陳泉，卓燕玲，許愛(ài)娜，咸漠，彭馨瑩，楊元生，張海波，年銳，張巍

1 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所 中國(guó)科學(xué)院生物基材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島　266101

2 新加坡科技研究局生物處理科技研究院，新加坡　138668

研究報(bào)告

蛋白A親和層析法純化單克隆抗體工藝的優(yōu)化

陳泉1，卓燕玲2，許愛(ài)娜2，咸漠1，彭馨瑩1，楊元生2，張海波1，年銳1，張巍2

1 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所 中國(guó)科學(xué)院生物基材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266101

2 新加坡科技研究局生物處理科技研究院，新加坡138668

陳泉，卓燕玲，許愛(ài)娜，等. 蛋白A親和層析法純化單克隆抗體工藝的優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào)，2016，32（6）: 807-818.

Chen Q，Toh P，Hoi A，et al. Improved protein-A chromatography for monoclonal antibody purification. Chin J Biotech，2016，32（6）: 807-818.

治療性單克隆抗體藥物已成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域市場(chǎng)最主要的產(chǎn)品類(lèi)別。蛋白A親和層析作為第一步捕獲抗體蛋白最為有效的手段仍然在現(xiàn)有單克隆抗體純化平臺(tái)中占據(jù)主導(dǎo)地位。在本研究中，首先開(kāi)發(fā)了一種基于低pH處理抗體細(xì)胞回收液的新型細(xì)胞液回收技術(shù)，該技術(shù)能有效去除宿主相關(guān)污染物 （非組蛋白宿主雜質(zhì)蛋白、組蛋白、DNA、蛋白聚合物等），同時(shí)保證較高的抗體回收率。通過(guò)該技術(shù)有效預(yù)處理后，蛋白A純化效率可提高10倍左右，并且有效避免了抗體洗脫液中和后濁度的上升，大大減輕了后續(xù)蛋白純化的壓力。同時(shí)我們也對(duì)酸性處理中各種宿主雜質(zhì)去除機(jī)制進(jìn)行了研究。然后，預(yù)處理的洗脫液再經(jīng)一步Capto adhere色譜純化，非組蛋白宿主雜質(zhì)蛋白降低至5 ppm、DNA小于1 ppb、組蛋白降低至檢測(cè)限以下、蛋白聚合物小于0.01%?？傔^(guò)程抗體蛋白收率87%。該兩步法抗體純化技術(shù)可有效集成至當(dāng)前主流抗體純化平臺(tái)，具有良好的大規(guī)模應(yīng)用價(jià)值。

蛋白A，單克隆抗體，純化，細(xì)胞回收液，酸性沉淀，宿主雜質(zhì)蛋白，組蛋白，DNA

Chinese Journal of Biotechnology

http://journals.im.ac.cn/cjbcn

June 25，2016，32（6）: 807-818

?2016 Chin J Biotech，All rights reserved

1986年，世界首個(gè)單克隆抗體 （Monoclonal antibody，簡(jiǎn)稱(chēng)單抗）獲得美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局的上市批準(zhǔn)，拉開(kāi)了單抗藥物發(fā)展的序幕，成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域中最耀眼的明珠。該類(lèi)藥物具有靶向性強(qiáng)、特異性高和毒副作用低等特點(diǎn)，代表了藥品治療領(lǐng)域最新發(fā)展方向［1-4］。目前全球醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)正快速走向精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，靶向藥物單抗正是其中最為成熟的領(lǐng)域，仍將是繼續(xù)引領(lǐng)生物制藥發(fā)展最為重要的驅(qū)動(dòng)力。

單抗藥物通常是由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cell，簡(jiǎn)稱(chēng)CHO細(xì)胞）表達(dá)產(chǎn)生。由CHO細(xì)胞分泌的這些高價(jià)值蛋白分子，通過(guò)一系列純化過(guò)程實(shí)現(xiàn)由細(xì)胞培養(yǎng)液中回收［5］。隨著單抗生產(chǎn)上游基因改造、發(fā)酵條件的不斷優(yōu)化，其產(chǎn)量已達(dá)5-10 g/L；但這同時(shí)也大大增加了下游蛋白回收中去除各種宿主雜質(zhì)的負(fù)擔(dān)。此外，宿主雜質(zhì)的組成隨著培養(yǎng)條件的改變呈現(xiàn)出顯著的變化。單抗藥物雜質(zhì)主要包括與產(chǎn)品相關(guān)的污染物和工藝相關(guān)的污染物。與產(chǎn)品相關(guān)污染物包括目標(biāo)分子變異體、聚集體、以及由于不同翻譯后修飾產(chǎn)生的產(chǎn)品變異體或降解產(chǎn)物。與工藝過(guò)程相關(guān)的污染物包括宿主細(xì)胞蛋白 （host cell protein，簡(jiǎn)稱(chēng)HCP）、宿主DNA、化學(xué)添加劑和殘留培養(yǎng)基成分。在所有影響產(chǎn)品質(zhì)量的污染物中，HCP和DNA占絕大多數(shù)。由于在理化性質(zhì)上的差異（分子量、等電點(diǎn)、疏水性以及表面電荷分布等）使得HCP尤其難以有效完全去除，通常需要多個(gè)不同分離機(jī)制的單元處理進(jìn)行分離去除，進(jìn)而消除由任何微量存在的HCP所引起的嚴(yán)重的免疫反應(yīng)［6-8］。

由于對(duì)于最終產(chǎn)品純度、雜質(zhì)量的嚴(yán)格要求 （HCP<100 ppm、DNA<10 ppb等），單抗目前廣泛采用三步純化策略：粗純 （樣品捕獲）、中度純化和精細(xì)純化，該策略工藝復(fù)雜、對(duì)操作要求嚴(yán)格，導(dǎo)致純化成本一般占總生產(chǎn)成本的50%-80%［5］。用蛋白A親和層析凝膠捕獲抗體是大規(guī)模單抗純化的首先步驟，一步純化可使蛋白純度達(dá)95%以上。但蛋白A樹(shù)脂價(jià)格昂貴 （超過(guò)2.2萬(wàn)美元/升，GE報(bào)價(jià)），在大規(guī)模生產(chǎn)中，蛋白A純化步驟的成本占整個(gè)抗體純化成本的35%以上［9-10］。因此，蛋白A純化效率的提高是進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵［11-12］。

本研究通過(guò)分析pH、鹽濃度對(duì)細(xì)胞回收液中各種宿主雜質(zhì)的影響機(jī)制，確立低pH處理抗體細(xì)胞回收液的新型細(xì)胞液回收技術(shù)，提高了后續(xù)蛋白A純化效率，減輕了純化壓力，與Capto adhere色譜純化聯(lián)用，真正實(shí)現(xiàn)兩步法抗體純化平臺(tái)的建立。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)常用試劑均購(gòu)自于Sigma-Aldrich。蛋白A樹(shù)脂MabSelectTMSure，混合型疏水性陰離子交換樹(shù)脂CaptoTMadhere購(gòu)自于GE Healthcare。蛋白A樹(shù)脂Eshmono?A購(gòu)自于Merck Millipore，蛋白A樹(shù)脂ToyopearlTMAF-rProtein A-650 F購(gòu)自于日本Tosoh Bioscience。UNOsphereTMQ陰離子交換樹(shù)脂購(gòu)自于Bio-Rad。以上層析介質(zhì)均填充于XK或TricornTM系列色譜柱。所有色譜實(shí)驗(yàn)均于?KTATMExplorer 100 或 Avant 25 室溫進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

生物仿制單克隆抗體IgG1 （赫賽汀?或Herceptin?）由CHO （DG44，Life Technologies）表達(dá)產(chǎn)生，利用新加坡科技發(fā)展局生物處理科技研究院開(kāi)發(fā)的三順?lè)醋虞d體［13］。抗體由5 L BIOSTAT?B攪拌式玻璃生物反應(yīng)器生產(chǎn)（Sartorius Stedim Biotech），采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式，利用1∶1的無(wú)蛋白培養(yǎng)基CD CHO （Life Technologies）和HyQ PF （GE Healthcare）。30%-50%細(xì)胞活力下收集細(xì)胞液。在室溫、4 000×g條件下離心20 min，之后經(jīng)由0.22 μm濾膜 （Nalgene?Rapid-Flow Filters，Thermo Scientific）過(guò)濾。澄清后細(xì)胞回收液貯存在2-8 ℃以供短期使用或-20 ℃長(zhǎng)期保存。

1.2.2細(xì)胞液預(yù)處理

為研究細(xì)胞液在不同鹽濃度下各種宿主雜質(zhì)的響應(yīng)機(jī)制，細(xì)胞回收液經(jīng)Sartorius Vivaspin 15R 超濾離心管 （2 kDa截留分子量）進(jìn)行緩沖液置換至50 mmol/L MES，pH 6.0。通過(guò)添加NaCl以及1 mol/L醋酸，將細(xì)胞液NaCl濃度以及pH調(diào)整至指定值。測(cè)量濁度后經(jīng)由0.22 μm濾膜濾除沉淀物，進(jìn)行相關(guān)分析。

細(xì)胞液預(yù)處理通過(guò)向細(xì)胞回收液添加1 mol/L醋酸調(diào)節(jié)pH至指定值。經(jīng)由0.22 μm濾膜濾除沉淀物。濾過(guò)液pH由1 mol/L Tris緩沖液調(diào)至中性，進(jìn)行相關(guān)分析或蛋白純化研究。

1.2.3蛋白純化

4 mL蛋白A樹(shù)脂填充于Tricorn 5/10 色譜柱，線(xiàn)性流速300 cm/h （4 mL/min，1 min停留時(shí)間）。色譜柱經(jīng)由5倍柱體積平衡液 （50 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl，pH 7.0）清洗后上樣。3倍柱體積平衡液沖洗，之后由5倍柱體積的50 mmol/L HEPES，1 mol/L NaCl，pH 7.0緩沖液進(jìn)一步?jīng)_洗，之后再經(jīng)2倍柱體積平衡液沖洗去除高濃度NaCl。抗體蛋白最后由5倍柱體積蛋白洗脫液 （100 mmol/L醋酸，pH 3.5）洗脫。在UV 280 nm達(dá)到50 mAU開(kāi)始收集蛋白，當(dāng)UV降至同一值結(jié)束收集。色譜柱由5倍柱體積0.1 mol/L NaOH清洗之后保存在20%乙醇中。收集的蛋白液pH調(diào)至8.0，添加NaCl至1 mol/L。40 mg蛋白上樣至4 mL Capto adhere色譜柱，線(xiàn)性流速300 cm/h。色譜柱經(jīng)由5倍柱體積平衡液 （50 mmol/L Tris，1 mol/L NaCl，pH 8.0）沖洗，之后由10倍柱體積洗脫液（50 mmol/L MES，0.35 mol/L NaCl，pH 6.0）洗脫。蛋白按上述收集方式收集。色譜柱經(jīng)由1 M NaOH清洗后保存在20%乙醇中。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1宿主殘留雜蛋白檢測(cè)

非組蛋白宿主蛋白應(yīng)用ELISA法測(cè)定［14］，使用Generation III CHO HCP試劑盒 （Cygnus Technologies Inc.）。

組蛋白宿主雜質(zhì)由Total H3 Histone 試劑盒 （Active Motif）或PathScan?Total Histone H3 Sandwich ELISA試劑盒 （Cell Signaling Technology Inc.）測(cè)定。組蛋白應(yīng)用如下方法進(jìn)行提?。捍郎y(cè)樣品在200 mmol/L HCl，1.5 mol/L NaCl，0.1% NonidetTMNP 40，0.2%依沙吖啶條件下作用1 h，之后經(jīng)由0.22 μm濾膜過(guò)濾。濾液應(yīng)用UNOsphere Q色譜柱，在50 mmol/L Tris，pH 8.0條件下基于空隙排阻色譜法進(jìn)行純化［14-15］。純化后組蛋白保存于-20 ℃直至檢測(cè)。

1.3.2宿主殘留DNA檢測(cè)

宿主殘留DNA由數(shù)字型PCR儀QX100TMDroplet DigitalTMPCR System （Bio-Rad）測(cè)量。根據(jù)生產(chǎn)廠家推薦的DNA提取以及樣品制備方法進(jìn)行樣品制備［14］。該數(shù)字型PCR儀可用于對(duì)起始樣品DNA的絕對(duì)定量，理論檢測(cè)限為1個(gè)拷貝數(shù)目標(biāo)DNA。

1.3.3蛋白聚合物、濃度測(cè)量

通過(guò)尺寸排阻色譜 （Size exclusion chromatography）進(jìn)行蛋白聚合物的測(cè)量。應(yīng)用G3000SWx色譜柱 （Tosoh Bioscience）在Dionex UltiMateTM3000 UPLC （Thermo Scientific）系統(tǒng)，流速0.6 mL/min，緩沖液50 mmol/L MES，20 mmol/L EDTA，200 mmol/L Arginine，pH 6.0。上樣量為100 μL。非聚合物IgG濃度通過(guò)與已知濃度抗體蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比由SEC測(cè)量。該方法有效避免了應(yīng)用親和層析法對(duì)于吸附蛋白聚合物而造成的IgG濃度錯(cuò)誤高估［14-16］。

1.3.4SDS-PAGE蛋白檢測(cè)

蛋白經(jīng)由還原性或非還原性SDS-PAGE分離，應(yīng)用4%-15% CriterionTMTGX Stain-FreeTMGel （Bio-Rad）蛋白預(yù)制膠。蛋白分離膠由SilverQuestTM試劑盒 （Invitrogen）銀染。

1.3.5濁度測(cè)量

溶液濁度由Orion Q4500 （Thermo Scientific）手持式濁度儀測(cè)量，單位為NTU。

2　結(jié)果與討論

2.1細(xì)胞發(fā)酵液殘留雜質(zhì)分析

單抗細(xì)胞發(fā)酵液經(jīng)過(guò)離心過(guò)濾后通過(guò)高效液相尺寸排阻色譜分離，收集不同保留時(shí)間組分。然后通過(guò)還原型SDS-PAGE凝膠電泳分離各保留時(shí)間組分 （圖1），并利用相應(yīng)手段分析其成分 （圖2）：殘留DNA通過(guò)數(shù)字型PCR測(cè)定，非組蛋白宿主雜質(zhì)蛋白通過(guò)ELISA測(cè)定。需要注意的是，傳統(tǒng)宿主雜質(zhì)檢測(cè)試劑盒不能有效識(shí)別組蛋白 （檢測(cè)量低于萬(wàn)分之一），需通過(guò)組蛋白高效提取分離后通過(guò)組蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

由圖1和2可以看出，蛋白聚集區(qū)域10-12 min左右富集了大量的DNA、組蛋白以及非組蛋白宿主雜質(zhì)，是細(xì)胞回收液中主要污染物的來(lái)源。另外，12-16 min主要成分為IgG，18 min左右為游離的輕鏈 （LC）。

圖1　離心過(guò)濾細(xì)胞上清液通過(guò)尺寸排阻色譜分離之后經(jīng)過(guò)還原型SDS-PAGE凝膠電泳分離Fig. 1　Reduced SDS-PAGE of fractions from SEC cell culture supernatant. Histone identities confirmed by mass spectrometry and Western blotting （data not shown）. Lane 10-18，fractions at 10-18thmin from SEC.

圖2　離心過(guò)濾細(xì)胞上清液通過(guò)尺寸排阻色譜分離，各種組分殘留的分布Fig. 2　SEC of cell culture supernatant showing native size distribution of DNA，histone and non-histone HCP. LC is the abbreviation of light chain.

正如前文所述，由于宿主雜質(zhì)蛋白在理化性質(zhì)如分子量、等電點(diǎn)、疏水性以及表面電荷分布等方面的巨大差異，導(dǎo)致其難以有效完全去除，通常需要多個(gè)不同分離機(jī)制的單元操作交叉進(jìn)行、分離去除，進(jìn)而消除由任何微量存在的宿主雜質(zhì)蛋白所引起的嚴(yán)重的免疫反應(yīng)［6-8］。因此，對(duì)于這些宿主雜質(zhì)蛋白的分析鑒定、探索其對(duì)后續(xù)分離純化的影響機(jī)制一直以來(lái)吸引了科學(xué)家們的巨大興趣。近幾年來(lái)，出現(xiàn)了大量應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合熒光差異雙向電泳技術(shù)（Two dimension difference gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱(chēng)2D-DIGE）、二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Two-dimensional liquid chromatography/tandem mass spectrometry，簡(jiǎn)稱(chēng)2D-LC-MS/MS）等進(jìn)行HCP分析鑒定的研究［17-22］。在這些雜質(zhì)宿主蛋白中，約15%是高酸性蛋白 （等電點(diǎn)低于5），60%屬于酸性偏中性蛋白，不到25%屬于堿性蛋白 （等電點(diǎn)高于8.0）。表達(dá)條件、細(xì)胞液澄清決定HCP的組成，極大影響到下游蛋白純化。對(duì)于這些種類(lèi)繁雜、理化性質(zhì)差別很大的雜質(zhì)的有效前處理是實(shí)現(xiàn)下游高效、簡(jiǎn)便純化、降低生產(chǎn)成本的重要保證。由于一直以來(lái)缺少具有強(qiáng)大吸附或沉淀能力的細(xì)胞液預(yù)處理技術(shù)，這一目標(biāo)很難實(shí)現(xiàn)，而這一領(lǐng)域也成為單抗上、下游的研究熱點(diǎn)［23-24］。

近期有國(guó)外學(xué)者報(bào)道了通過(guò)對(duì)細(xì)胞液的酸性沉淀去除部分宿主雜質(zhì)蛋白［25］，本研究中將進(jìn)一步對(duì)酸性沉淀中各種宿主雜質(zhì)的表現(xiàn)方式進(jìn)行詳細(xì)分析，并研究其對(duì)后續(xù)色譜純化的影響，進(jìn)而建立起更加簡(jiǎn)便的抗體純化平臺(tái)技術(shù)。

圖3　緩沖液pH、鹽濃度 (氯化鈉) 對(duì)細(xì)胞回收液中各種雜質(zhì)以及抗體蛋白、濁度的影響Fig. 3　Solubility of each component in cell culture supernatant and its corresponding turbidity as a function of pH and salt concentration. （A）DNA. （B）Non-histone HCP. （C）Histone. （D）Heteroaggregates. （E）IgG recovery. （F）Turbidity.

2.2緩沖液環(huán)境對(duì)各種宿主雜質(zhì)的影響

基于已報(bào)道實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，我們進(jìn)一步研究了pH和鹽濃度 （主要是NaCl）對(duì)細(xì)胞回收液中各種雜質(zhì)的影響 （圖3A-F）。明確了各種雜質(zhì) （包括組蛋白宿主雜質(zhì)蛋白、非組蛋白宿主雜質(zhì)蛋白、DNA、蛋白聚合物）以及單體抗體蛋白IgG、溶液濁度對(duì)于不同pH、鹽濃度的響應(yīng)方式。從圖3中我們可以明顯看到各種雜質(zhì)均隨著pH的降低而減少，其中DNA和組蛋白的減少最為明顯。DNA和組蛋白在鹽濃度為0、pH為 5.5-6.0左右時(shí)，濃度均降低到檢測(cè)限附近。非組蛋白宿主雜質(zhì)蛋白受pH的影響最小，在最低pH條件下濃度只降低到原來(lái)的40%左右。而隨著鹽濃度的提高，各種雜質(zhì)受pH的影響逐漸減弱。IgG在pH 3.5-4.0損失嚴(yán)重，在pH 4.0以及鹽濃度150 mmol/L （接近細(xì)胞回收液鹽濃度）以上均能保證90%以上回收率 （圖3E）。

伴隨著pH下降，各種雜質(zhì)溶解度下降，造成溶液濁度逐漸上升 （圖3F），在鹽濃度為0時(shí)尤為明顯，隨著鹽濃度的上升，濁度上升逐漸趨緩。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞液中雜質(zhì)，尤其是DNA和組蛋白受環(huán)境pH影響很大，隨著pH下降，溶解度迅速降低，造成濁度上升，然后通過(guò)過(guò)濾能夠?qū)崿F(xiàn)大量雜質(zhì)的有效去除。

細(xì)胞回收液預(yù)處理通過(guò)1 mol/L醋酸調(diào)節(jié)pH至指定值，過(guò)濾去除沉淀物，之后調(diào)整pH至中性進(jìn)行分析或用于后續(xù)蛋白A純化實(shí)驗(yàn)。

為進(jìn)一步研究沉淀組成，上述細(xì)胞液處理后沉淀部分通過(guò)離心分離回收，經(jīng)由非還原性SDS-PAGE分離 （圖4），隨著pH的降低，大量雜質(zhì)蛋白沉淀。圖5尺寸排阻色譜顯示，隨著pH的降低，8-13 min蛋白聚合區(qū)明顯降低。伴隨著各種雜質(zhì)如DNA、組蛋白、非組蛋白宿主雜質(zhì)蛋白的大量去除 （表1）。其中DNA降低為起始濃度的0.007%，組蛋白減低為起始濃度的2.2%，非組蛋白宿主蛋白降低為起始濃度的75%。蛋白聚合物由18.73%降低為3.42%。在pH 4.0處理后，IgG回收率為92.36%。

低pH細(xì)胞液處理技術(shù)能有效去除各種宿主蛋白，大大減輕后續(xù)蛋白純化的壓力，對(duì)于未來(lái)工藝的簡(jiǎn)化起到了至關(guān)重要的作用。

圖4　細(xì)胞上清液經(jīng)不同pH沉淀的非還原型SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig. 4　Non-Reduced SDS-PAGE，precipitates from cell culture supernatant treated to different pHs （3.5-9.0）.

圖5　細(xì)胞回收液在不同pH酸性處理后經(jīng)離心過(guò)濾通過(guò)尺寸排阻色譜分離Fig. 5　SEC of cell culture supernatant titrated to different pHs.

2.4不同蛋白A樹(shù)脂純化效果對(duì)比

細(xì)胞回收液經(jīng)不同pH處理后，應(yīng)用不同蛋白A樹(shù)脂進(jìn)行純化。圖6顯示，pH 4.0處理后細(xì)胞回收液經(jīng)由蛋白A純化后，與pH 7.0 條件細(xì)胞回收液直接上樣相比，NaOH洗脫峰面積大大減少，進(jìn)一步證明低pH預(yù)處理有效去除大量宿主雜質(zhì)，減輕了蛋白A樹(shù)脂生物負(fù)載量，對(duì)于提高樹(shù)脂使用壽命將起到有益作用。

表1　細(xì)胞回收液經(jīng)酸性處理后各種雜質(zhì)以及IgG回收率Table 1　Concentration of each component (DNA, non-histone HCP, histone, heteroaggregates and IgG) in cell culture supernatant after different pH treatment

圖6　不同酸性處理后細(xì)胞回收液經(jīng)由MabSelect Sure蛋白A樹(shù)脂純化色譜圖Fig. 6　Toyopearl protein A chromatography loaded with cell culture supernatant treated at different pHs.

表2比較了不同酸性處理后經(jīng)由3種蛋白A純化后單抗蛋白以及殘留雜質(zhì)量。對(duì)于3種蛋白A樹(shù)脂，經(jīng)過(guò)低pH 4.0處理后最終產(chǎn)品非組蛋白宿主雜質(zhì)蛋白與pH 7.0條件下，均取得10倍左右降低量。DNA、組蛋白降低顯著。IgG回收率均取得3%左右提高。

在傳統(tǒng)的蛋白A親和層析中，由于大量宿主雜質(zhì)的非特異性吸附，阻礙了其他抗體蛋白與蛋白A的結(jié)合，造成了蛋白動(dòng)態(tài)上樣量下降。蛋白A需要低pH （pH 3.0-4.0）洗脫吸附的單抗蛋白，但同時(shí)該條件也會(huì)造成吸附在蛋白A上的宿主雜蛋白剝離，使得洗脫下來(lái)的抗體蛋白混雜了大量的宿主雜蛋白。同時(shí)在蛋白A洗脫抗體蛋白液中和過(guò)程中，由于宿主雜質(zhì)蛋白結(jié)合聚集，形成大量微米級(jí)的顆粒聚集，是造成抗體純化洗脫液中濁度提升的主要原因，往往需要很大面積的濾膜去除，對(duì)操作產(chǎn)生諸多不便［26］。

我們比較了不同pH條件處理后蛋白A低pH洗脫IgG在回調(diào)至中性過(guò)程中濁度的變化（圖7）：經(jīng)過(guò)pH 4.0預(yù)處理后上樣至蛋白A，低pH洗脫蛋白回調(diào)后濁度大大降低，減少了濾膜的使用量，大大增加了操作的連續(xù)性，簡(jiǎn)化工藝流程。

表2　酸性處理細(xì)胞回收液經(jīng)不同蛋白A樹(shù)脂純化效果比較Table 2 Concentration of each component (DNA, non-histone HCP, histone, heteroaggregates and IgG) in cell culture supernatant treated at different pHs and loaded to protein A columns, 1-MabSelect Sure, 2-Toyopearl, 3-Eshnumo A

圖7　不同pH處理后細(xì)胞回收液經(jīng)由MabSelect SuRe蛋白A樹(shù)脂純化后洗脫蛋白濁度Fig. 7　MabSelect SuRe loaded with cell culture supernatant treated at different pHs，eluted IgG was adjusted to different pHs and turbidity was monitored over the neutralization process.

2.5兩步法抗體純化工藝

對(duì)于速斷保護(hù)而言，忽略保護(hù)動(dòng)作時(shí)間，考慮斷路器分閘時(shí)間0.13 s、合閘時(shí)間0.2 s，當(dāng)重合閘整定時(shí)間由2 s增加至2.5 s時(shí)，允許滑落性故障的延時(shí)，將從2.33 s增加至2.83 s，對(duì)于滑落性延時(shí)故障的重合成功率也有提升。

傳統(tǒng)單抗純化平臺(tái)包括3-4步色譜純化，除了蛋白A作為第一步抗體粗純外，通常需要額外2-3步色譜，諸如陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，疏水作用樹(shù)脂進(jìn)一步去除殘留的宿主雜質(zhì)以及蛋白聚合物 （圖8）。

圖8　兩步法抗體純化平臺(tái)對(duì)比三步法抗體純化Fig. 8　Two-step purification platform comprising of protein A and Capto adhere. Traditional IgG purification platform contains protein A and two other polishing steps，such as anion exchanger，cation exchanger，etc.

Capto adhere是GE公司新開(kāi)發(fā)的混合型疏水作用陰離子交換樹(shù)脂［27］，對(duì)于去除蛋白聚合物效果明顯。蛋白A洗脫抗體調(diào)節(jié)pH至8.0，NaCl添加至1 mol/L （電導(dǎo)率在90 mS/cm左右），上樣至Capto adhere。蛋白洗脫通過(guò)降低pH以及電導(dǎo)率，蛋白聚合物吸附能力強(qiáng)于單體IgG，需進(jìn)一步降低pH以及電導(dǎo)率進(jìn)行洗脫 （圖9）。洗脫后IgG以及蛋白聚合物部分分別由排阻色譜分離 （圖10），IgG峰純度高于99.99%，蛋白聚合物小于0.01%。

圖9　蛋白A洗脫抗體經(jīng)由Capto adhere純化Fig. 9　IgG purification by Capto adhere.

圖10　蛋白A洗脫抗體經(jīng)由Capto adhere純化后通過(guò)尺寸排阻色譜分離Fig. 10　SEC of purified IgG by two-step purification platform comprising. （A）IgG. （B）Heteroaggregates.

表3　細(xì)胞回收液酸性與非酸性處理通過(guò)蛋白A，Capto adhere純化效果對(duì)比Table 3　Capto adhere purification efficiency of cell culture supernatant treated by low pH or not, 1-pH 4.0 treatment, 2-no pH treatment

經(jīng)過(guò)Capto adhere純化后非組蛋白宿主雜質(zhì)蛋白降低至4.5 ppm，DNA降低至小于1 ppb，抗體質(zhì)量好于市場(chǎng)現(xiàn)有商業(yè)化產(chǎn)品［16-18］，總IgG回收率達(dá)到87%。證明經(jīng)由低pH細(xì)胞液處理后大大提高蛋白A以及后續(xù)Capto adhere純化效率 （表3），有效實(shí)現(xiàn)兩步法單抗純化 （圖8）。

3　結(jié)論

本研究首先關(guān)聯(lián)了抗體細(xì)胞回收液pH、鹽濃度對(duì)于各種雜質(zhì)的影響機(jī)制。明確了各種雜質(zhì)包括組蛋白、非組蛋白宿主雜質(zhì)蛋白、DNA、蛋白聚合物對(duì)于不同pH、鹽濃度的響應(yīng)關(guān)系，伴隨著pH的降低，宿主雜質(zhì)溶解度下降，造成細(xì)胞液濁度上升。而鹽濃度的提高則減緩了各種雜質(zhì)溶解度的下降。

通過(guò)對(duì)抗體細(xì)胞回收液的pH 4.0酸性處理，實(shí)現(xiàn)99.99%以上DNA去除，97%以上組蛋白去除，非組蛋白宿主蛋白降低為起始濃度的75%。蛋白聚合物降低至起始的20%。經(jīng)過(guò)蛋白A純化后，洗脫蛋白回調(diào)中性后濁度降低至5 NTU以下，非組蛋白宿主雜質(zhì)蛋白降低10倍。蛋白A純化效率大大提高，抗體蛋白回收率提高3%左右。經(jīng)過(guò)一步Capto adhere純化，非組蛋白宿主雜質(zhì)蛋白降低至4.5 ppm，DNA降低至小于1 ppb，組蛋白降低至檢測(cè)限以下，蛋白聚合物小于0.01%，純度高于市場(chǎng)現(xiàn)有商業(yè)化產(chǎn)品。該兩步法抗體蛋白純化平臺(tái)實(shí)現(xiàn)87%的蛋白回收率，連續(xù)性高，具有很好的大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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（本文責(zé)編陳宏宇）

April 5，2016； Accepted: April 25，2016

s: Rui Nian. Tel: +86-532-80662681； Fax: +86-532-80662765； E-mail: nianrui@qibebt.ac.cn

Improved protein-A chromatography for monoclonal antibody purification

Quan Chen1, Phyllicia Toh2, Aina Hoi2, Mo Xian1, Xinying Peng1, Yuansheng Yang2, Haibo Zhang1, Rui Nian1, and Wei Zhang2

1 Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology，Chinese Academy of Sciences，CAS Key Laboratory of Biobased Materials，Qingdao 266101，Shandong，China
2 Bioprocessing Technology Institute，Agency for Science，Technology and Research (A*STAR)，Singapore 138668，Singapore

Therapeutic monoclonal antibodies become the major product class within the biopharmaceutical market. Protein A as the first capture step is still dominant in current platforms for purification of monoclonal antibodies. In this study，we developed a new antibody harvest process that incorporates acidic treatment of cell harvest，demonstrating high process yield，improved clearance of host cell associated contaminants，like non-histone host cell protein，histone，DNA and heteroaggregates. Host protein contamination was reduced about 10-fold compared to protein A loaded with harvest clarified by centrifugation and microfiltration. Turbidity increase of eluted IgG upon pH neutralization was nearly eliminated. Residual levels of impurities in the protein A eluate were achieved that potentially meet requirements of drug substance and thus alleviate the burden for further impurities removal in subsequent chromatography steps. The mechanism of host cell associated contaminants removal during acidic treatment was also explored. After a polishing step by Capto adhere，host cell protein was reduced to less than 5 ppm，DNA less than 1 ppb，histone to undetectable level，heteroaggregates less than 0.01% with total IgG recovery around 87%. This efficient process can be easily integrated into current IgG purification platforms，and may overcome downstream processing challenges.

protein A，monoclonal antibody，purification，cell culture supernatant，acidic precipitation，host cell protein，histone，DNA

10.13345/j.cjb.160137

Supported by: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology，Start-up Fund （No. Y571061905），Singapore Biomedical Research Council （No. ETPL/12-R15GAP-0009）.

Wei Zhang. Tel: +65-64070933； Fax: +65-64789561； E-mail: zhang_wei@bti.a-star.edu.sg

中科院青能所所長(zhǎng)創(chuàng)新基金 （No. Y571061905），新加坡生物醫(yī)藥研究計(jì)劃 （No. ETPL/12-R15GAP-0009）資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160506.1638.003.html