萬(wàn)　勇，陳　東

(廣東省深圳市人民醫(yī)院神經(jīng)外科　518020)

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論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.006

動(dòng)脈灌注腦低溫治療大鼠大面積腦梗死的實(shí)驗(yàn)研究*

萬(wàn)勇，陳東

(廣東省深圳市人民醫(yī)院神經(jīng)外科518020)

目的探討動(dòng)脈灌注腦低溫治療大鼠大面積腦梗死的效果。方法32只大鼠被分成：模型組、冰帽組、全身低溫組和頸內(nèi)動(dòng)脈的冷鹽水灌注(ICSI)組。再灌48 h后，進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分；檢測(cè)腦含水量及腦梗死體積。結(jié)果各低溫方式均能降低大鼠梗死體積，ICSI組腦梗死體積分別與全身低溫組、冰帽組及模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.37、5.31、11.47，P<0.05)。ICSI組與冰帽組、全身低溫組比較，腦含水量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。ICSI組與模型組、冰帽組、全身低溫組比較，24、48 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。ICSI組的24 h與48 h 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.06，P<0.05)。結(jié)論ICSI可以顯著減少局灶性腦缺血后梗死體積及腦含水量，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

腦梗死；腦水腫；頸內(nèi)動(dòng)脈；冷鹽水灌注

腦梗死是臨床常見的腦血管病之一，最常見的是大腦中動(dòng)脈梗死，如果治療不及時(shí)患者病死率很高，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量及預(yù)后。因此，怎樣更好的防止大面積腦梗死的加劇，保存缺血區(qū)的神經(jīng)功能以提高患者的生存質(zhì)量是急需解決的問(wèn)題[1]?！爸委熜缘蜏亍笔悄壳隘熜Т_切的保護(hù)腦功能的方法。目前常見的低溫措施有冰帽、全身低溫等，但這些方式各有優(yōu)缺點(diǎn)。頸內(nèi)動(dòng)脈的冷鹽水灌注(intracarotid cold saline infusion，ICSI)是目前研究的熱點(diǎn)，研究提示這種方式是安全可行的[2]。本研究通過(guò)比較不同低溫方式對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，檢測(cè)腦含水量及腦梗死體積的影響，希望為ICSI的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量0.25～0.30 kg，2.0～2.5月齡。由上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0007；使用許可證號(hào)：SYXK(滬)(2006-0010)，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h但是不禁飲水。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑微量泵注射器(Sigma，美國(guó))，低溫灌注箱(北京中杉橋公司)，腦溫探測(cè)儀及探頭(Physitemp公司，美國(guó))，激光多普勒(Moor公司，英國(guó))，生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(BD公司，美國(guó))。2，3，5三苯基四氮唑(2，3，5-Triphenyltertrazol ium Chloride，TTC)(Sigma公司，美國(guó))，NSE、MMP9檢測(cè)試劑盒(博士德生物有限公司，武漢)。

1.3方法

1.3.1模型建立腹腔注射10%水合氯醛，取仰臥位。分離頸部重要?jiǎng)用}。保留頸外動(dòng)脈，剩余給予夾閉，頸外動(dòng)脈近心端絲線活扣備用。剪斷頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，將直徑0.34 mm的線栓由頸外動(dòng)脈殘端進(jìn)入，有阻力時(shí)停止，記錄下時(shí)間，栓塞時(shí)間為2 h。采用Moor Lab激光多普勒血流儀對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估，以大鼠造模后皮質(zhì)腦血流的檢測(cè)減少至基礎(chǔ)血流的25%以下認(rèn)為造模成功。

1.3.2動(dòng)物分組將造模成功的32只SD大鼠分為ICSI組、冰帽組、全身低溫組和模型組，各8只。溫度設(shè)置33 ℃左右，保持20 min，栓塞2 h后利用白熾燈給予迅速?gòu)?fù)溫。冰帽組的大鼠給予自制冰帽降腦溫；全身低溫組應(yīng)用冰袋使大鼠肛溫降至33 ℃；ICSI組采用微量注射泵從頸內(nèi)動(dòng)脈滴注10～13 ℃的生理鹽水，速度10～25 mL/h。模型組栓塞2 h后進(jìn)行再灌注，無(wú)其他處理。

1.3.3腦梗死體積及水腫體積測(cè)定[3]再灌注48 h后處死大鼠，無(wú)菌條件下取腦組織，切片2 mm，用1% TTC 37 ℃下染色30 min，4%多聚甲醛固定12 h。計(jì)算TTC染色面積。計(jì)算方法：(健側(cè)半球體積-患側(cè)未缺血體積)/健側(cè)半球體積×100%。水腫體積的計(jì)算公式：[(患側(cè)半球體積/健側(cè)半球體積)-1]×100%。

1.3.4神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[4]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)3分，姿勢(shì)實(shí)驗(yàn)3分，耳廓反射、角膜反射和驚恐反射、癲癇、肌陣攣或肌張力障礙各1分，共10分。評(píng)分值越高，神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重。

1.3.5血清學(xué)指標(biāo)用ELISA方法檢測(cè)SD大鼠中血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的表達(dá)水平，并按照試劑盒說(shuō)明操作。

2　結(jié)　果

2.1各低溫方式對(duì)腦梗死體積的影響冰帽組腦梗死體積(34.27%±3.11%)與模型組(49.13%±5.05%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.04，P<0.05)，ICSI組腦梗死體積(25.04%±2.72%)分別與全身低溫組(40.37%±4.12%)、冰帽組及模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.37、5.31、11.47，P<0.05)。見圖1。

圖1　大腦TTC染色(白色為梗死灶)

2.2各低溫方式對(duì)腦含水量的影響全身低溫組(82.17%±1.31%)和ICSI組(77.04%±1.53%)的含水量低于模型組(83.27%±4.16%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；冰帽組含水量(81.95%±3.58%)低于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ICSI組與冰帽組、全身低溫組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3各低溫方式對(duì)神經(jīng)行為學(xué)的影響各組間24 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.36，P<0.05)。兩組間比較提示ICSI組與模型組、冰帽組、全身低溫組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。各組別的48 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.48，P<0.05)。兩組間比較提示ICSI組與模型組、冰帽組、全身低溫組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義異(均P<0.05)。同組內(nèi)的t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，ICSI組的24 h與48 h 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　各組24 h及48 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，分)

2.4各低溫方式對(duì)血清學(xué)指標(biāo)的影響血清MMP-9的表達(dá)在ICSI組、模型組、冰帽組和全身低溫組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比較，冰帽組和全身低溫組中的血清NSE差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);然而，ICSI組中的血清NSE的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2　各組血清MMP-9和NSE之間的比較

3　討　論

“治療性低溫”是人們公認(rèn)的、有效的保護(hù)腦細(xì)胞的措施，目前已經(jīng)廣泛用于治療各種原因引起的缺血缺氧性腦病和頭部外傷等，并且取得了一定的成效。低溫能夠通過(guò)抑制腦梗死后發(fā)生的缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)保護(hù)神經(jīng)。冰帽是目前最簡(jiǎn)單局部降低腦溫度的措施，效果可靠，快捷方便，已廣泛使用于各大醫(yī)療機(jī)構(gòu)。全身低溫是目前臨床最常用的低溫方式，但其降溫效果較差及嚴(yán)重的不良反應(yīng)如心律失常、感染、凝血功能障礙等使其應(yīng)用大大的受到限制，削弱了它的腦保護(hù)作用。為了尋找一種最佳的腦低溫方式，減少全身低溫的并發(fā)癥，近年來(lái)人們開始使用選擇性腦低溫進(jìn)行治療[5]。血管內(nèi)灌注為目前新穎的低溫措施，能最大程度的降低全身低溫引起的不良反應(yīng)。同時(shí)其降溫速度、療效更確切。目前大量的臨床研究表明，ICSI可以迅速降低大鼠的腦部溫度，保護(hù)腦功能的效果顯著，臨床安全性可以保證[6-9]。本研究旨在進(jìn)一步比較ICSI與其他低溫方式對(duì)大鼠腦梗死后細(xì)胞的保護(hù)作用，希望能為深入研究ICSI和選擇不同的低溫方式提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究比較ICSI、全身低溫和冰帽對(duì)大鼠腦梗后體積，神經(jīng)學(xué)行為、含水量和血清MMP-9和NSE表達(dá)的影響，共使用了42只SD大鼠，其中成功造模的有32只，10只由于線栓未能成功入顱或者發(fā)生蛛網(wǎng)膜下腔出血等未能入選。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，冰帽組腦梗死體積與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ICSI組腦梗死體積分別與全身低溫組、冰帽組及模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腦含水量的測(cè)量是評(píng)價(jià)缺血后腦組織水腫程度的客觀指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，全身低溫組和ICSI組的含水量低于模型組(P<0.05)；冰帽組含水量低于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ICSI組與冰帽組、全身低溫組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。急性期的神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果提示，ICSI組的24、48 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均明顯低于模型組及其他低溫組。同時(shí)本研究結(jié)果提示，僅ICSI組的48 h的評(píng)分顯著低于24 h的評(píng)分，表明冰帽具有治療時(shí)間窗較廣，降溫設(shè)備需求低的優(yōu)勢(shì)，但是存在腦深部降溫效果差、降溫不均勻和速度不可控的缺陷。與全身低溫和冰帽相比較，ICSI可明顯改善神經(jīng)功能缺損，可能與以下原因有關(guān)：(1)ISCI除了低溫效果，還具有對(duì)梗死區(qū)局部血管的沖洗作用[10]；(2)ICSI的降溫速度較快，而全身低溫可能延誤治療的最佳時(shí)機(jī)。由此可見，腦梗死患者急性病情加重、死亡的重要原因?yàn)槟X組織水腫的加劇，進(jìn)而形成顱內(nèi)壓升高繼發(fā)腦疝形成[11]。ICSI可以明顯減輕腦細(xì)胞的組織水腫，有效改善腦缺血急性期的神經(jīng)功能，預(yù)防神經(jīng)變性、壞死，從而最大程度提高腦梗死的預(yù)后[12]。

NSE主要在神經(jīng)內(nèi)分泌源細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞，正常狀態(tài)下在血清中只有微量，當(dāng)顱腦組織受到損傷時(shí)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)壞死，則釋放出大量NSE，同時(shí)腦缺血后引起的血腦屏障損傷能釋放出MMP-9。有研究表明，血清NSE可以反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷程度，同時(shí)也能在某種程度上預(yù)示疾病的進(jìn)展；MMP-9可以反映血腦屏障的損傷程度。本研究的結(jié)果表明，ICSI組中的MMP-9表達(dá)水平雖然下降，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而ICSI可以明顯地降低血清NSE的表達(dá)，可見ICSI對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞有保護(hù)作用。

綜上所述，頸內(nèi)動(dòng)脈間斷灌注冷生理鹽水是一種快速、高效、安全的實(shí)施選擇性腦部低溫方法，可顯著減少梗死體積、減輕腦水腫、改善神經(jīng)功能和血清學(xué)指標(biāo)，并且其效果優(yōu)于全身低溫和冰帽。

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Experimental study on tracarotid cold saline infusion for treatment of malignant cerebral ischemia in rats*

Wan Yong,Chen Dong

(DepartmentofNeurosurgery,ShenzhenPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518020,China)

ObjectiveTo investigate the effect of tracarotid cold saline infusion for treatment of malignant cerebral ischemia in rats.MethodsA total of 32 rats were randomly divided into four groups:model group,cap group,systemic hypothermia group and ICSI group.After 48 h reperfusion,we recorded the neurological behavior score,brain water content and infarct volume.ResultsCompared with systemic hypothermia group,cap group,model group and ICSI group all showedSignificantly reduced infarct size.There was statistically significant difference among ICSI group and others (t=8.37,5.31,11.47,P<0.05).There was statistically significant difference among ICSI group and others in brain water content(P<0.05).There was statistically significant difference among ICSI group and others in neurological behavior score(P<0.05).There was significant difference between 24 h and 48 h neurological behavior score of ICSI group(t=6.06,P<0.05).ConclusionICSI can significantly reduce after focal cerebral ischemia and infarct volume and brain water content,promote the recovery of neurological function.

brain infarction;brain edema;internal,carotid artery;cold saline infusion

廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(jcyj20140416122811965)。作者簡(jiǎn)介：萬(wàn)勇(1978-)，主任醫(yī)師，碩士，主要從事缺血性腦血管病血管重建，三叉神經(jīng)痛，面肌痙攣，橋小腦角區(qū)占位等方面的研究工作。

R604

A

1671-8348(2016)26-3619-03

2016-02-18

2016-04-06)