郝志敏 向志 欒超 楊永紅 胡煜 陳浩 陳敏 王寶璽

·論著·

CD69+T細(xì)胞在銀屑病皮損中的表達(dá)及其臨床意義

郝志敏 向志 欒超 楊永紅 胡煜 陳浩 陳敏 王寶璽

目的 探討銀屑病患者皮膚CD69+T細(xì)胞的表達(dá)及其與疾病活動性的關(guān)系。方法 免疫組化檢測31例銀屑病患者皮損和非皮損中CD69+T細(xì)胞在皮膚中的表達(dá)，與6例健康人進(jìn)行對照。結(jié)果CD69+T細(xì)胞主要分布于皮膚真皮。31例銀屑病患者皮損和非皮損的真皮中，CD69+T細(xì)胞分別為（35.16±12.67）%和（8.70±3.29）%，皮損明顯高于非皮損（t=12.5，P＜0.01）。6例健康人對照皮膚中CD69+T細(xì)胞（8.71±2.55）%，明顯低于銀屑病皮損（t=5.03，P＜0.01），與非皮損相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.05，P＞0.05）。20例急性期與11例穩(wěn)定期銀屑病患者皮損中CD69+T細(xì)胞分別為（40.89±10.31）%和（24.46±9.49）%，急性期明顯高于穩(wěn)定期（t=0.36，P＜0.01）。結(jié)論 銀屑病患者皮損中CD69+T細(xì)胞表達(dá)增高，與疾病的活動性有關(guān)。

銀屑??；CD69陽性T淋巴細(xì)胞；腫瘤壞死因子α；免疫組織化學(xué)

CD69是一種誘導(dǎo)激活分子，由活化淋巴細(xì)胞表達(dá)，在T細(xì)胞活化、增殖和分化以及細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子（TNF）α的分泌中起作用。研究發(fā)現(xiàn)，在正常人部分外周淋巴組織的T細(xì)胞及B細(xì)胞中，可檢測到CD69，在一些慢性病中，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性病毒性肝炎，CD69持續(xù)表達(dá)在CD8+T細(xì)胞上，造成組織損傷［1］。關(guān)于CD69在銀屑病皮損中的表達(dá)及其作用研究甚少。我們通過免疫組化技術(shù)檢測銀屑病患者皮損、非皮損中CD69的表達(dá)，分析其與銀屑病皮損嚴(yán)重程度的關(guān)系及臨床意義。

作者單位：210042 南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院 江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 皮膚科（郝志敏、向志、欒超、胡煜、陳敏、王寶璽），中心實(shí)驗(yàn)室（楊永紅），病理科（陳浩）

1 對象與方法

1.1 對象：31例斑塊狀銀屑病患者來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院門診，經(jīng)臨床或組織病理學(xué)診斷為尋常性銀屑病，男20例、女11例，年齡19～52（39.4±10.3）歲，病程18 d至20年，銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評分4～36（16.59±9.58），其中20例急性期（舊皮疹擴(kuò)大或新皮疹出現(xiàn)、炎癥明顯、周圍紅暈，有同形反應(yīng)），11例穩(wěn)定期（無新皮疹出現(xiàn)，舊皮疹未消退）。皮膚鉆孔采集同一患者皮損和非皮損組織（均取自背部）。6例健康對照皮膚來源于我院外科整形手術(shù)多余的正常皮膚（取自背部），其中男5例，女1例，年齡19～46（32.2±8.6）歲?；颊吆徒】祵φ战M在性別和年齡上比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 試劑：鼠抗人CD69單克隆抗體均產(chǎn)自英國Abcam公司，按1∶25稀釋。磷酸鹽緩沖液由美國Gibco公司生產(chǎn)。枸櫞酸抗原修復(fù)緩沖液、內(nèi)源性過氧化氫酶抑制劑、非免疫動物血清（羊）、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗羊鼠IgG、二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒、蘇木素和中性樹膠均產(chǎn)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法：

1.3.1 免疫組化：常規(guī)鉆孔取軀干皮損處直徑5mm皮膚標(biāo)本，經(jīng)甲醛固定、脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片厚5 μm薄片，免疫組化染色按照染色試劑盒操作說明進(jìn)行，所有切片均在同一質(zhì)控條件下進(jìn)行，設(shè)陽性和陰性對照。染色為二氨基聯(lián)苯胺染色，陽性為棕黃色。

1.3.2 結(jié)果判定：CD69陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜，結(jié)果為棕黃色顆粒。計算真皮中5個顯微鏡高倍視野（×200）下CD69陽性表達(dá)的T細(xì)胞平均百分比。

1.4 數(shù)據(jù)處理：采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

31例銀屑病患者皮損和非皮損、6例健康對照皮膚中均可見表達(dá)CD69+T細(xì)胞。銀屑病患者皮損中CD69+T細(xì)胞分布廣泛，包括表皮和真皮，主要分布在真皮淺層，其中急性期患者皮損真皮中CD69+T細(xì)胞較穩(wěn)定期多。21例患者（16例急性期，5例穩(wěn)定期）皮損表皮內(nèi)可見陽性細(xì)胞，數(shù)量少（未統(tǒng)計）。非皮損中CD69+T細(xì)胞主要分布在真皮內(nèi)血管周圍，5例患者（3例急性期，2例穩(wěn)定期）表皮內(nèi)可見陽性細(xì)胞，數(shù)量極少（未統(tǒng)計）。6例健康對照皮膚中CD69+T細(xì)胞少量分布于真皮淺層，1例表皮內(nèi)可見陽性細(xì)胞（圖1）。

31例銀屑病患者皮損和非皮損真皮中CD69+T細(xì)胞分別為（35.16± 12.67）%和（8.70± 3.29）%，皮損明顯高于非皮損（t=12.5，P＜0.01）。6例健康對照皮膚真皮中CD69+T細(xì)胞（8.71±2.55）%，明顯低于銀屑病患者皮損（t=5.03，P＜0.01），與非皮損相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.05，P＞0.05）。20例急性期與11例穩(wěn)定期銀屑病患者皮損真皮中，CD69+T細(xì)胞分別為（40.89±10.31）%和（24.46±9.49）%，急性期明顯高于穩(wěn)定期（t=0.36，P＜0.01）。銀屑病患者皮損及非皮損真皮中，CD69+T的表達(dá)與PASI值不相關(guān)（分別為r=0.27，P＞0.05；r=0.20，P ＞0.05）。

3 討論

CD69是Ⅱ型膜蛋白，有高糖基化的亞基組成的二聚體。Caruso等［2］研究發(fā)現(xiàn)，CD69被細(xì)菌超抗原快速誘導(dǎo)，T細(xì)胞受到刺激后快速表達(dá)CD69，若無持續(xù)刺激，其在6～8 d后逐漸下降。表明CD69在激活的淋巴細(xì)胞表達(dá)較早，且與細(xì)胞激活同步。有研究表明，通過測定CD69的表達(dá)可以了解T細(xì)胞對各種刺激原的免疫反應(yīng)功能［3］。Gordon 等［4］用阿法賽特每周7.5 mg治療銀屑病12周后，發(fā)現(xiàn)皮損中活化T細(xì)胞（表達(dá)CD69和CD3）明顯減少，且T細(xì)胞的減少與PASI評分的改善相關(guān)。在Ferenczi等［5］研究中，銀屑病皮損表皮中CD69+T細(xì)胞表達(dá)百分比明顯高于真皮，非皮損以及正常對照中未見CD69+T細(xì)胞，但未發(fā)現(xiàn)患者外周血中CD69表達(dá)增高。朱可建等［6］研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者外周血中CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD69的水平明顯高于健康人，且進(jìn)行期明顯高于消退期，與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

研究證實(shí)，同一免疫因子在皮膚真皮和表皮中可能發(fā)揮不同的作用。本研究中，CD69+T細(xì)胞在皮膚中的表達(dá)主要分布于真皮，與Ferenczi等［5］研究結(jié)果不同，分析Ferenczi等應(yīng)用流式細(xì)胞法分別測量表皮與真皮內(nèi)CD69+T細(xì)胞，而本研究應(yīng)用免疫組化法，故可能造成結(jié)果的差異。有意義的是，本研究發(fā)現(xiàn)，皮損真皮中CD69+T細(xì)胞百分比較非皮損和正常對照組明顯增高，但皮損真皮中，CD69+T細(xì)胞百分比與PASI值不相關(guān)。Gordon等［4］研究的是整個皮膚中CD69+T細(xì)胞的表達(dá)，而且入組的患者病情嚴(yán)重，PASI值高，本研究分析的是真皮中CD69+T細(xì)胞的表達(dá)與PASI的關(guān)系，且入選的患者PASI評分差異較大（4～36）。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，皮損真皮中CD69+T細(xì)胞的表達(dá)反映病情活動性（即患者是否處于急性期），與Caruso等［2］的觀點(diǎn)一致。至于為何會出現(xiàn)病情活動性與PASI評分不一致，分析PASI評分由紅斑、脫屑、浸潤和面積因素決定，且皮損受累面積對PASI評分影響十分顯著，故高PASI評分并不代表該患者處于急性期。

圖1 銀屑病皮損連續(xù)切片染色結(jié)果：表皮和真皮均有CD69+T細(xì)胞，可見棕黃色顆粒（免疫組化×200）。皮損中（1A，1B）CD69+T細(xì)胞分布廣泛，包括表皮和真皮淺深層，主要分布于真皮淺層。其中急性期（1A）皮損真皮中CD69+T細(xì)胞百分比較穩(wěn)定期（1B）高。非皮損（1C）中CD69+T細(xì)胞主要分布在真皮淺層和血管周圍。正常對照（1D）皮損中CD69+T細(xì)胞少量分布于真皮淺層

隨著對CD69的免疫調(diào)控作用認(rèn)識的深入，有研究發(fā)現(xiàn)，CD69的缺失導(dǎo)致免疫反應(yīng)的增強(qiáng)［7-8］。CD69對免疫反應(yīng)的限制主要由于：①CD69誘導(dǎo)活化后的T淋巴細(xì)胞凋亡；②在抗原提呈過程中，部分活化信號可能同時誘導(dǎo)CD69表達(dá)，造成一種無功能免疫狀態(tài)（這是CD69+T細(xì)胞在慢性炎性反應(yīng)中的特點(diǎn)）。確信的是，這些無活力的淋巴細(xì)胞與某些尚未定義明確的調(diào)節(jié)T細(xì)胞相符。它們通過產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）β或其他免疫因子，對淋巴細(xì)胞起到監(jiān)督作用，調(diào)節(jié)局部或系統(tǒng)免疫；③CD69可能參與Th1/Th2細(xì)胞分化比例的調(diào)節(jié)［9］，這種免疫調(diào)控在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［10］的病程慢性化中起到一定作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)一種特殊的CD69+T細(xì)胞亞群，為CD69和CD103共表達(dá)的T細(xì)胞，具有特殊功能。在銀屑病皮損中雖然數(shù)量極少，但在皮損消退后能停留在外周皮膚組織中［11-12］。Torres-Alvarez等［1］應(yīng)用甲氨蝶呤（12.5 mg/周）治療銀屑病，發(fā)現(xiàn)皮損消退后，表達(dá)CD69的CD8+T細(xì)胞在皮損中持續(xù)存在。淋巴細(xì)胞外移需要磷酸鞘氨醇受體1（S1P1）、干擾素α/β誘導(dǎo)CD69在細(xì)胞表面表達(dá)，CD69抑制S1P1化學(xué)作用，導(dǎo)致S1P1下調(diào)，從而使T淋巴細(xì)胞定位于局部組織［13］。以上研究提示，CD69+T細(xì)胞可能參與銀屑病皮損的復(fù)發(fā)機(jī)制。

本研究的不足之處：由于收集的健康對照皮膚多來自包皮切除術(shù)的包皮皮膚，在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)由于包皮色素細(xì)胞較多，影響了CD69+T細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計，因此，沒有把這部分樣本納入，導(dǎo)致對照組樣本較少。此外，不同于外周血樣本，銀屑病患者皮膚的樣本獲得非常困難，尤其是非皮損皮膚。

綜上所述，CD69+T細(xì)胞與銀屑病的活動性和復(fù)發(fā)均有關(guān)，但其在病程不同階段的表達(dá)以及具體功能、活化機(jī)制以及調(diào)節(jié)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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Expression of CD69+T lymphocytes in psoriatic lesions and its clinical significance

Hao Zhimin*,Xiang Zhi,Luan Chao,Yang Yonghong,Hu Yu,Chen Hao,Chen Min,Wang Baoxi.*Department of Dermatology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo measure the expression of CD69+T lymphocytes in skin lesions of patients with psoriasis,and to explore its relationship with disease activity.MethodsLesional and non-lesional skin samples were collected from 31 patients with psoriasis,and normal skin samples obtained from 6 healthy individuals served as controls.Immunohistochemical staining was performed to measure the expression of CD69+T lymphocytes in these skin samples.ResultsCD69+T lymphocytes were mainly distributed in the dermis.The percentage of CD69+T lymphocytes was significantly higher in lesional skin than in non-lesional skin（35.16% ±12.67%vs.8.70% ±3.29%,t=12.5,P＜0.01）,higher in lesional skin from 20 patients with acute psoriasis than in that from 11 patients with stable psoriasis（40.89% ±10.31%vs.24.46% ±9.49%,t=0.36,P＜ 0.01）,but significantly lower in normal control skin than in lesional skin （8.71% ± 2.55%vs.35.16% ±12.67%,t=5.03,P＜0.01）,and insignificantly different between normal control skin and nonlesional skin （t=0.05,P＞ 0.05）.ConclusionThe expression of CD69+T lymphocytes is markedly increased in psoriatic lesions,which may be associated with disease activity.

Psoriasis;CD69-positive T-lymphocytes;Tumor necrosis factor-alpha;Immunohistochemistry

s:Chen Min,Email:drchenmin@126.com;Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org

2015-04-27）

衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201002016）

Fund program:Research Special Fund for Public Welfare Industry of Health （201002016）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.03.002

陳敏，Email:drchenmin@126.com；王寶璽：Email:wangbx@ncstdlc.org