劉　敏，崢　嶸，白淑蘭*，青　云，閆　偉，賈學文

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 林學院，呼和浩特010019；2 內(nèi)蒙古師范大學 生命科學與技術(shù)學院，呼和浩特010022；3 鄂爾多斯市林業(yè)治沙科學研究院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017000)

?

內(nèi)蒙古大青山灌木鐵線蓮根圍叢枝菌根真菌群落季節(jié)動態(tài)研究

劉敏1，崢嶸2，白淑蘭1*，青云2，閆偉3，賈學文3

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 林學院，呼和浩特010019；2 內(nèi)蒙古師范大學 生命科學與技術(shù)學院，呼和浩特010022；3 鄂爾多斯市林業(yè)治沙科學研究院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017000)

采用Illumina MiSeq測序技術(shù)研究了內(nèi)蒙古大青山干旱陽坡灌木鐵線蓮(Clematisfruticosa)根圍叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)群落的季節(jié)動態(tài)，并利用冗余分析(redundancy analysis，RDA)和Mantel test分析了土壤和植被因子與AMF之間的關(guān)系，為進一步探索灌木鐵線蓮-AMF共生體對不同季節(jié)環(huán)境變化的響應提供理論依據(jù)。結(jié)果表明：(1)灌木鐵線蓮根圍AMF孢子密度不存在顯著的季節(jié)性差異，根系侵染率和叢枝豐度從春季至秋季呈下降趨勢。(2)3個季節(jié)共檢測出163個AMF OTUs(operational taxonomic units)，春季、夏季、秋季分別為116 OTUs、76 OTUs和70 OTUs。(3)夏季和秋季的AMF豐富度(實測OTUs數(shù)和Chao1指數(shù))以及多樣性(Shannon-Wiener 指數(shù)和Invsimpson指數(shù))顯著低于春季，但夏、秋季間無顯著異。(4)主成分分析和PERMANOVA分析表明，夏季和秋季的AMF群落組成與春季存在顯著差異，而AMF群落組成在夏季與秋季間差異不顯著。(5)RDA分析表明，采樣季節(jié)、植被蓋度、植物多樣性、土壤含水量和土壤有機質(zhì)對AMF Shannon-Wiener指數(shù)、Invsimpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和實測OTUs數(shù)均產(chǎn)生顯著影響；Mantel test分析發(fā)現(xiàn)，采樣季節(jié)是影響AMF群落組成和菌根侵染率的主導因子，但對孢子密度無顯著影響，而土壤有機質(zhì)是影響孢子密度的主導因子。

灌木鐵線蓮；叢枝菌根真菌；季節(jié)動態(tài)；Illumina MiSeq測序

受全球氣候變化和人類活動的影響，內(nèi)蒙古大青山土壤及植被資源遭受到嚴重破壞，尤其是陽坡，很多地區(qū)均成為溝壑縱橫、巖石裸露的荒山。灌木鐵線蓮(Clematisfruticosa)作為該生境主要的護土灌木，在水土保持及防治土壤侵蝕等方面發(fā)揮著重要作用。叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)可與地球上大多數(shù)植物形成共生體，能夠提高植物對養(yǎng)分的吸收[1]、增強植物抗干旱脅迫能力[2-3]、提高土壤團聚體穩(wěn)定性[4]，還能影響植物生物量、生長速度和生產(chǎn)力[5-6]。所以，灌木鐵線蓮能在內(nèi)蒙古大青山陽坡干旱和貧瘠環(huán)境中生存，必然與AMF共生有很大關(guān)聯(lián)。

研究表明，AMF侵染率、孢子密度、多樣性和群落組成均存在季節(jié)性變化規(guī)律[7-10]，但也有研究認為AMF群落組成和多樣性無季節(jié)性差異[11]?？梢?，季節(jié)變化對AMF群落的影響無固定模式。此外，非生物和生物因素的季節(jié)性變化均可能影響AMF群落組成。例如，在美國北卡羅來納州的草原地區(qū)，植被群落組成的季節(jié)性變化會顯著影響AMF群落組成[12]；而Baidnard等[7]卻發(fā)現(xiàn)土壤磷酸鹽含量、含水量和宿主植物種類是導致不同季節(jié)AMF群落變化的主要原因。也有研究表明，AMF群落的季節(jié)動態(tài)變化與宿主植物物候有關(guān)。Senes-guerrero等[13]發(fā)現(xiàn)秘魯安第斯山脈地區(qū)的馬鈴薯幼苗期、開花期和衰老期的AMF群落存在顯著差異；Cuenca等[14]發(fā)現(xiàn)在熱帶或亞熱帶的雨季(植物開花期或結(jié)果期)AMF豐富度要低于干季(植物生長期)。因此，AMF群落的季節(jié)動態(tài)不僅受土壤理化性質(zhì)和植物群落季節(jié)性變化的影響，還與宿主植物的種類和物候有關(guān)。那么，內(nèi)蒙古大青山灌木鐵線蓮根系菌根侵染率、孢子密度和AMF群落組成是否會出現(xiàn)季節(jié)性變化規(guī)律，可能會受哪些因素的影響,均為本研究擬探討的問題。

1　材料和方法

1.1研究區(qū)概況及樣品采集

研究區(qū)位于內(nèi)蒙古大青山呼和浩特段，屬典型的溫帶大陸性氣候，年平均氣溫3 ～ 5 ℃，年平均降雨量320 ～ 450 mm，年平均蒸發(fā)量1 800 ～ 2 300 mm。內(nèi)蒙古大青山地區(qū)灌木鐵線蓮生長期為5月，開花期為7 ～ 8月，果期為9月[15]。所以，本研究分別于 2014年5月(春)、7月(夏)和9月(秋)在水磨村(40°58′55″N，111°51′34″E)、小井溝(40°58′25″N，111°50′44″E)和白石頭溝(40°47′37″N，111°26′47″E)樣地隨機設(shè)置3個3 m×3 m樣方，調(diào)查樣方中植被蓋度及植物群落組成，每個樣方隨機選擇3株灌木鐵線蓮，在距植株0 ～ 10 cm處挖根圍土壤，采集0 ～ 20 cm深處的細根樣和土樣(每次采樣均取相同植株)，相同樣方的樣本混合均勻，組成一個混合樣本?；旌蠘颖臼紫热〈蠹s20 g左右土壤放入到鋁盒中，用于測定土壤含水量。剩余土壤一部分貯存在-20 ℃冰箱中，用于分子鑒定；另一部分風干，測定孢子密度和土壤理化性質(zhì)。根樣用蒸餾水清洗數(shù)次后放在裝有FAA固定液(5 mL 甲醛，5 mL醋酸和90 mL 70%乙醇)的玻璃瓶中，用于AMF侵染率測定。

1.2土壤理化性質(zhì)測定

土壤含水量、pH、有機質(zhì)、速效氮和速效磷含量的測定分別使用烘干法、電位法、重鉻酸鉀氧化法、堿解擴散法和0.5 mol/L碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法[16]。

1.3叢枝菌根真菌孢子分離和根侵染率測定

將采集的幼嫩根系剪成長度為1 cm左右根段，10% KOH溶液浸泡并在90 ℃水浴鍋加熱1 h，堿性H2O2溶液(10 mL 30% H2O2，3 mL NH4OH，加蒸餾水至600 mL)軟化20 min，1% HCl酸化3 min，0.05%曲利苯藍乳酸甘油溶液(乳酸∶甘油=1∶1)浸泡并在90 ℃水浴鍋加熱3 h，最后在乳酸甘油溶液中脫色48 h。將脫色后的根段置于載玻片上在顯微鏡下觀察，利用十字交叉法[18]測定AMF侵染率和叢枝豐度。

1.4土壤DNA提取、PCR擴增和測序

取0.2 g土樣，按照E.Z.N.A.Soil DNA Kit(OMEGA，USA)的說明提取土壤DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳查看DNA的完整性，利用Qubit2.0 DNA Detection Kit(Life Technologies，USA)精確定量DNA濃度，以確定PCR反應加入的DNA量。利用Illumina MiSeq測序技術(shù)和AMV4.5NF(5′-AAGCTCGTAGTT GAATTTCG-3′)/AMDGR(3′-CCCAACTATCCCTATTATCAT-5′)引物[19]評估AMF群落組成。為保證Illumina MiSeq測序順利進行和多個樣本同時測序，需在引物中添加Illumina平臺adapter和7 bp-barcode(標簽序列)。采用two-step PCR進行PCR擴增，反應體系為50 μL，包括10 ng DNA模板(第一次PCR)或者是20 ng PCR產(chǎn)物(第二次PCR)、5 μL 10×PCR buffer、0.5 μL dNTP(10 mmol/L each)、0.5 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、0.5 μL引物(50 μmol/L，前后引物各0.5 μL)，最后用ddH2O補充到50 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，55 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸30 s，循環(huán)25次；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，按照SanPrep 柱式 DNA 膠回收試劑盒(上海生工，中國)操作說明回收PCR產(chǎn)物。回收產(chǎn)物用Qubit2.0 DNA Detection Kit(Life Technologies，USA)測定濃度，根據(jù)濃度，將所有樣本按1∶1比例充分混合，進行Illumina MiSeq測序。

1.5測序結(jié)果分析

Illumina MiSeq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)雙端測序reads之間的overlap關(guān)系，將成對reads 拼接成一條序列，對reads質(zhì)量和拼接效果進行質(zhì)量控制過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣本得到有效序列，并校正序列方向。質(zhì)量控制過濾主要是去掉短片段序列、含有錯誤的barcode和引物的序列和融合后reads質(zhì)量控制得分在20以下的序列。利用Flash(1.2.3)[20]和Prinseq(0.20.4)[21]分別進行序列拼接和質(zhì)量控制過濾。按序列間距離對序列進行歸類，利用CROP方法[22]以97%相似性分類OTUs(operational taxonomic units)。使用Blast首先在GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，排除非球囊菌門(Glomeromycota)OTUs數(shù)。然后在MaarjAM 數(shù)據(jù)庫[23]中再次比對OTUs序列，進一步確認AMF OTUs分類學信息。

1.6統(tǒng)計處理

1.規(guī)范鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道）統(tǒng)戰(zhàn)委員、統(tǒng)戰(zhàn)工作人員的配備要求。按照鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道）、村（社區(qū)）的具體區(qū)劃，將支持、協(xié)調(diào)甚至主導推進園區(qū)、樓宇、經(jīng)濟板塊等統(tǒng)戰(zhàn)工作作為鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道）、村（社區(qū)）黨建工作的重要任務，既避免特定轄區(qū)內(nèi)基層統(tǒng)戰(zhàn)工作的多頭開展、資源浪費，又保證基層統(tǒng)戰(zhàn)工作不留死角、協(xié)同推進。

統(tǒng)計分析前，對土壤理化性質(zhì)、植被蓋度、孢子密度、菌根侵染率、AMF豐富度和多樣性等數(shù)據(jù)進行標準化處理。利用SPSS軟件(20.0)對不同季節(jié)數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，LSD多重比較檢驗不同季節(jié)間的差異顯著性。利用Mothur軟件(1.30.1)對實測OTUs數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和Invsimpson指數(shù)進行rarefaction分析。為比較不同季節(jié)AMF群落組成的差異性，利用PCORD軟件(5.0)進行主成分分析(principal coordinate analysis，PCoA)和PERMANOVA分析。利用Canoco軟件(4.5)的冗余分析(redundancy analysis，RDA)描繪不同季節(jié)AMF豐富度和多樣性指數(shù)與采樣季節(jié)、土壤和植被因子間的關(guān)系。Mantel test進一步檢驗AMF群落組成、孢子密度和菌根侵染率與采樣季節(jié)、土壤和植被因子間的關(guān)系。

2　結(jié)果與分析

2.1樣地土壤理化性質(zhì)及植被因子季節(jié)變化特征

由表1可以看出，樣地春季土壤速效氮、速效磷和有機質(zhì)含量顯著高于夏季和秋季；夏季土壤含水量顯著高于春季和秋季；夏季和秋季植被蓋度顯著高于春季；土壤pH值和植物Shannon-Wiener多樣性指數(shù)在3個季節(jié)間無顯著差異。

2.2叢枝菌根真菌孢子密度和根系侵染率季節(jié)變化

從圖1可以看出，灌木鐵線蓮根圍土壤AMF孢子密度在春季、夏季和秋季不存在顯著差異；灌木鐵線蓮根系A(chǔ)MF侵染率較高，所有樣本(n=27)AMF侵染率均超過95%，且春季和夏季根系侵染率顯著高于秋季；叢枝豐度在3個季節(jié)之間均呈顯著差異，其中春季最高，秋季最低。相關(guān)性分析表明，灌木鐵線蓮根圍土壤AMF孢子密度與采樣季節(jié)無顯著相關(guān)性，根系侵染率和叢枝豐度與采樣季節(jié)極顯著負相關(guān)(r=-0.741，P=0.000；r=-0.896，P=0.000)，說明隨灌木鐵線蓮的生長(5月)、開花(7月)、結(jié)實(9月)，其根系A(chǔ)MF侵染率和叢枝豐度呈下降趨勢。

表1　不同季節(jié)土壤和植被因子比較Table 1　The comparison of soil and plant factors in different seasons

注：數(shù)據(jù)為均值±標準誤(n=9)；同一行數(shù)據(jù)后不同字母表示在 0.05 水平上差異顯著

Note: Data are means±SE. Data with different letters in the same line indicate significant differences at 0.05 level

同一組柱子上不同字母表示在 0.05 水平上差異顯著；誤差棒代表標準誤。圖1　不同季節(jié)AMF孢子密度及侵染率Columns with different letters at the same group indicate significant differences at 0.05 level; error bars indicate standard errorsFig.1　Spore density and colonization of AMF in different seasons

2.3根圍土壤叢枝菌根真菌群落組成及其季節(jié)變化特征

隨測序樣本數(shù)的不斷增加，不同季節(jié)AMF物種累積曲線基本上達到平緩期(圖2)，說明在本研究中每個季節(jié)測序樣本數(shù)量是充足的。Illumina Miseq測序共檢測到300 718條序列，被歸類為295 OTUs。AMF序列數(shù)目為204 122，占總數(shù)的67.88%，所有序列被分類為163 OTUs，屬于球囊霉屬(Glomus)、uncultured-Glomeromycota、多樣孢囊霉屬(Diversispora)、近明球囊霉屬(Claroideoglomus)、盾巨孢囊霉屬(Scutellospora)、管柄囊霉屬(Funeliformis)、Rhizophagus、類球囊霉屬(Paraglomus)、Ambispora、Septoglomus和原囊霉屬(Archaeospora)。其中球囊霉屬序列數(shù)和OTUs數(shù)目最多，其次為uncultured-Glomeromycota，第三為多樣孢囊霉屬，其余屬數(shù)目較少(表2)。

圖2　不同季節(jié)AMF物種累積曲線Fig.2　Species accumulation curves of AMF in different seasons

圖3為不同季節(jié)AMF群落組成，3個季節(jié)總共檢測到163個AMF OTUs，春季、夏季、秋季分別為116、76和 70 OTUs。各季節(jié)AMF群落的優(yōu)勢屬均為球囊霉屬。隨著季節(jié)變化，球囊霉屬、uncultured-Glomeromycota、盾巨孢囊霉屬、RhizophaugusOTUs數(shù)目基本呈下降趨勢，而多樣孢囊霉屬OTUs數(shù)目夏季最多，管柄囊霉屬和AmbisporaOTUs數(shù)目在3個季節(jié)保持不變。此外，近明球囊霉屬只存在于春季和秋季，類球囊霉屬只存在于春季和夏季，Septoglomus只存在于春季，原囊霉屬只存在于夏季?；贐ray-Curtis距離對不同季節(jié)AMF群落組成進行PERMANOVA分析(表3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，夏季和秋季AMF群落組成與春季存在顯著差異，而AMF群落組成在夏季和秋季的差異并不顯著，這與PCoA分析結(jié)果是一致的(圖4)。

表2　Illumina MiSeq測序得到的AMF序列數(shù)和OTUs數(shù)Table 2　Number of sequences and OTUs of AMF from all soil samples obtained by Illumina MiSeq sequencing

1. 球囊霉屬；2. Uncultured-Glomeromycota；3. 多樣孢囊霉屬；4. 近明球囊霉屬；5. 盾巨孢囊霉屬；6. 管柄囊霉屬；7. Rhizophagus；8. 類球囊霉屬；9. Ambispora；10. Septoglomus；11. 原囊霉屬圖3　不同季節(jié)AMF群落組成1. Glomus; 2. Uncultured-Glomeromycota; 3. Diversispora; 4. Claroideoglomus; 5. Scutellospora; 6. Funeliformis; 7. Rhizophagus; 8. Paraglomus; 9. Ambispora; 10. Septoglomus; 11. ArchaeosporaFig.3　Community composition of AMF based on number of OTUs in different seasons

表3　不同季節(jié)AMF群落組成的PERMANOVA分析Table 3　The results of PERMANOVA analysis of AMF community composition in different seasons

圖4　不同季節(jié)AMF群落的主成分分析Fig.4　Principal coordinate analysis (PCoA) of AMF community from different seasons

2.4不同季節(jié)叢枝菌根真菌豐富度和多樣性指數(shù)的稀疏曲線分析

利用實測OTUs數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和Invsimpson指數(shù)的稀疏曲線評估和比較不同季節(jié)AMF豐富度和多樣性(圖5)。當AMF序列數(shù)超過30 000時，所有曲線均基本上達到平緩期，說明本研究測序得到的AMF豐富度和多樣性能夠很好地描述不同季節(jié)的AMF。此外，春季AMF豐富度(實測OTUs數(shù)和Chao1指數(shù))和多樣性(Shannon-Wiener 和Invsimpson多樣性指數(shù))顯著高于夏季和秋季(LSD檢驗，P< 0.05)。實測OTUs數(shù)和Chao1指數(shù)值分別從春季的116、121.96，降低到夏季的76、77和秋季的70、70(圖5，A、B)；相應地，Shannon-Wiener 和Invsimpson多樣性指數(shù)值分別從春季的3.62、20.26，降低到夏季的3.21、14.78和秋季的3.07、12.89(圖5，C、D)。然而，夏季和秋季的AMF豐富度和多樣性無顯著差異(LSD檢驗，P> 0.05)。

2.5根圍土壤理化性質(zhì)和植被因子對叢枝菌根真菌的影響

RDA分析結(jié)果表明(圖6)，第一軸和第二軸的解釋量分別為20.52%和5.28%，采樣季節(jié)、植被蓋度、植被多樣性、土壤含水量和土壤有機質(zhì)顯著影響AMF多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener指數(shù)和Invsim-pson指數(shù))和豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù)和實測OTUs數(shù),P< 0.05)。AMF豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)與采樣季節(jié)、植被蓋度、植被多樣性和土壤含水量呈顯著負相關(guān)，與土壤有機質(zhì)呈顯著正相關(guān)。

圖5　不同季節(jié)AMF物種豐富度(A、B)和多樣性指數(shù)(C、D)的稀疏曲線Fig.5　Rarefaction curves of AMF richness (A and B) and diversity (C and D) in different seasons

A. pH；B. 速效氮；C. 速效磷； D. 土壤有機質(zhì)；E. 土壤含水量；F. 植物Shannon-Wiener多樣性指數(shù)；G. 植被蓋度；H. 采樣季節(jié)圖6　AMF豐富度和多樣性與采樣季節(jié)、土壤和植被因子RDA分析圖A. pH; B. Available N; C. Available P; D. Soil organic matter; E. Soil moisture content; F. Shannon-Wiener index; G. Plant coverage; H. Sampling seasonsFig.6　RDA ordination plot showed the relationships between AMF richness and diversity, sampling seasons, soil and plant factors

另外，利用Mantel test分析AMF群落組成、孢子密度和菌根侵染率與采樣季節(jié)、土壤和植被因子之間的關(guān)系(表4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：土壤有機質(zhì)含量顯著影響AMF群落組成、孢子密度和菌根侵染率；采樣季節(jié)顯著影響AMF群落組成和菌根侵染率；土壤含水量、植物多樣性和植被蓋度顯著影響AMF群落組成；采樣季節(jié)是影響AMF群落組成和菌根侵染率的主導因子，土壤有機質(zhì)是影響孢子密度的主導因子。

3　討　論

本研究利用Illumina MiSeq測序技術(shù)首次探討了內(nèi)蒙古大青山干旱陽坡灌木鐵線蓮根圍AMF群落季節(jié)動態(tài)。雖然引物具有特異性，仍檢測到一些不屬于球囊菌門的序列，但AMF實測OTUs數(shù)、Chao 1豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Invsimpson多樣性指數(shù)的稀疏曲線均基本上達到平緩期，說明本研究得到的AMF豐富度和多樣性能很好地描述不同季節(jié)的AMF。本研究共檢測到AMF序列204 122條和163 OTUs，明顯高于使用焦磷酸測序和相同引物得到的結(jié)果[24-25]，這可能與Illumina MiSeq測序具有較高的測序深度和產(chǎn)生較低的錯配序列有關(guān)，同時也表明灌木鐵線蓮根圍土壤中蘊含著豐富的AMF資源。

表4　AMF群落、孢子密度和菌根侵染率與采樣季節(jié)、土壤和植被因子之間關(guān)系的Mantel test分析Table 4　Relationships of AMF community, spore density and colonization rate with sampling seasons, soil and plant factors by Mantel test

春季AMF豐富度和多樣性顯著高于夏季和秋季，而夏季和秋季AMF豐富度和多樣性差異并不顯著，這可能與采樣時灌木鐵線蓮所處物候期有關(guān)。宿主植物是AMF碳水化合物提供者，對于AMF具有重要影響。植物不同生長階段，其對碳水化合物的需求會有所差異，從而間接影響AMF群落。春季為灌木鐵線蓮營養(yǎng)生長階段(生長期)，隨著植物葉片的增多，光合作用產(chǎn)物會逐漸超過植物地上部分生長的需求，流動到根部的碳水化合物會增多，從而維持較高的AMF豐富度和多樣性。隨著季節(jié)的變化，植物進入生殖生長階段(開花期和結(jié)實期)。研究發(fā)現(xiàn)，植物開花期和結(jié)實期比生長期需要更多的碳水化合物[26-28]，這時大量的碳水化合物被運送到正在發(fā)育的生殖器官，加之根部對碳水化合物的競爭力最弱[29]，導致運送到根部的碳水化合物大大減少，使AMF豐富度和多樣性降低。此外，與夏季和秋季相比，春季土壤溫度較低，而較低的土壤溫度會降低植物直接從土壤中吸收養(yǎng)分的速率[30]，土壤溫度在10℃時，AMF能夠促進植物對養(yǎng)分的吸收[31]，這也可能是導致春季AMF豐富度和多樣性較高的原因之一。從春季到秋季，灌木鐵線蓮根系A(chǔ)MF侵染率和叢枝豐度呈下降趨勢。據(jù)報道，Zangaro等[9]發(fā)現(xiàn)巴西南部地區(qū)的熱帶雨林植物AMF侵染率在春季和夏季高于秋季，劉永俊等[10]發(fā)現(xiàn)檸條(Caraganakorshinskii)AMF侵染率從春季至秋季呈下降趨勢，叢枝豐度呈上升趨勢；Hazard等[32]發(fā)現(xiàn)黑麥草(Loliumperenne)最低的AMF侵染率和叢枝豐度均出現(xiàn)在春季，出現(xiàn)這些結(jié)果的原因可能與相關(guān)研究的宿主植物種類不同有關(guān)。

本研究的RDA和Mantel test結(jié)果表明，影響灌木鐵線蓮根圍AMF群落的主導因子是采樣季節(jié)。在其它地區(qū)，Santos-gonzalez等[11]發(fā)現(xiàn)季節(jié)變化不會影響瑞典草原生態(tài)系統(tǒng)的夏枯草(Prunellavulgaris)和蝶須(Antennariadioica)根系A(chǔ)MF群落組成；而在蘇格蘭的草原生態(tài)系統(tǒng)，Vandenkoornhuyse等[33]則發(fā)現(xiàn)采樣季節(jié)顯著影響絲狀剪股穎(Agrostiscapillaris)和白三葉(Trifoliumrepens)根圍AMF群落組成；在半干旱生態(tài)系統(tǒng)，劉永俊等[10]指出檸條根系3個季節(jié)的AMF群落組成和多樣性指數(shù)均有一定的差異。這些不同的研究結(jié)果表明，生態(tài)系統(tǒng)及宿主植物均可能會影響采樣季節(jié)與AMF豐富度、多樣性和群落組成間的關(guān)系。本研究中，土壤含水量與AMF豐富度和多樣性呈顯著負相關(guān)，可能原因是隨著土壤含水量的下降，植物需要依賴更多的AMF來增強自身對于干旱環(huán)境的適應性，這是植物應對環(huán)境惡化的一種有效生態(tài)策略；土壤有機質(zhì)與AMF豐富度和多樣性呈顯著正相關(guān)，并且是影響AMF孢子密度的主導因素，這與Yang等[34]的研究結(jié)果一致。此外，本研究中，植被蓋度和植物多樣性與AMF豐富度和多樣性呈顯著負相關(guān)，這與前人的研究結(jié)果則相反，如異葉青蘭(Dracocephalumheterophyllum)和多枝黃耆(Astragaluspolycladus)根系A(chǔ)MF豐富度與植被蓋度呈顯著正相關(guān)[35]，植物多樣性與長葉車前(Plantagolanceolata)根系A(chǔ)MF多樣性呈顯著正相關(guān)[36]。所以，在季節(jié)變化主導下的多種非生物因素和生物因素的綜合作用影響著AMF群落。

綜上所述，本研究利用Illumina MiSeq測序技術(shù)首次探討了內(nèi)蒙古大青山干旱陽坡灌木鐵線蓮根圍AMF群落的季節(jié)動態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)夏季和秋季AMF豐富度、多樣性和群落組成無顯著差異，但AMF豐富度和多樣性顯著低于春季，群落組成與春季也存在顯著差異，可能與灌木鐵線蓮物候有很大關(guān)聯(lián)；季節(jié)是影響AMF群落和根系侵染率的主導因子，而影響孢子密度的主導因子是土壤有機質(zhì)。研究結(jié)果為進一步探索灌木鐵線蓮-AMF共生體對不同季節(jié)環(huán)境變化的響應提供了理論依據(jù)。但當前的研究僅關(guān)注灌木鐵線蓮生長季節(jié)的AMF群落季節(jié)動態(tài)，那么在溫度較低的冬季，其根圍AMF群落組成是怎樣的,AMF對灌木鐵線蓮在內(nèi)蒙古大青山地區(qū)寒冷冬季的生存發(fā)揮怎樣的作用,是未來應當關(guān)注的問題。

[1]SMITH S E, SMITH F A. Fresh perspectives on the roles of arbuscular mycorrhizal fungi in plant nutrition and growth[J].Mycologia, 2012, 104(1): 1-13.

[2]LI T, LIN G, ZHANG X,etal. Relative importance of an arbuscular mycorrhizal fungus (Rhizophagusintraradices) and root hairs in plant drought tolerance[J].Mycorrhiza, 2014, 24(8): 595-602.

[3]RUIZ-LOZANO J M, PORCEL R, AROCA R. Evaluation of the possible participation of drought-induced genes in the enhanced tolerance of arbuscular mycorrhizal plants to water deficit[M]. Berlin Heidelberg: Springer, 2008: 185-205.

[4]LI X L, ZHANG J L, GAI J P,etal. Contribution of arbuscular mycorrhizal fungi of sedges to soil aggregation along an altitudinal alpine grassland gradient on the Tibetan Plateau[J].EnvironmentalMicrobiology, 2015,17(8): 2 841-2 857.

[5]HELGASON T, MERRYWEATHER J, DENSION J,etal. Selectivity and functional diversity in arbuscular mycorrhizas of co-occurring fungi and plants from a temperate deciduous woodland[J].JournalofEcology, 2002, 90(2): 371-384.

[6]ZHAO R X, GUO W, BI N,etal. Arbuscular mycorrhizal fungi affect the growth, nutrient uptake and water status of maize (ZeamaysL.) grown in two types of coal mine spoils under drought stress[J].AppliedSoilEcology, 2015, 88: 41-49.

[7]BAINARD L D, BAINARD J D, Hamel C,etal. Spatial and temporal structuring of arbuscular mycorrhizal communities is differentially influenced by abiotic factors and host crop in a semi-arid prairie agroecosystem[J].FEMSMicrobiologyEcology, 2014, 88(2): 333-344.

[8]HEWINS C R, CARRINO-KYKER S R, Burke D J. Seasonal variation in mycorrhizal fungi colonizing roots ofAlliumtricoccum(wild leek) in a mature mixed hardwood forest[J].Mycorrhiza, 2015, 25(6): 469-483.

[9]ZANGORA W, ROSTIROLA L V, de SOUZA P B,etal. Root colonization and spore abundance of arbuscular mycorrhizal fungi in distinct successional stages from an Atlantic rainforest biome in southern Brazil[J].Mycorrhiza, 2013, 23(3): 221-233.

[10]劉永俊, 鄭紅, 何雷, 等. 檸條根系中叢枝菌根真菌的季節(jié)性變化及影響因素[J]. 應用生態(tài)學報, 2009, 20(5): 1 085-1 091.

LIU Y J, ZHENG H, HE L,etal. Seasonal variation and related affecting factors of arbuscularmycorrhizal fungi inCaraganakorshinskiiroots[J].ChineseJournalofAppliedEcology, 20(5): 1 085-1 091.

[11]SANTOS-GONZALEZ J C, FINALAY R D, TEHLER A. Seasonal dynamics of arbuscular mycorrhizal fungal communities in roots in a seminatural grassland[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 2007, 73(17): 5 613-5 623.

[12]PRINGLE A, BEVER J D. Divergent phenologies may facilitate the coexistence of arbuscular mycorrhizal fungi in a North Carolina grassland[J].AmericanJournalofBotany, 2002, 89(9): 1 439-1 446.

[13]SENES-GUERRERO C, TORRES-CORTE G, PFEIFFER S,etal. Potato-associated arbuscular mycorrhizal fungal communities in the Peruvian Andes[J].Mycorrhiza, 2014, 24(6): 405-417.

[14]CUENCA G, LOVERA M. Seasonal variation and distribution at different soil depths of arbuscular mycorrhizal fungi spores in a tropical sclerophyllous shrubland[J].Botany, 2010, 88(1): 54-64.

[15]馬毓泉. 內(nèi)蒙古植物志(第2卷)[M]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古人民出版社, 1989.

[16]魯如坤. 土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科技出版社, 2000.

[17]LI X L, GEORGE E, MARSCHNER H. Phosphorus depletion and pH decrease at the root-soil and hyphae-soil interfaces of VA mycorrhizal white clover fertilized with ammonium[J].NewPhytologist, 1991, 119(3): 397-404.

[18]MCGONIGLE T, MILLER M, EVANS D,etal. A new method which gives an objective measure of colonization of roots by vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi[J].NewPhytologist, 1990, 115(3): 495-501.

[19]SATO K, SUYAMA Y, SAITO M,etal. A new primer for discrimination of arbuscular mycorrhizal fungi with polymerase chain reaction-denature gradient gel electrophoresis[J].GrasslandScience, 2005, 51: 179-181.

[20]MAGOC T, SALZBERG S L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies[J].Bioinformatics, 2011, 27(21): 2 957-2 963.

[21]SCHMIEDER R, EDWARDS R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets[J].Bioinformatics, 2011, 27(6): 863-864.

[22]HAO X L, JIANG R, CHEN T. Clustering 16S rRNA for OTU prediction: a method of unsupervised Bayesian clustering[J].Bioinformatics, 2011, 27(5): 611-618.

[23]?PIK M, VANATOA A, VANATOA E,etal. The online database MaarjAM reveals global and ecosystemic distribution patterns in arbuscular mycorrhizal fungi (Glomeromycota) [J].NewPhytologist, 2010, 188(1): 223-241.

[24]GEEL M, CEUSTERMANS A, HEMELRIJCK W,etal. Decrease in diversity and changes in community composition of arbuscular mycorrhizal fungi in roots of apple trees with increasing orchard management intensity across a regional scale[J].MolecularEcology, 2015, 24(4): 941-952.

[25]LIN X G, FENG Y Z, ZHANG H Y,etal. Long-term balanced fertilization decreases arbuscular mycorrhizal fungal diversity in an arable soil in North China revealed by 454 pyrosequencing[J].EnvironmentalScience&Technology, 2012, 46(11): 5 764-5 771.

[26]INGLESE P, BARBERA G, LA MANTIA T. Seasonal reproductive and vegetative growth patterns and resource allocation during cactus pear fruit growth[J].HortScience, 1999, 34(1): 69-72.

[27]PARSONS A, ROBSON M. Seasonal changes in the physiology of S24 perennial ryegrass (LoliumperenneL.) 3. Partition of assimilates between root and shoot during the transition from vegetative to reproductive growth[J].AnnalsofBotany, 1981, 48(5): 733-744.

[28]楊高峰, 賀曉, 易津. 華北駝絨藜種子發(fā)育期各器官間碳水化合物的再分配[J]. 草業(yè)學報, 2013, 22(4): 327-333.

YANG G F, HE X, YI J. Allocation of carbohydrate during seed development ofCeratoidesarboresens[J].ActaPrataculturaeSinica, 2013, 22(4): 327-333.

[29]WARDLAW I F. Tansley Review No. 27 The control of carbon partitioning in plants[J].Newphytologist, 1990, 116(3): 341-381.

[30]PREGITZER K, KING J. Effects of soil temperature on nutrient uptake[M]. Berlin Heidelberg: Springer, 2005, 277-310.

[31]BARRETT G, CAMPBEL C, FITTER A,etal. The arbuscular mycorrhizal fungusGlomushoican capture and transfer nitrogen from organic patches to its associated host plant at low temperature[J].AppliedSoilEcology, 2011, 48(1): 102-105.

[32]HAZARD C, BOOTS B, KEITH AM,etal. Temporal variation outweighs effects of biosolids applications in shaping arbuscular mycorrhizal fungi communities on plants grown in pasture and arable soils[J].AppliedSoilEcology, 2014, 82: 52-60.

[33]VANDENKOOMHUYSE P, HUSBAND R, DANIELL T,etal. Arbuscular mycorrhizal community composition associated with two plant species in a grassland ecosystem[J].MolecularEcology, 2002, 11(8): 1 555-1 564.

[34]YANG H S, YUAN Y G, ZHANG Q,etal. Changes in soil organic carbon, total nitrogen, and abundance of arbuscular mycorrhizal fungi along a large-scale aridity gradient[J].Catena, 2011, 87(1): 70-77.

[35]LIU Y J, HE J X, SHI G X,etal. Diverse communities of arbuscular mycorrhizal fungi inhabit sites with very high altitude in Tibet Plateau[J].FEMSMicrobiologyEcology, 2011, 78(2): 355-365.

[36]JOHNSON D, VANDENKOORNHUYSE P J, LEAKE J R,etal. Plant communities affect arbuscular mycorrhizal fungal diversity and community composition in grassland microcosms[J].NewPhytologist, 2004, 161(2): 503-515.

(編輯:裴阿衛(wèi))

Seasonal Dynamics of Arbuscular Mycorrhizal Fungal Community in the Rhizosphere ofClematisfruticosain the Daqingshan Mountains, Inner Mongolia

LIU Min1, ZHENG Rong2, BAI Shulan1*, QING Yun2, YAN Wei3, JIA Xuewen3

(1 College of Forestry, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China; 2 College of Life Science and Technology, Inner Mongolia Normal University, Hohhot 010022, China; 3 Institute of Forestry and Sand Science of Ordos, Ordos ,Inner Mongolia 017000, China)

With the method of Illumina MiSeq sequencing, we investigated the seasonal dynamics of arbuscular mycorrhizal fungal community in the rhizosphere ofClematisfruticosain the arid sunny slopes of the Daqingshan Mountains. By the methods of redundancy analysis (RDA) and Mantel test, we also analyzed the relationships between AMF and soil and plant factors. It would provide important scientific basis to further discuss the response ofC.fruticosa-AMF symbioses to climate changes in different seasons. The results indicated that: (1) Spore density of AMF was no significant difference among seasons, but colonization rate and arbuscule abundance of AMF had a decreasing trend from spring to autumn. (2) A total of 163 AMF OTUs (operational taxonomic units) were detected in three seasons, 116 OTUs, 76 OTUs and 70 OTUs were detected in spring, summer and autumn, respectively. (3) AMF richness (Observed OTUs and Chao 1 index) and diversity (Shannon-Wiener index and Invsimpson index) of summer and autumn were significantly lower than that of spring, but there were no significant differences between summer and autumn. (4) Principal coordinate analysis and PERMANOVA analyses indicated that AMF community compositions of summer and autumn were significantly different from that of spring, while the difference was not significant in summer and autumn. (5) RDA analysis showed that sampling season, plant coverage, plant diversity, soil moisture content and soil organic matter significantly influenced Shannon-Wiener index, Invsimpson index, Chao 1 index and Observed OTUs of AMF. Mantel test indicated that sampling season was the driving factor to affect community composition and colonization rate of AMF, but had no significantly influence on spore density, soil organic matter was the driving factor to influence spore density.

Clematisfruticosa; arbuscular mycorrhizal fungi; seasonal dynamics; Illumina MiSeq sequencing

1000-4025(2016)09-1891-09doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1891

2016-06-12;修改稿收到日期:2016-08-21

國家自然科學基金(31360125)

劉敏(1989-)，女，在讀博士研究生，主要從事菌根生物技術(shù)研究。E-mail:liumin19890110@yeah.net

白淑蘭，博士，教授，主要從事菌根生物技術(shù)研究。E-mail:baishulan2004@163.com

Q939.96; Q938.1

A