付丹丹 胡華 孫敏 李敏 田中偉

453100 河南衛(wèi)輝，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚性病科

表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制白細(xì)胞介素17誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和凋亡

付丹丹 胡華 孫敏 李敏 田中偉

453100 河南衛(wèi)輝，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚性病科

目的探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對白細(xì)胞介素17（IL?17）誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法實驗分空白對照組、IL?17組、IL?17+EGCG組、IL?17+SP600125組和IL?17+EGCG+茴香霉素組。CCK?8試劑盒檢測細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；ELISA試劑盒檢測IL?6、IL?23和IL?8的表達(dá)；Western印跡檢測JNK和P?JNK的表達(dá)。結(jié)果IL?17促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，且增殖率與IL?17濃度有關(guān)，90 μg/L IL?17組的細(xì)胞增殖率最高（P＜ 0.05）。60 μmol/L EGCG顯著抑制90 μg/L IL?17誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖（P＜ 0.05），促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P＜ 0.05），降低IL?6、IL?23和 IL?8的表達(dá)（P＜ 0.05）。與IL?17組相比，IL?17+EGCG組、IL?17+SP600125組的P?JNK表達(dá)顯著下調(diào)（P＜ 0.05），細(xì)胞增殖率降低（P＜ 0.05），IL?6、IL?23和 IL?8的表達(dá)減少（P＜0.05）；與IL?17+EGCG組相比，IL?17+EGCG+茴香霉素組的P?JNK表達(dá)顯著上調(diào)（P＜ 0.05），細(xì)胞增殖率和IL?6、IL?23、IL?8的表達(dá)均明顯上升（P＜ 0.05）。結(jié)論EGCG對IL?17誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖凋亡、炎癥反應(yīng)等損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與抑制JNK信號通路有關(guān)。

角蛋白細(xì)胞；兒茶素；白細(xì)胞介素17；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；表沒食子兒茶素沒食子酸酯

角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）具有廣泛的生物學(xué)特性，是參與炎癥反應(yīng)和皮膚免疫的重要細(xì)胞［1?2］。白細(xì)胞介素17（IL?17）是Th17細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子，能夠促使角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)多種生物活性成分，并參與皮炎的病理過程。HaCaT細(xì)胞具有和正常角質(zhì)形成細(xì)胞相似的生物學(xué)特征，可作為體外研究藥物及皮膚病的良好模型［3］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）具有抗氧化、抗炎和抗癌等作用［4］。本研究以IL?17誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞為對象，探討EGCG對角質(zhì)形成細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

材料和方法

一、材料

IL?17（美國Peprotech公司）。EGCG（純度 ≥98%）、JNK抑制劑、Annexin V?FITC試劑盒（江蘇凱基生物公司），JNK激活劑茴香霉素（美國Santa Cruz公司）。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）及1%青鏈霉素（美國Gibco Invitrogen公司），CCK?8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；IL?6、IL?23、IL?8 ELISA試劑盒（武漢博士德公司），HaCaT細(xì)胞（美國ATCC細(xì)胞庫）。

二、方法

1.HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)：HaCaT細(xì)胞用含10%FBS、1%青霉素、1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，2～3 d更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞80%融合時進(jìn)行傳代。選擇對數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.細(xì)胞分組：不同濃度IL?17誘導(dǎo)細(xì)胞分組：分別用50、70、90 μg/L的IL?17誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞，同時設(shè)置空白對照組。不同濃度EGCG處理細(xì)胞分組：分別用20、40、60 μmol/L的EGCG和90 μg/L IL?17共同誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞，同時設(shè)置空白對照組和90 μg/L IL?17單獨誘導(dǎo)的IL?17組。JNK激活劑茴香霉素和抑制劑SP600125處理細(xì)胞分組：空白對照組、IL?17組、IL?17+EGCG組、IL?17+SP600125組、IL?17+EGCG+茴香霉素組。

3.CCK?8檢測：CCK?8試劑盒檢測12、24、36和48 h時各組細(xì)胞增殖水平。每種處理設(shè)置4個復(fù)孔，每孔加入10 μl CCK?8試劑，在37 ℃避光孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度A值。

4.流式細(xì)胞儀檢測：按照不同濃度EGCG誘導(dǎo)細(xì)胞組分別進(jìn)行處理，0.25%胰酶（不含EDTA）消化細(xì)胞，PBS洗滌，離心，加入100 μl緩沖液重懸細(xì)胞。然后加入5 μl Annexin V?FITC 以及5 μl PI于室溫避光孵育15 min。隨后加入400 μl緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

5.ELISA檢測：將細(xì)胞進(jìn)行處理，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測IL?6、IL?23和IL?8的表達(dá)水平。將稀釋的樣品加樣并蓋上封板膜，37℃反應(yīng)60min。隨后洗板5次，加入顯色液AB，37℃下顯色10 min后加入終止液。在10min之內(nèi)用酶標(biāo)儀測定490nm處吸光度A值。

6.Western印跡檢測蛋白表達(dá)：按照J(rèn)NK激活劑和抑制劑處理細(xì)胞分組分別進(jìn)行處理，用RIPA細(xì)胞蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白。隨后進(jìn)行SDS?PAGE凝膠電泳，用半干轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，漂洗3次。分別加入JNK、P?JNK和GAPDH一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，漂洗3次。再加入PVDF膜轉(zhuǎn)入二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，漂洗4次。經(jīng)Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃描，目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值反映蛋白的表達(dá)水平。

7.統(tǒng)計學(xué)分析：實驗重復(fù)3次。用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用±s表示，實驗數(shù)據(jù)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.IL?17促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖：如圖1所示，IL?17濃度越高、處理時間越長，細(xì)胞增殖率越高。90 μg/L IL?17處理48 h后，細(xì)胞增殖率提高64.8%。說明IL?17可以促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖，并且與IL?17濃度、處理時間呈正相關(guān)。因此，采用90 μg/L IL?17誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞。

圖1 不同濃度白細(xì)胞介素（IL）17作用不同時間對HaCaT細(xì)胞增殖的影響 a：與空白對照組比較，P＜0.05

2.EGCG抑制IL?17誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的增殖：如圖2所示，EGCG抑制IL?17誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖，并且與EGCG濃度、處理時間呈正相關(guān)。EGCG濃度越高、處理時間越長，細(xì)胞生長抑制率越高。

3.EGCG促進(jìn)IL?17誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的凋亡：如圖3所示，IL?17處理使HaCaT細(xì)胞的凋亡率顯著下降，與空白對照組（17.53%）相比，凋亡率下調(diào)至1.32%。與IL?17組相比，EGCG組的細(xì)胞凋亡率顯著增加。20 μmol/L EGCG組、40 μmol/L EGCG組和60 μmol/L EGCG組的凋亡率分別為8.6%、13.3%和15.6%。

4.EGCG抑制IL?17誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的炎癥因子產(chǎn)生：如圖4所示，與空白對照組相比，IL?17組的IL?6、IL?23和 IL?8的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜ 0.001）。與IL?17組相比，EGCG 組的IL?6、IL?23和 IL?8的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），而EGCG濃度越高，炎癥因子的表達(dá)水平越低。

圖2 不同濃度表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）作用不同時間對白細(xì)胞介素（IL）17誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞增殖的影響 a：與白細(xì)胞介素17組比較，P＜0.05

圖3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對白細(xì)胞介素17（IL?17）誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響

圖4 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對白細(xì)胞介素17（IL?17）誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞炎癥因子的影響 a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與IL?17組比較，P＜0.05

圖5 60 μmol/L表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對白細(xì)胞介素17（IL?17）誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的JNK信號通路的影響 a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與 IL?17組比較，P＜0.05；c：與IL?17+EGCG組比較，P＜0.05。1：空白對照組；2：IL?17組；3：IL?17+EGCG組；4：IL?17+SP600125組；5：IL?17+EGCG+茴香霉素組 5A：Western印跡檢測p?JNK和JNK的蛋白表達(dá)水平；5B：5A的統(tǒng)計柱狀圖

5.EGCG抑制IL?17誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的JNK信號通路激活：如圖5所示，空白對照組、IL?17組、IL?17+60 μmol/L EGCG組、IL?17+SP600125組和IL?17+60 μmol/L EGCG+ 茴香霉素組間的JNK表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5A）。與空白對照組相比，IL?17組P?JNK表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.001）；與IL?17組相比，IL?17+60 μmol/L EGCG組和IL?17+SP600125組P?JNK表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）；與 IL?17+60 μmol/L EGCG 組相比，IL?17+60 μmol/L EGCG+茴香霉素組P?JNK表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。

6.JNK信號通路抑制介導(dǎo)60 μmol/L EGCG的抗細(xì)胞增殖、抗炎作用：如圖6所示，與空白對照組相比，IL?17組的細(xì)胞增殖顯著增加（P＜0.05）。與IL?17組相比，IL?17+60 μmol/L EGCG組和IL?17+SP600125組的細(xì)胞增殖下降（P＜0.05）。與IL?17+60 μmol/L EGCG組相比，IL?17+60 μmol/L EGCG+茴香霉素組的細(xì)胞增殖率上升（P＜0.05）。與空白對照組相比，IL?17組的IL?6、IL?23和 IL?8表達(dá)上調(diào)（P＜ 0.05）。與IL?17組相比，IL?17+60 μmol/L EGCG組和IL?17+SP600125組的IL?6、IL?23和 IL?8表達(dá)下調(diào)（P＜ 0.05）。與IL?17+60 μmol/L EGCG組相比，IL?17+60 μmol/L EGCG+ 茴香霉素組的IL?6、IL?23和 IL?8表達(dá)顯著上調(diào)（P＜ 0.05）。見表1。

圖6 JNK信號通路的抑制介導(dǎo)60 μmol/L表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的抗細(xì)胞增殖作用 a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與IL?17組比較，P＜0.05；c：與IL?17+EGCG組比較，P＜0.05

表1 JNK信號通路的抑制介導(dǎo)60 μmol/L表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的抗炎作用（±s，ng/L）

表1 JNK信號通路的抑制介導(dǎo)60 μmol/L表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的抗炎作用（±s，ng/L）

注：n=3。a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與IL?17組比較，P＜0.05；c：與IL?17+EGCG組比較，P＜0.05。Ani：茴香霉素

組別空白對照組IL?17組IL?17+EGCG組IL?17+SP600125組IL?17+EGCG+Ani組IL?6 101.34±18.35 582.25±35.56a 173.27±25.34b 124.46±27.23b 550.24±50.34c IL?23 103.45±15.35 452.31±34.56a 188.11±26.34b 147.67±23.23b 390.43±33.21c IL?8 1 029.14±90.35 3 657.36±210.56a 1 518.17±162.21b 1 345.83±133.23b 3 125.52±156.56c

討 論

CCK-8試劑盒和流式細(xì)胞儀常用于檢測細(xì)胞的增殖和凋亡水平。本研究通過ELISA試劑盒檢測炎癥因子水平、Western印跡檢測蛋白水平等方法，探討了EGCG對HaCaT細(xì)胞損傷的作用。研究發(fā)現(xiàn)，IL?17可能參與了銀屑病等免疫性皮膚疾病的發(fā)病過程［5］。綠茶多酚對皮膚有保護(hù)作用，可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞異常增殖等生物過程［6］。

本研究發(fā)現(xiàn)，IL?17濃度越高，HaCaT細(xì)胞的增殖率越高，增殖率與IL?17的處理時間呈正比，證明IL?17可以誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖，這一結(jié)果與Jia等［7］的結(jié)果一致。已有研究證明，EGCG可以抑制前列腺癌細(xì)胞DU145［8］、正常人角質(zhì)形成細(xì)胞［9］的過度增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可以抑制IL?17誘導(dǎo)HaCaT的增殖，EGCG濃度越高、處理時間越長，細(xì)胞生長抑制率越高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EGCG對IL?17誘導(dǎo)的HaCaT凋亡降低有抑制作用。另外，研究證明，在IL?17的作用下，角質(zhì)形成細(xì)胞可能產(chǎn)生一些炎癥細(xì)胞因子，這些炎癥因子相互作用可能會誘發(fā)和加重銀屑病［10］。本研究結(jié)果顯示，IL?17誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，IL?6、IL?23和IL?8的表達(dá)顯著上調(diào)，而EGCG能夠顯著抑制IL?6、IL?23和IL?8的上調(diào)。以上結(jié)果提示，EGCG可能在IL?17誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞損傷中有保護(hù)作用。

有研究報道，EGCG可以調(diào)控不同種類細(xì)胞的MAPK信號通路［11］。本實驗表明，EGCG可以抑制IL?17誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的JNK信號通路的激活。我們用JNK的抑制劑處理IL?17誘導(dǎo)的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EGCG和JNK抑制劑有相似的作用，抑制IL?17誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的炎癥因子IL?6、IL?23和IL?8的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，說明EGCG可能是通過抑制JNK信號通路發(fā)揮保護(hù)作用。為進(jìn)一步確定EGCG對JNK信號通路的抑制作用，我們進(jìn)行JNK激活劑茴香霉素處理，發(fā)現(xiàn)EGCG的保護(hù)作用消失，炎癥因子IL?6、IL?23、IL?8的表達(dá)和HaCaT細(xì)胞的增殖速率與IL?17+EGCG組相比顯著提高，說明EGCG能夠通過抑制JNK信號通路來抑制炎癥因子的產(chǎn)生，降低細(xì)胞增殖。

綜上所述，IL?17會引起HaCaT細(xì)胞的異常增殖、炎癥反應(yīng)，并激活JNK通路；而EGCG可以通過抑制JNK信號通路減少炎癥因子的產(chǎn)生，降低HaCaT細(xì)胞的增殖，表明EGCG可通過抑制JNK信號通路保護(hù)IL?17誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞損傷。

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Epigallocatechin gallate inhibits the proliferation and apoptosis of keratinocytes induced by interleukin?17

Fu Dandan,Hu Hua,Sun Min,Li Min,Tian Zhongwei
Department of Dermatology and Venereology,The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Weihui 453100,Henan,China

ObjectiveTo evaluate the protective effect of epigallocatechin gallate（EGCG）against interleukin（IL）?17?induced injury to keratinocytes,and to explore its mechanism.MethodsSome cultured HaCaT cells were divided into 3 groups to be treated with IL ?17 alone at concentrations of 50,70,90 μg/L,respectively,with those receiving no treatment as the blank control group.Some HaCaT cells were divided into 5 groups:IL?17 group treated with 90 μg/L IL?17 alone,IL?17+EGCG group treated with 90 μg/L IL?17 and 60 μmol/L EGCG,IL?17+SP600125 group treated with 90 μg/L IL?17 and SP600125（a JAK signaling pathway inhibitor）,IL?17+EGCG+anisomycin group treated with 90 μg/L IL?17,60 μmol/L EGCG and anisomycin（a Janus kinase signaling pathway activator）,and blank control group receiving no treatment.After different durations of treatment,CCK?8 assay was performed to evaluate cellular proliferative activity,flow cytometry to detect cell apoptosis,enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）to measure expression levels of IL?6,IL?23 and IL?8,and Western?blot analysis to determine protein expressions of c?Jun N?terminal kinase（JNK）and phosphorylated JNK（P?JNK）.ResultsIL?17 promoted cellular proliferation of HaCaT cells,and the proliferation rate,which was correlated with the concentration of IL?17,reached the maximum in the 90?μg/L IL?17 group（P＜ 0.05）.EGCG at 60 μmol/L significantly inhibited cellular proliferation of,promoted apoptosis in,and reduced IL?6,IL?23 and IL?8 expressions in,HaCaT cells induced by 90 μg/L IL?17（allP＜0.05）.Compared with the IL?17 group,the IL?17+EGCG group and IL?17+SP600125 group both showed significantly decreased P?JNK expression,cell proliferation rate and IL?6,IL?23 and IL?8 expression levels（allP＜ 0.05）.However,compared with the IL?17+EGCG group,the IL?17+EGCG+anisomycin group showed significantly increased protein expression of P?JNK,cell proliferation rate and IL?6,IL?23 and IL?8 expression levels（allP＜ 0.05）.ConclusionEGCG protected against IL?17?induced injury to HaCaT cells,such as abnormal cell proliferation,apoptosis and inflammatory response,likely by inhibiting the JNK signaling pathway.

Keratinocytes;Catechin;Interleukin?17;Cell proliferation;Apoptosis;Epigallo?catechin gallate

Tian Zhongwei,Email:zhonwt@163.com

2015?11?25）

（本文編輯：吳曉初）

田中偉，Email：zhonwt@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.09.007

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目（13A320852）；河南省中青年衛(wèi)生科技創(chuàng)新人才工程（201004159）；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項目（201502016）；新鄉(xiāng)市科技發(fā)展計劃項目（15SF26）

Fund programs:Key Program for Science and Technology of Henan Educational Committee（13A320852）;Henan Health Science and Technology Innovation Youth Talent Project（201004159）;Medical Science and Technology Foundation of Henan Province（201502016）;Science and Technology Development Program of Xinxiang City（15SF26）