●孫垚峰

高效液相色譜法測(cè)定枸櫞酸托法替布含量

●孫垚峰

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定枸櫞酸托法替布含量。方法：以0.1%醋酸溶液-甲醇-乙腈（60：35：5）流動(dòng)相A，以甲醇-0.1%醋酸溶液-乙腈（80：15：5）流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，柱溫40℃。結(jié)果：枸櫞酸托法替布在質(zhì)量濃度為50-70ug/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9995；平均回收率為99.9%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、無(wú)干擾，可用于枸櫞酸托法替布的含量測(cè)定。

高效液相色譜法；方法學(xué)驗(yàn)證；枸櫞酸托法替布；含量測(cè)定

枸櫞酸托法替尼是美國(guó)輝瑞公司研發(fā)的一種新型Janus 激酶抑制劑，2012 年11 月經(jīng)美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市，商品名Xeljanz[1]。該藥用于對(duì)氨甲喋呤治療應(yīng)答不充分或不耐受的中至重度活動(dòng)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的成人患者，是一種新型口服JAK 抑制劑[2]。

本研究綜合相關(guān)文獻(xiàn)[3-5]。目前化學(xué)藥品含量的主要測(cè)定方法有，滴定法、比色法、紫外分光光度法、高效液相色譜法等。本文采用高效液相色譜法測(cè)定枸櫞酸托法替布的含量，該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、無(wú)干擾，重復(fù)性好，可用于枸櫞酸托法替尼含量的控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

取空白輔料、枸櫞酸托法替布片按照2.2.2方法配制輔料空白溶液、供試品溶液，先進(jìn)空白溶液，再進(jìn)供試品溶液，結(jié)果顯示無(wú)溶劑峰、輔料峰干擾測(cè)試。

試驗(yàn)結(jié)果如下圖1所示：

2.4 線性及范圍

2.4.1 精密稱取枸櫞酸托法替布對(duì)照品，加溶劑溶解并稀釋制成每1ml約含枸櫞酸托法替布0.3mg的溶液，作為線性儲(chǔ)備液；精密量取線性儲(chǔ)備液 1.6ml、1.8ml、2.0ml、2.2ml、2.4ml分別置 10ml容量瓶中，加溶劑稀釋定容至刻度，搖勻，分別作為線性溶液①、②、③、④、⑤，包括80%規(guī)格、90%規(guī)格、100%規(guī)格、110%規(guī)格、120%規(guī)格，作為線

圖1

Thermo Ultimate3000型高效液相色譜儀；XP56梅特勒-托利多電子分析天平；實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)。

枸櫞酸托法替尼（輝瑞公司；規(guī)格5mg★60片）；枸櫞酸托法替布對(duì)照品（120109-178146；中國(guó)生物制品檢定所）；乙腈、甲醇，色譜純（美國(guó)MERCK公司）；醋酸，分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.1%醋酸溶液-甲醇-乙腈（60：35：5），流動(dòng)相B為甲醇-0.1%醋酸溶液-乙腈（80：15：5），按下表進(jìn)行梯度洗脫：

2.1.2溶劑：水-甲醇-乙腈（60:35:5）

2.1.3 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，柱溫為40℃，流速為每分鐘1.0mL，自動(dòng)進(jìn)樣器5℃，進(jìn)樣體積為10μl，理論板數(shù)按托法替布峰計(jì)應(yīng)不低于3500；

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液：取枸櫞酸托法替布對(duì)照品約24mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液5ml，置20ml量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml中約含60ug的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液：取枸櫞酸托法替布20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于枸櫞酸托法替布6mg），置100ml量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。性回歸點(diǎn)。以濃度（ug/ml）為橫坐標(biāo)，托法替布峰面積的為縱坐標(biāo)，得出線性方程線性方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1，線性回歸的相關(guān)系數(shù)（r）在≥0.999范圍內(nèi)，證明方法線性良好（如圖2）。

表一

2.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2.2項(xiàng)下溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，考察連續(xù)進(jìn)樣6針對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果的接近程度，結(jié)果托法替布峰面積RSD為0.1%，證明該方法重復(fù)性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品，按2.2.2項(xiàng)下方法平行配制6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果枸櫞酸托法替布含量平均值（n=6）RSD為0.6%，證明該方法重復(fù)性良好。

試驗(yàn)結(jié)果如下圖3所示：

2.7 準(zhǔn)確度

以2.2.2中規(guī)定的樣品配制濃度為100%規(guī)格，分別準(zhǔn)確稱枸櫞酸托法替布對(duì)照品，加空白輔料上適量，加溶劑使枸櫞酸托法替布溶解，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液，每個(gè)濃度（包括80%規(guī)格、100%規(guī)格、120%規(guī)格）各配制3份，共9份溶液。按含量測(cè)定方法，每份供試品溶液進(jìn)樣1針，計(jì)算9份溶液枸櫞酸托法替布的回收率（n=9）RSD為0.5%，證明該方法回收率良好。

圖2 （線性及范圍）

圖3 （重復(fù)性試驗(yàn)）

試驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2

2.8 耐用性試驗(yàn)

改變柱溫、醋酸加入量以及改變色譜柱，供試品含量均在95.0%～105.0%之間，RSD分別為0.3%、0.2%、0.2%，正常條件與改變條件含量RSD為0.3%，證明該方法耐用性良好。

2.9 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.9.1 對(duì)照品溶液 5℃條件下放置 0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、48h后分別進(jìn)樣1針，記錄色譜圖。托法替布峰面積的RSD為0.2%。

2.9.2 供試品溶液在5℃條件下放置0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、48h后分別進(jìn)樣1針，記錄色譜圖。含量在95.0%～105.0%之間，RSD為0.3%，證明該方法溶液穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論

通過(guò)以上方法學(xué)實(shí)驗(yàn)證明該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、無(wú)干擾，可用于枸櫞酸托法替布的含量測(cè)定。

（作者單位：正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）

[1] 趙方露, 陳國(guó)華, 姚世倫等. 枸櫞酸托法替尼的合成[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2014,45(3):201-204.

[2] 王鐵英. 托法替尼檸檬酸鹽( Tofacitinib) [J]. 中國(guó)藥物化學(xué)雜志，2013,23(2):166-167.

[3] 劉二東,宋春霞,劉冉冉等. 高效液相色譜法測(cè)定含乳飲料中苯甲酸的含量[J].化學(xué)工程師,2009,23 (4):29-30,48.

[4] 陳嬌婷,詹怡飛. HPLC法枸櫞酸托法替布的含量[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2015,24 (17):23-24.

[5] 王轉(zhuǎn),尹東東,王杏林,詹璐璐. 高效液相色譜法在手型藥物分析中的研究進(jìn)展[J].藥物分析雜質(zhì)，2015,35(7):1127-1133.