張　燃

（寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院銀川750021）

與Aβ42結(jié)合的噬菌體展示多肽的淘選△

張燃

（寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院銀川750021）

阿茲海默癥（Alzheimer’s disease,AD），即老年癡呆，是一種十分常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，β-淀粉樣蛋白（Aβ）在細(xì)胞外異常聚集、沉積是其致病機(jī)制之一。目的：篩選與Aβ42集合的噬菌體多肽。方法：本實驗以Aβ42寡聚體為靶蛋白，對隨機(jī)環(huán)形噬菌體七肽庫進(jìn)行篩選，對于篩選的結(jié)果用酶聯(lián)免疫吸附試驗進(jìn)行驗證。結(jié)果：得到200株噬菌體克隆，全部為陽性并且部分與Aβ42的結(jié)合力極強(qiáng)。結(jié)論：通過對隨機(jī)環(huán)形噬菌體七肽庫篩選可得到與靶蛋白（Aβ42）結(jié)合的噬菌體陽性克隆，理論上這些陽性噬菌體所展示的多肽可以作為配體與Aβ42（受體）結(jié)合，而這種結(jié)合則有可能影響Aβ42寡聚體的聚集和沉淀，從而為阿茲海默癥的治療提供某些支持。

阿茲海默癥 β-淀粉樣蛋白 生物淘選

阿茲海默癥（Alzheimer’s disease,AD），即老年癡呆，是一種十分常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。AD主要有三大病理特征[2，3]，分別為老年斑（Senile plaque，SP），神經(jīng)元纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangles，NFT）以及由退行性突觸病變和神經(jīng)元死亡造成的廣泛性腦萎縮。其中老年斑主要分布于大腦皮質(zhì)和基底神經(jīng)節(jié)等處，其斑塊主要是由β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）在細(xì)胞外異常聚集、沉積而形成的。目前，AD的病因和致病機(jī)制仍然沒有被完全闡明，主要有Aβ學(xué)說、TAU蛋白異常磷酸化學(xué)說、神經(jīng)凋亡學(xué)說等，其中Aβ學(xué)說逐漸占據(jù)主流地位。

1　材料

1.1環(huán)形七肽庫及所用菌株：Ph.D.-C7CTM環(huán)肽庫購自New England Biolabs、大腸桿菌ER2738。

1.2主要試劑及儀器

1.2.1主要試劑及培養(yǎng)基：噬菌體表面衣殼蛋白Ⅲ展示隨機(jī)環(huán)形七肽庫（Ph.D.-C7C Phage Peptide Library）試劑盒、異丙基-β-D硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-8000、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopy，X-gal）、六氟異丙醇（HFIP）、二甲基亞砜（DMSO）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、Tween-20、蛋白胨、酵母粉、聚苯乙烯小皿、酶聯(lián)免疫吸附板、牛血清白蛋白（BSA）、TMB顯色底物。

1.2.2主要儀器：①KQ3200B型超聲波清洗器；②Infinite F200型酶標(biāo)儀；③數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱；④磁力攪拌器；⑤超凈工作臺；⑥ZS-3板式酶標(biāo)儀；⑦電子天平；⑧pH計；⑨全自動滅菌鍋；⑩水平搖床；輥輯訛冷凍離心機(jī)。

2　實驗方法

2.1蛋白處理：Aβ42：用20mMpH 7.2的PBS溶至25μM，孵育得到寡聚體。

2.2噬菌體隨機(jī)七肽庫與結(jié)合Aβ寡聚體多肽的生物淘選

2.2.1分別將1.5mL，5％的BSA溶劑加至聚苯乙烯小皿A、B中，4℃包被過夜，備用。

2.2.2按以上方法制備Aβ42寡聚體，分別取已制備好的Aβ4240μg稀釋于1.5mLTBS中，分別加至聚乙烯平皿C、D中，4℃包被2h，分別加入1.5mL，5％的BSA，37℃封閉2h，備用。

2.2.3棄掉聚苯乙烯皿A中的包被液后，將平板倒置于干凈的紙巾上用力拍甩，以去除殘余溶液。取1.5mLEP管，將10μL環(huán)形七肽庫（噬菌體個數(shù)為2×1011個病毒子），稀釋于1.1mL TBS中，均勻鋪開至平皿A中，室溫溫和搖動1h，將A皿中的液體移至B皿中，繼續(xù)室溫溫和搖動1h。棄掉聚苯乙烯皿C中的蛋白溶液，將B皿中的液體移至C皿中，室溫溫和搖動2h，t棄去D皿中的蛋白液體，將C皿中的液體移至D皿中，室溫溫和搖動2h。

2.2.4棄掉D皿中未結(jié)合的噬菌體，再用TBST（TBS+0.1％ Tween-20）緩沖液快速洗板10次。每次均旋轉(zhuǎn)以使板或孔的底部及邊緣都被洗到，傾去緩沖液，倒置在干凈紙巾上拍甩以除去殘余溶液。

2.2.5用1mL 0.2M Glycine-HCl（pH2.2），洗脫已結(jié)合的分子，溫和振動20min。

2.2.6洗脫液吸入另一干凈EP管，迅速用150μL 1M Tris-HCl（pH9.1）中和。洗脫物4℃貯存過夜。挑取ER2738單克隆（噬菌體滴度測定時鋪的板）于5mL LB液體培養(yǎng)基中，加5μL四環(huán)素，37℃10000rpm震蕩培養(yǎng)過夜。

2.2.7將過夜菌加入5mLLB液體培養(yǎng)基中，加5μL四環(huán)素，37℃10000rpm震蕩培養(yǎng)2.5h至細(xì)菌對數(shù)期。將洗脫物，20μL四環(huán)素和200μL的對數(shù)期菌加入20mL LB培養(yǎng)基中。37℃搖動培養(yǎng)4.5h。

2.2.8將培養(yǎng)得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)到一離心管中，4℃10000rpm，離心15min。將離心得到的上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，同樣條件，離心5min。

2.2.9取80％的上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，加入1/6～1/4體積的PEG/NaCl。4℃冰浴8h。

2.2.10冰浴后，繼續(xù)4℃，10000rpm，離心15min。將上清液小心倒去，再相同條件下離心5min，棄去殘留上清。

2.2.11將下部沉淀重懸于1mLTBS中，4℃離心5min，沉淀細(xì)胞殘片。

2.2.12沉淀物重懸于200μL TBS,0.02％NaN3中。此即為擴(kuò)增后的洗脫物，4℃貯存。

2.2.13用LB/IPTG/Xgal平板滴定擴(kuò)增后的洗脫物。從LB-Tet平板上挑ER2738單菌落于5mL LB培養(yǎng)基中，另加5μL四環(huán)素，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，1∶100轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基中，另加5μL四環(huán)，37℃振蕩培養(yǎng)2h至對數(shù)中期（OD600值約0.5）。同時，用電磁爐融化頂層瓊脂，按照3mL每等分分裝與多個滅菌試管中，保存于55℃?zhèn)溆?。提?7℃預(yù)溫LB/IPTG/Xgal平板，每一個噬菌體滴度準(zhǔn)備兩個平板。在LB培養(yǎng)基中稀釋噬菌體達(dá)所測的滴度。擴(kuò)增后的噬菌體培養(yǎng)物：108-1011；未擴(kuò)增的淘選洗脫物：101-104。

對數(shù)菌搖好后，每等分200μL分與1.5mLEP管中，每個噬菌體稀釋滴度一管。每管分別加入10μL不同滴度的稀釋好的噬菌體，吹吸混勻，室溫孵育5min。將侵染好噬菌體的菌液快速加入到預(yù)溫的3mL頂層瓊脂中，快速混勻，立刻將其平鋪于37℃預(yù)溫的LB/IPTG/Xgal平板上。待平板冷卻5min后，用封口膜包好，37℃，倒置培養(yǎng)過夜。10h后，觀察平板，選擇有約102個噬菌斑的平板計數(shù)并算得噬菌體滴度。

2.2.14如果滴度合適，再次制備Aβ42寡聚體，取30μg稀釋于1.5mLTBS中，4℃包被2h于另一小皿中，之后加入1.5mL，5％的BSA，37℃封閉2h，為第二輪篩選備用。在進(jìn)行第二輪淘選時，加入2×1011pfu的噬菌體，將Tween的濃度增至0.3％（v/v）。在LB/ IPTG/Xgal平板上測定第二輪淘選所得洗脫物擴(kuò)增后的滴度。再以同樣的方法，用15μg Aβ42寡聚體包被一個皿準(zhǔn)備第三輪淘選時用。

2.2.15第三輪淘選：按照其第二輪擴(kuò)增后的噬菌體滴度，加入2×1011pfu的噬菌體，使用0.7％（v/v）的Tween20進(jìn)行清洗。同樣方法測得第三輪擴(kuò)增后的噬菌體滴度。如果滴度合適，再包被一個小皿為第四輪淘選備用。

2.2.16第四輪淘選：同樣方法淘選并測定第四輪洗脫后的滴度。滴度合適，便不必再擴(kuò)增，滴度測定時得到的噬菌斑可做DNA測序用，其余洗脫物4℃貯存。

2.3噬菌體單克隆的挑取及擴(kuò)增：①準(zhǔn)備ER2738過夜菌，然后利用過夜菌制備對數(shù)菌。②根據(jù)第四輪洗脫后所測定的噬菌體滴度，選取適當(dāng)?shù)谋壤?02pfu/10μL）進(jìn)行涂板，同時涂3-4個平板，37℃溫箱培養(yǎng)12h。準(zhǔn)備LB培養(yǎng)基，按100∶1加入對數(shù)菌，1000∶1加入TET，搖勻后，分別加入到滅菌試管中，每個試管1mL。③待噬菌斑長出后，開始挑取單個的噬菌斑于各個試管中，37℃搖床上培養(yǎng)4.5h。④分別將擴(kuò)增好的噬菌體轉(zhuǎn)移至1.5mL的EP管中，做好編號，4℃，13000rpm離心15min,棄沉淀。⑤將上清轉(zhuǎn)移至新EP管中，加入總體積1/5的PEG/NaCL, 4℃靜置2h，4℃，13000rpm離心15min，噬菌體便沉淀于管底。⑥小心抽去上清液體，將沉淀得到的噬菌體重懸于120μL的TBS中，以備后續(xù)實驗。

2.4ELISA鑒定噬菌體陽性克?。喊辞懊嫠v的方法制備Aβ42寡聚體，以1μg/孔的濃度包被ELISA板同時以50μL的PBS設(shè)置對照孔，置4℃過夜。棄去孔中的溶液，每孔加入3％的BSA 280μL，置37℃溫箱中2個小時。棄去孔中的溶液，用20mM的PBS緩沖液輕輕涮一下，將之前制備好的單克隆噬菌體進(jìn)行編號，各取10μL稀釋于50μLTBS中，加于每孔，置37℃溫箱中2個小時。棄去孔中的溶液，用0.3％的洗滌緩沖液PBST洗6遍，每次1分鐘，輕拍。加入用3％的BSA稀釋的HRP-抗M13噬菌體抗體（1∶5000），每孔各加入50μL，置37℃溫箱中2個小時。棄去孔中的溶液，用0.1％的洗滌緩沖液PBST洗6遍，輕拍。加入TMB避光顯色10分鐘后觀察。于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸50μL。在酶標(biāo)儀上以450nm測各孔OD值。實驗重復(fù)3次。

3　實驗結(jié)果

淘選一共進(jìn)行了四輪，四輪淘選的結(jié)果分別為：第一輪：未擴(kuò)增的淘選洗脫物：102，擴(kuò)增后的噬菌體培養(yǎng)物：108；第二輪：未擴(kuò)增的淘選洗脫物：102，擴(kuò)增后的噬菌體培養(yǎng)物：108；第三輪：未擴(kuò)增的淘選洗脫物：103，擴(kuò)增后的噬菌體培養(yǎng)物：109；第四輪：未擴(kuò)增的淘選洗脫物：103，擴(kuò)增后的噬菌體培養(yǎng)物：1010，符合此淘選試驗的試驗指導(dǎo)：未擴(kuò)增的淘選洗脫物：101-104；擴(kuò)增后的噬菌體培養(yǎng)物滴度應(yīng)在：108-1011。接下來通過稀釋涂布平板的方法挑取了200株噬菌體單克隆并擴(kuò)增，之后用Aβ42寡聚體通過ELISA對這200株噬菌體單克隆進(jìn)行陽性驗證試驗，從結(jié)果可看出：篩選出來的200株噬菌體單克隆，均為陽性克隆，部分結(jié)果如下圖所示：

其中編號為3、7、12、19、32、33、49、54、59、62、76、79、94、103、121、150、163、185、192、197的噬菌體陽性克隆與Aβ42寡聚體蛋白結(jié)合的能力極強(qiáng)。至此與Aβ42寡聚體結(jié)合的噬菌體展示多肽被成功淘選出來。

4　討論

噬菌體環(huán)形肽庫篩選是基于噬菌體展示的一項篩選技術(shù)，它利用噬菌體的衣殼蛋白可以很好的表達(dá)外源蛋白這一原理，將大量的外源的蛋白融合表達(dá)于噬菌體表面，通過生物淘選獲得與目標(biāo)靶蛋白結(jié)合的配體。

Aβ為β淀粉樣蛋白前體蛋白（β-APP）的異常水解產(chǎn)物，它含有40-42個氨基酸，即Aβ40或Aβ42[4]，分子量約為4kD。Aβ可溶性的單體及不溶性的大纖維被認(rèn)為毒性較弱，可溶性寡聚體（為2-20個左右單體構(gòu)成的寡聚體）是最主要的毒性形式[5]。而由Aβ特異性聚集、沉淀引起的主要毒性機(jī)制則包括了：氧化應(yīng)激、線粒體損傷、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、炎癥反應(yīng)、Tau蛋白的異常磷酸化和NFT的形成等。

本實驗以Aβ42寡聚體為把蛋白，通過對Ph.D.-C7C噬菌體庫的淘選，我們成功得到了200株噬菌體陽性克隆。其中部分陽性克隆與Aβ42寡聚體結(jié)合力極強(qiáng)，理論上這部分噬菌體陽性克隆所展示的外殼蛋白多肽應(yīng)該是可以與Aβ42寡聚體結(jié)合的。

后續(xù)仍有很多驗證工作要做，首先是對于這20株噬菌體陽性克隆提取DNA，進(jìn)行測序并且對測序結(jié)果進(jìn)行同源性比對。其次挑選出同源性較高的氨基酸序列，按照其組成來體外合成蛋白多肽。最后需要驗證這些蛋白多肽是否與Aβ42寡聚體結(jié)合以及其結(jié)合力的高低結(jié)。這些蛋白多肽一旦與Aβ42寡聚體結(jié)合就很有可能影響淀粉樣蛋白的異常聚集、沉淀、細(xì)胞毒性等生物學(xué)特性，這樣便給利用多肽制劑或藥物治療AD提供一些理論上的支持。

[1]Cummings JL（2004）Alzheimer's disease.N Engl J Med 351: 56-67.

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[4]盛樹立.老年性癡呆及相關(guān)疾病[M].科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2003：3-10.

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△寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院（或?qū)幭膹V播電視大學(xué)）科研發(fā)展基金資助

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1672-8351（2016）10-0126-02