康 俊

烏蘭察布職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000)

?

真菌抑菌劑在馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)中的應(yīng)用

康 俊

烏蘭察布職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000)

[目的]研究馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)中的最佳抑菌劑及其濃度。[方法]利用平板生長抑制法對(duì)多錳鋅、甲基托布津2種抑菌劑的抗性進(jìn)行篩選，將篩選出的最佳抑菌劑作為馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)抑菌劑，研究其污染控制效果及其對(duì)組培苗生長的影響。[結(jié)果]培養(yǎng)基中添加不同濃度的多錳鋅及甲基托布津?qū)φ婢囊种婆c對(duì)照相比均差異顯著，多錳鋅抑菌效果優(yōu)于甲基托布津。[結(jié)論]培養(yǎng)基添加0.10 g/L多錳鋅(多菌靈含量16%，代森錳鋅含量34%，可濕性粉劑)抑菌效果好且苗的生長狀況最佳，可作為馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)中的抑菌劑。

抑菌劑；馬鈴薯；組培培養(yǎng)；開放式

隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化技術(shù)快速發(fā)展，馬鈴薯脫毒快繁技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。但傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)方法對(duì)環(huán)境要求嚴(yán)格，必須在無菌條件下操作，需要超凈工作臺(tái)和高壓滅菌鍋等儀器設(shè)備。且培養(yǎng)基在高壓滅菌時(shí)需要耗費(fèi)大量電能，是組織培養(yǎng)成本較高的主要因素。開放式組織培養(yǎng)是指通過優(yōu)化試驗(yàn)技術(shù)降低污染率，使植物組織培養(yǎng)操作脫離嚴(yán)格無菌環(huán)境，在自然、開放的有菌條件下進(jìn)行，培養(yǎng)基無須滅菌，最終達(dá)到與嚴(yán)格無菌環(huán)境組織培養(yǎng)同樣的效果[1-2]。與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)方法相比，開放式組織培養(yǎng)技術(shù)特點(diǎn)在于其可以使培養(yǎng)容器的選擇范圍變大，無須耐高溫高壓的材料，同時(shí)培養(yǎng)基及接種器具無須高壓滅菌，操作方便，大幅度降低組織培養(yǎng)成本等。但植物開放式組織培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵在于找到有效的抑菌劑。研究表明，隨著抑菌劑濃度的增大其對(duì)植物生長發(fā)育的抑制作用增大。因此，有效抑菌劑的選擇對(duì)開放式組織培養(yǎng)尤為重要。

若開放式組織培養(yǎng)技術(shù)在馬鈴薯組織培養(yǎng)中能成功應(yīng)用，可有效降低馬鈴薯組織培養(yǎng)成本。目前，利用農(nóng)藥[2-4]、抗生素[4-6]、防腐劑[8]、復(fù)合型抑菌劑[9]、次氯酸鈉[10-11]等作為開放式組織培養(yǎng)的抑菌劑均有報(bào)道。筆者通過比較抑菌劑多錳鋅及甲基托布津在馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)中的抑菌效果和對(duì)擴(kuò)繁組培苗生長的影響，確定多錳鋅在馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)中的最佳抑菌劑及其使用濃度范圍，以期為今后馬鈴薯開放式植物組織培養(yǎng)的進(jìn)一步研究提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1殺菌劑。多錳鋅(國光英納，可濕性粉劑，四川國光農(nóng)化股份有限公司)；甲基托布津(國光松爾，50%可濕性粉劑，四川國光農(nóng)化股份有限公司)。1.1.2培養(yǎng)基。孟加拉紅培養(yǎng)基(蛋白胨 5 g、葡萄糖 10 g、磷酸二氫鉀 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂20 g、1/3 000孟加拉紅溶液 100 mL、氯霉素 0.1 g、蒸餾水 1 000 mL)；MS培養(yǎng)基[7]。

1.1.3植物材料。供試材料為馬鈴薯普通栽培種“Atlantic”，由烏蘭察布職業(yè)學(xué)院馬鈴薯研究所提供。

1.2抑菌劑的篩選

1.2.1污染菌種的分離純化。從被真菌污染的馬鈴薯組培苗中分離到污染霉菌，進(jìn)行劃線分離純化。挑取單菌落，接種至斜面孟加拉紅培養(yǎng)基上，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d左右，接種至平面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長滿平皿后備用。

1.2.2污染真菌的鑒定。在孟加拉紅培養(yǎng)基上28 ℃下培養(yǎng)3 d，比較菌株的群體形態(tài)特征，進(jìn)行初步鑒定[12]，繼續(xù)培養(yǎng)15 d后再鑒定。

1.2.3孟加拉紅抗性培養(yǎng)基制備。分別配制0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 g/L多錳鋅及甲基托布津孟加拉紅抗性培養(yǎng)基。將2種抑菌劑配制成1 000 mg/L的母液備用，按常規(guī)方法配制孟加拉紅培養(yǎng)基，高壓滅菌后趁培養(yǎng)基冷卻凝固前在超凈工作臺(tái)上按試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度分別加入多錳鋅及甲基托布津母液，振蕩搖勻，并做好標(biāo)記，每個(gè)濃度3次重復(fù)，空白對(duì)照不加藥液。

1.2.4接菌。在無菌條件下，用高壓滅菌的直徑0.60 cm不銹鋼打孔器在已培養(yǎng)好的菌落外緣切下帶菌培養(yǎng)基柱——菌餅，將菌餅移至抗性培養(yǎng)基的中央(將有菌絲的一面緊貼培養(yǎng)基)，每個(gè)培養(yǎng)皿接一個(gè)菌餅，每個(gè)濃度3次重復(fù)，置于28 ℃溫箱內(nèi)，6、10 d后檢查菌落生長情況。

1.3馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)試驗(yàn)

1.3.1培養(yǎng)瓶及接種器具處理。 將培養(yǎng)瓶及蓋子在0.1%的次氯酸鈉水溶液中浸泡25 min，撈出濾干待用；接種器接種前用95%乙醇徹底灼燒滅菌，接種臺(tái)用75%乙醇噴霧。

1.3.2MS抗性培養(yǎng)基的制備。將多錳鋅可濕性粉劑分別加至MS培養(yǎng)基后攪拌均勻，配制成濃度梯度為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 g/L的MS培養(yǎng)基，以不加藥劑不滅菌的MS培養(yǎng)基和不加藥劑滅菌的MS培養(yǎng)基作為對(duì)照培養(yǎng)基，每瓶裝20 mL(表1)。

1.3.3轉(zhuǎn)接試管苗。將馬鈴薯苗分別擴(kuò)繁至標(biāo)記好的培養(yǎng)基中，每瓶10個(gè)莖段，每個(gè)濃度接10瓶，每個(gè)處理重復(fù)3次。放入組培室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度(25士2)℃，空氣相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度2 500 lx，光照時(shí)間14 h/d。20 d后統(tǒng)計(jì)污染率和植株成活率。

1.4數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS 13.0進(jìn)行分析。根據(jù)菌落直徑計(jì)算相對(duì)抑菌率，計(jì)算公式：

生長直徑=菌落平均直徑-菌餅直徑

相對(duì)抑菌率=(對(duì)照生長直徑-處理生長直徑)/對(duì)照生長直徑×100%

表1不同濃度多錳鋅加入MS培養(yǎng)基試驗(yàn)處理

Table 1Treatments composed of different concentrations of MnZn added to MS medium

處理Treatment培養(yǎng)基Compositionofamedium高壓滅菌AutoclavedsterilizationCK1MS+30g/L蔗糖+35g/L瓊脂否AMS+0.01g/L多錳鋅+30g/L蔗糖+35g/L瓊脂否BMS+0.05g/L多錳鋅+35g/L瓊脂否CMS+0.10g/L多錳鋅+35g/L瓊脂否DMS+0.15g/L多錳鋅+35g/L瓊脂否EMS+0.20g/L多錳鋅+35g/L瓊脂否CK2MS+30g/L蔗糖+48g/L瓊脂是

2　結(jié)果與分析

2.1抑菌劑的種類及濃度篩選

2.1.1鏡檢鑒定結(jié)果。對(duì)分離純化的2種菌株鏡檢，初步鑒定為青霉菌(Penicillium)和曲霉菌(Aspergillus)。青霉菌主要形態(tài)特征：有隔菌絲，有分身孢子梗，分生孢子成串，帚狀(圖1)；曲霉菌主要形態(tài)特征：有隔菌絲，有“孢子穗”，孢子成黃綠色(圖2)。

圖1　青霉菌菌落形態(tài)Fig.1　Colonies and spore spikes of penicillium

圖2　曲霉菌菌落形態(tài)及孢子穗Fig.2　Colonies and spore spikes of aspergillus

2.1.2抑菌劑的抑菌效果。由表2和3可知，培養(yǎng)基中添加不同濃度的多錳鋅及甲基托布津?qū)η嗝辜扒咕幸种谱饔?，與對(duì)照差異顯著。 10 d后0.05 g/L以上濃度的多錳鋅抑菌效果與甲基托布津差異極顯著，且濃度與抑菌效果呈正相關(guān)。0.10 g/L以上濃度的多錳鋅在6 d時(shí)對(duì)曲霉的抑菌率可達(dá)100%，明顯高于甲基托布津。2種抑菌劑相比，多錳鋅的抑菌效果明顯優(yōu)于各濃度甲基托布津，可作為有效的馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)抑菌劑。

2.2多錳鋅在馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)中的污染控制效果及其對(duì)組培苗生長的影響由表4可知，0.10 g/L以上濃度的多錳鋅對(duì)組培苗的污染均有較好的抑制作用。但高濃度的多錳鋅，不僅對(duì)組培苗污染有抑制作用，還會(huì)影響苗的高度及根的形成。0.20 g/L多錳鋅處理后，苗的生根數(shù)明顯減少，且苗高較對(duì)照CK2減少46.03%。根系是主要的營養(yǎng)吸收和合成器官，與地上部分生長密切相關(guān)，因此，高濃度多錳鋅處理后生根數(shù)的減少勢必造成植株生長受阻。由此可知，既有抑菌效果又對(duì)組培苗生長影響較小的最佳多錳鋅濃度為0.10 g/L。

表2　抑菌劑對(duì)青霉生長的影響

注：同列多錳鋅各組與0.20 g/L甲基托布津組相比，a表示差異極顯著(P<0.01)，b表示差異顯著(P<0.05)，未標(biāo)表示差異不顯著。

Note: When various concentrations of MnZn in the same column were compared with 0.20 g/L thiophanate-methyl, a and b stand for extremely significant (P<0.01) and significant differences (P<0.05) respectively. Data without a or b stand for no significant difference.

表3　抑菌劑對(duì)曲霉生長的影響

注：同列多錳鋅各組與0.20 g/L甲基托布津組相比，a表示差異極顯著(P<0.01)，b表示差異顯著(P<0.05)，未標(biāo)表示差異不顯著。

Note: When various concentrations of MnZn in the same column were compared with 0.20 g/L thiophanate-methyl, a and b stand for extremely significant (P<0.01) and significant differences (P<0.05) respectively.Data without a or b stand for no significant difference.

表4　多錳鋅的抑菌效果及其對(duì)馬鈴薯組培苗生長的影響

3　結(jié)論與討論

該試驗(yàn)以馬鈴薯脫毒組培苗為材料，通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的多錳鋅及甲基托布津抑菌劑，確定了多錳鋅可作為有效的開放式組織培養(yǎng)抑菌劑。在無超凈工作臺(tái)的情況下，0.10 g/L多錳鋅的抑菌率可達(dá)100%。雖然開放式組織培養(yǎng)法培養(yǎng)苗的生長高度及生根數(shù)與高壓滅菌法相比稍有差異，但在規(guī)?；a(chǎn)中，開放式組織培養(yǎng)法可以節(jié)約設(shè)備，減少高壓滅菌的電力消耗，節(jié)省培養(yǎng)基制作過程中的瓊脂等凝固劑，還可以節(jié)約高壓滅菌及試驗(yàn)開展前接種室紫外滅菌的時(shí)間，能較大程度地降低組織培養(yǎng)成本并提高效率。

目前尚無多錳鋅作為開放式組織培養(yǎng)抑菌劑的報(bào)道。王曉煌等[2]研究表明，多菌靈600 倍液在煙草開放式組培中控制細(xì)菌、真菌的污染率均在10%以下。陳亞蘭[13]研究表明，50%多菌靈可濕性粉劑對(duì)馬鈴薯組培苗生產(chǎn)中最常見的青霉菌、細(xì)菌和酵母菌3種菌具有較好的抑制作用，且對(duì)馬鈴薯試管苗的生長以及生根產(chǎn)生的負(fù)面影響最小。邵清松等[14]研究發(fā)現(xiàn)，1 g/L 多菌靈在金線蓮組織培養(yǎng)中抑菌促生長效果優(yōu)于甲霜靈和甲基托布津及其混合物。該試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)真菌的抑制多錳鋅優(yōu)于甲基托布津，與邵青松等[14]

的試驗(yàn)結(jié)果一致。張健雄等[3]研究表明，當(dāng)代森錳鋅濃度0.2～0.3 g/L 時(shí)，其在東北紅豆杉開放式組織培養(yǎng)中的抑菌效果較好，且對(duì)植物生長的影響較小，可作為最佳的抑菌劑濃度范圍。該試驗(yàn)結(jié)果表明，0.1 g/L多錳鋅對(duì)組培苗生長的影響較小，這是由于多錳鋅為2種藥劑的混合及馬鈴薯組培苗的耐藥程度較高。同時(shí)該試驗(yàn)在轉(zhuǎn)接前用0.1%的次氯酸鈉浸泡培養(yǎng)瓶也能達(dá)到預(yù)期的抑菌效果，彭廣霖等[15]研究發(fā)現(xiàn)，5～10 mg/L 次氯酸鈉對(duì)馬鈴薯和切花菊組培苗的抑菌效果較好，苗木存活率達(dá)80%。解輝等[10]在巴西香蕉組培時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.01%以上的次氯酸鈉可有效抑制培養(yǎng)基的污染，外植體成活率高達(dá)81%。該試驗(yàn)未進(jìn)行細(xì)菌抑菌劑的篩選，抗生素抑菌效果在很多研究中已經(jīng)證實(shí)[5-7]。

該試驗(yàn)通過對(duì)多錳鋅的抑菌效果及其對(duì)馬鈴薯組培苗的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，多錳鋅可作為馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)的抑菌劑，關(guān)于其對(duì)組培苗生長速度、后期轉(zhuǎn)接擴(kuò)繁效果及根的影響，以及與抗生素混合效果有待于進(jìn)一步研究。

[1] 崔剛,單文修,秦旭，等.植物開放式組織培養(yǎng)研究初探[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,35(4):529-533.

[2] 王曉煌,黃勝琴,李玲. 4種抑菌劑在煙草開放式組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(5):58-62.

[3] 張健雄,李俊翔,戶新宇，等.代森錳鋅在東北紅豆杉開放式組培中的應(yīng)用研究[M]//張啟翔.中國觀賞園藝研究進(jìn)展.北京：中國林業(yè)出版社，2012:233-235.

[4] 張薪薪,唐金花,王關(guān)林.抑菌劑在開放組培中的使用及效果研究[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,28(4):466-469.

[5] 李文蘭,李華英,盛小偉.不同抗生素對(duì)羅漢果遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的影響[J].分子植物育種,2010(3):529-532.

[6] 孫占育,曹彬,李紅芳，等.長柄扁桃開放式組培試驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2013(20):66-67.

[7] 王玉英.MS培養(yǎng)基的配制方法[J].植物雜志,1983(5):15.

[8] 王丹,劉霞.山梨酸鉀在紅豆杉開發(fā)式組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(2):634-635.

[9] 盧加舉,張正學(xué),彭仕榮,等.復(fù)合型抑菌劑在甘蔗開放式組培中的應(yīng)用研究[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(10):68-71.

[10] 解輝,莫廷輝,曾麗星．次氯酸鈉在香蕉開放式組織培養(yǎng)中的應(yīng)用研究[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2011,32(5):886-890.

[11] 吳桂容,曲芬霞,余炳鋒.賀州荸薺開放式組織培養(yǎng)體系建立[J].北方園藝,2013(6):110-112．

[12] 魏景超．真菌鑒定手冊[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1979.

[13] 陳亞蘭.不同抑菌劑對(duì)馬鈴薯試管苗生長的影響[J].中國馬鈴薯，2012,26(5):260-263.

[14] 邵清松,劉洪波,趙曉芳,等.金線蓮莖腐病菌的生物學(xué)特性及5 種殺菌劑對(duì)其抑制作用[J].中國中藥雜志,2014,39(8):1386-1390.

[15] 彭廣霖,李青,衣淑玉,等.次氯酸鈉防治組培苗污染的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(16):8806-8808.

Application of Fungal Bacteriostat in Open Tissue Culture of Potato

KANG Jun-

Ulanqab Vocational College, Ulanqab, Inner Mongolia 012000)

[Objective] To determine the best fungal bacteriostat and its concentration in open tissue culture of potato. [Method] The resistance of two bacteriostats MnZn and thiophanate-methyl was sifted by using the method of flat growth restraint. In addition, the effects of the best bacteriostat as the bacteriostat in open tissue culture of potato on fungi and seedling growth were studied. [Result] Compared with the control, the inhibitory effects of different concentrations of MnZn and thiophanate-methyl on fungi were significantly better. The inhibitory effect of MnZn was better than that of thiophanate-methyl. [Conclusion] When the concentration of MnZn wettable powder was 0.10 g/L (the content of carbendazim was 16%, and the content of mancozeb was 34%), the antibacterial effect of MnZn and the growing status of seedlings were the best, so it can be used as a fungal bacteriostat in open tissue culture of potato.

Bacteriostat; Potato; Tissue culture; Open

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(NJZC14383)。

康俊(1982- )，女，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，講師，碩士，從事植物病理和種薯繁育研究。

2016-08-03

S 188

A

0517-6611(2016)26-0108-03