000型分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)；全自動生化分析儀(日立7180)；SDS-PAGE電泳儀Protein ⅡXi Cell(美國BioRAD公司)；尿酸(西亞試劑研究中心)；聚丙烯吡咯烷酮(北京化學(xué)試劑公司)；尿酸試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)；蛋白定量試劑盒(北京索萊寶試劑公司).

1.2尿酸體外刺激紅細(xì)胞

取適量尿酸(uric acid,UA)粉劑置于等滲透壓的PBS溶液中,37 ℃水浴助溶至溶液清澈透明.濾器除去可能存在的尿酸鹽晶粒,偏振顯微鏡下觀察無尿酸晶體.酶法測定尿酸濃度,用等滲PBS調(diào)節(jié)尿酸溶液濃度.

健康雄性SD大鼠10只,購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心.取大鼠肝素抗凝血,離心去除血漿和白細(xì)胞,PBS多次洗滌后獲得洗滌紅細(xì)胞.臨床上把男性高于420 μmol/L、女性高于360 μmol/L尿酸水平稱為高尿酸血癥,在急性情況下尿酸可達(dá)1 200 μmol/L以上[5].尿酸溶液的濃度調(diào)節(jié)為300、600、1 200 μmol/L分別模擬正常、高尿酸、極高尿酸水平.將洗滌紅細(xì)胞與不同濃度的尿酸溶液等體積混勻,37 ℃孵育2 h后測量紅細(xì)胞流變學(xué)相應(yīng)指標(biāo).對照組采用紅細(xì)胞與等滲透壓的PBS溶液混合,處理方法同尿酸組.

1.3紅細(xì)胞流變學(xué)參數(shù)的測定

玻片法觀察紅細(xì)胞形態(tài),隨機(jī)取100個紅細(xì)胞,Photoshop圖像處理軟件測量紅細(xì)胞直徑.取紅細(xì)胞懸液,用LBY-BX紅細(xì)胞變形儀檢測反映紅細(xì)胞各切變率變形能力總體效應(yīng)的積分變形指數(shù)(integrated deformation index,IDI)、體現(xiàn)紅細(xì)胞松弛特性的松弛指數(shù)(relaxation index,RI)、反映紅細(xì)胞膜流動性的小變形指數(shù)DI(d)和表述紅細(xì)胞在血液流動中取向能力的取向指數(shù)DI(or),具體操作遵照儀器使用說明書.取30 μL紅細(xì)胞懸液分別加入到3 mL不同滲透壓的PBS溶液中混勻,靜置1 h后離心取上清液以540 nm的波長比色,根據(jù)各管上清液的透光率,計算細(xì)胞破碎率(haemolysis rate,Hr),Hr代表紅細(xì)胞對不同滲透壓溶液的抵抗能力[6].

1.4紅細(xì)胞膜蛋白電泳

低滲破膜法提取紅細(xì)胞膜[7],應(yīng)用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度.配置聚丙烯酰胺體積分?jǐn)?shù)為7.5%的分離膠,SDS-PAGE分離紅細(xì)胞膜蛋白.電泳完畢,將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)R250染色液中染色,著色后取出.室溫下置于搖床上脫色,期間更換脫色液,直至本底洗脫干凈.掃描凝膠,分析膜蛋白成分,以各帶面積灰度值占總條帶灰度值的相對百分比表示.

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1尿酸對紅細(xì)胞形態(tài)的影響

圖1所示,正常對照組紅細(xì)胞的平均直徑為(7.11±0.42) μm,1 200 μmol/L尿酸作用后紅細(xì)胞直徑為(7.03±0.56) μm,與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，尿酸作用前后細(xì)胞形態(tài)無顯著變化.

a.對照組；b.1 200 μmol/L尿酸組.圖1　紅細(xì)胞形態(tài)圖像Fig.1　Pictures of erythrocyte morphology

2.2尿酸對紅細(xì)胞流變參數(shù)的影響

本實驗發(fā)現(xiàn)隨著尿酸濃度的升高,紅細(xì)胞的積分變形指數(shù)IDI、松弛指數(shù)RI、小變形指數(shù)DI(d)、取向指數(shù)DI(or)均有降低趨勢.在體外的尿酸濃度為600 μmol/L以上時,紅細(xì)胞的IDI和RI的降低有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05).紅細(xì)胞處于等滲透壓的環(huán)境中時,破碎率Hr為0,保持了良好的完整性.隨著外環(huán)境滲透壓的降低,細(xì)胞的Hr逐漸升高,但存在一個升勢較為平緩的“平臺期”.隨后,細(xì)胞的Hr迅速升高,最后細(xì)胞全部破碎.本實驗發(fā)現(xiàn)在145 mmol/L滲透壓下各組細(xì)胞的Hr差異較大,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)1 200 μmol/L濃度的尿酸使紅細(xì)胞的Hr與對照組相比顯著升高(P<0.05).但尿酸對紅細(xì)胞的DI(d)和DI(or)的影響無統(tǒng)計學(xué)差異(表1).

表1　尿酸對紅細(xì)胞流變參數(shù)的影響

與對照組相比*P<0.05.

2.3尿酸作用前后紅細(xì)胞膜蛋白變化

根據(jù)Marker分子質(zhì)量與大鼠紅細(xì)胞蛋白分子質(zhì)量對比分析SDS-PAGE電泳圖譜中的條帶,證實本實驗主要分離獲得血影蛋白(Spectrin)、錨蛋白(Ankyrin)、帶3蛋白(Band 3)、帶4.2蛋白(Band 4.2)、肌動蛋白(Actin),共5種蛋白,如圖2所示.其中各組大鼠紅細(xì)胞膜蛋白中血影蛋白和帶3 蛋白含量較多,是紅細(xì)胞膜蛋白的主要組分.與正常對照組相比,各尿酸組血影蛋白含量有一定程度的增加,錨蛋白和帶3蛋白含量均有一定程度減少,而600 μmol/L以上的尿酸濃度組的變化有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05).各組大鼠紅細(xì)胞膜帶4.2蛋白和肌動蛋白含量均無統(tǒng)計學(xué)差異(表2).

1-4.尿酸濃度分別為0、300、600、1 200 μmol/L.圖2　大鼠紅細(xì)胞SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2　SDS-PAGE electrophoresis of rat erythrocytes

組 別w(Spectrin)/%w(Ankyrin)/%w(Band3)/%w(Band4.2)/%w(Actin)/%對照組35.06±3.268.10±1.3734.83±2.1615.77±0.635.89±1.06300μmol/L尿酸組36.34±3.326.79±1.3433.55±3.0515.16±0.426.15±0.47600μmol/L尿酸組41.10±2.58*2.67±0.89#31.68±3.5116.96±0.815.89±0.581200μmol/L尿酸組44.49±2.72#2.40±0.42#28.98±3.87*16.77±0.666.67±0.39

與對照組相比*P<0.05,#P<0.01.

3　討論

本實驗發(fā)現(xiàn)隨著尿酸濃度的升高,紅細(xì)胞的流變參數(shù)逐漸發(fā)生變化.在體外的尿酸濃度為600 μmol/L以上時,紅細(xì)胞流變學(xué)的IDI、RI及Hr發(fā)生顯著變化,說明尿酸作用后紅細(xì)胞的變形能力和松弛能力降低,在低滲透壓環(huán)境中Hr增加,容易發(fā)生溶血事件.紅細(xì)胞不含內(nèi)膜和胞核,其流變學(xué)參數(shù)變化的原因源自本身的膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架支撐.

本實驗結(jié)果表明體外尿酸作用引起紅細(xì)胞膜錨蛋白含量的下降.錨蛋白是膜骨架蛋白的一種,主要起錨定作用,它含有β-血影蛋白、帶4.2 蛋白和帶3 蛋白的結(jié)合位點,可將膜整合蛋白穩(wěn)定連接到細(xì)胞膜內(nèi)表面的骨架蛋白網(wǎng)絡(luò),是膜骨架與脂質(zhì)雙分子層連接的重要紐帶.錨蛋白缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠的紅細(xì)胞,由于錨蛋白的缺乏可造成紅細(xì)胞膜脂以脂質(zhì)小泡的形式脫落,使紅細(xì)胞的變形性下降,與本實驗的結(jié)果基本一致[8].尿酸引起紅細(xì)胞錨蛋白水平的下調(diào)將影響錨蛋白與收縮蛋白的作用,從而破壞以錨蛋白為中介的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的形成,致使紅細(xì)胞變形性和松弛性下降并且容易發(fā)生破裂溶血.

有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激增強(qiáng),超出自身的抗氧化能力,體內(nèi)紅細(xì)胞膜受自由基攻擊更容易發(fā)生氧化損傷,而紅細(xì)胞帶3蛋白是主要的靶點,可造成帶3蛋白構(gòu)象的改變[9-10].同時脂質(zhì)的過氧化也將影響紅細(xì)胞膜的通透性.本研究亦發(fā)現(xiàn)尿酸作用紅細(xì)胞后其帶3蛋白的相對水平和條帶位置下降,這是由于尿酸具有較強(qiáng)的氧化作用[11],并且體外尿酸作用于紅細(xì)胞時缺乏抗氧化酶的調(diào)和作用,帶3蛋白受到尿酸的氧化應(yīng)激損傷,蛋白易發(fā)生交聯(lián)、降解.帶3蛋白胞漿段具有膜骨架蛋白、血紅蛋白、糖酵解酶、過氧化氫酶、酪氨酸磷酸化酶等的結(jié)合位點,起著將膜與膜骨架、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相聯(lián)系的重要作用,從而調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的變形能力、糖酵解速率、攜氧和免疫清除功能[12].力竭運(yùn)動引起大鼠紅細(xì)胞膜帶3蛋白含量的減少,大鼠紅細(xì)胞變形能力降低,與本實驗的結(jié)論一致[13-14].

綜上所述：體外尿酸作用于紅細(xì)胞后,由于紅細(xì)胞膜蛋白中錨蛋白和帶3蛋白含量的下調(diào),可使紅細(xì)胞膜的變形性、松弛性和滲透脆性明顯降低,提示高尿酸血癥患者可能產(chǎn)生紅細(xì)胞流變特性的改變,從而影響正常的血液循環(huán),需要及時糾正.但尿酸作用是否引起錨蛋白和帶3蛋白在紅細(xì)胞中分布的變化有待于進(jìn)一步研究.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Effects of different concentrations of uric acid on erythrocyte hemorheology in vitro

LI Kuihua1,LI Lu2,YAN Peng1,TONG Xiaobo1,XIE Lide1

(1.Department of Biomedical Engineering,Chengde Medical College,Chengde 067000,China；2.Department of Anesthesiology,Affiliated Hospital of Hebei University,Baoding 071000,China)

The effects of different concentrations of uric acid on hemorheology were investigated in vitro.The erythrocytes were suspended in 300,600,1 200 μmol/L uric acid for 2 h and the hemorheological parameters were measured.The membrane protein composition was also analyzed by SDS-PAGE.We found that the integrated deformation index and relax index were reduced in a dose-dependent manner.The hemolysis rate increased.As compared with the control group,the content of ankyrin and band 3 proteins showed a decrease trend.These results were statistically significant in the 1 200 μmol/L group.The results suggest that high concentrations of uric acid can have significant damaging effects on erythrocyte membrane proteins,which is an independent factor affecting the hemorheological properties of erythrocytes.

uric acid;erythrocyte;hemorheology;membrane proteins

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.02.013

2015-04-18

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目(QN20131033)；承德醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)一般項目(201313)；承德醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研立項(201439)

李葵花(1978—),女,河北保定人,承德醫(yī)學(xué)院副教授,主要從事血液流變學(xué)研究. E-mail:148117940@qq.com

R35；Q51

A

1000-1565(2016)02-0184-05