張盼盼，商鵬飛，田方圓，韓瑞麗，蔣瑞瑞，孫桂榮，康相濤，劉小軍，田亞東

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南省家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程研究中心，鄭州 450002)

?

雞Visfatin蛋白的原核表達(dá)、純化及其活性研究

張盼盼#，商鵬飛#，田方圓，韓瑞麗，蔣瑞瑞，孫桂榮，康相濤，劉小軍，田亞東*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南省家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程研究中心，鄭州 450002)

本試驗旨在通過克隆Visfatin基因，將其在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并純化，通過3T3-L1細(xì)胞的分化驗證其活性，成功獲得雞重組Visfatin蛋白。以AA肉仔雞肝組織總RNA為模板，qRT-PCR擴增Visfatin基因，轉(zhuǎn)化進入pGEM?-T載體，再與原核表達(dá)載體pET-30a連接轉(zhuǎn)化，獲取含pET-30a-Visfatin重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)表達(dá)菌株。以IPTG誘導(dǎo)重組菌株，優(yōu)化表達(dá)條件，SDS-PAGE鑒定表達(dá)情況。采用鎳離子親和層析對Visfatin蛋白進行純化，Western blot鑒定表達(dá)蛋白，并通過3T3-L1細(xì)胞的分化情況鑒定表達(dá)蛋白Visfatin的活性。結(jié)果，通過NcoⅠ、XhoⅠ酶切獲得的結(jié)果與預(yù)期目的條帶大小相符，成功構(gòu)建pET-30a-Visfatin表達(dá)載體。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，在培養(yǎng)基pH為8.0，IPTG終濃度為0.4 mmol·L-1，30 ℃條件下,誘導(dǎo)10～12 h時可溶性蛋白表達(dá)量最大。通過鎳離子層析純化Visfatin蛋白，在SDS-PAGE的60 ku處可見一條與預(yù)期一致的蛋白條帶。Western blot證明純化蛋白可與6*His標(biāo)簽特異性結(jié)合。油紅O染色結(jié)果表明，與對照組相比Visfatin誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞有更多的脂滴形成。qRT-PCR結(jié)果顯示，在3T3-L1細(xì)胞分化過程中，Visfatin作用下標(biāo)志基因PPARγ、aP2、FAS和C/EBPα的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。本研究成功建立了一套標(biāo)準(zhǔn)化的雞Visfatin重組蛋白表達(dá)程序，獲得了具有生物活性的雞Visfatin，為其在家禽領(lǐng)域的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

雞重組Visfatin；克?。辉吮磉_(dá)；條件優(yōu)化；3T3-L1

內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)由A.Fukuhara等在2005年發(fā)現(xiàn)并命名[1]，其實質(zhì)與前B細(xì)胞克隆增強因子(PBEF)、煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)相同[2-3]，是一種分泌蛋白，由493個氨基酸組成，其大小約為52 ku。雞Visfatin在多個組織中均有表達(dá)[4]，且與人、大鼠、豬、斑馬魚的同源性分別為94%、94%、94%、88%，說明其具有高度保守性[5]。作為一種新型細(xì)胞脂肪因子，Visfatin是家禽采食調(diào)控中潛在的一種食欲增強因子，具有廣闊的研究前景。因此，獲得Visfatin的體外表達(dá)純化蛋白可為其在家禽領(lǐng)域的進一步研究奠定基礎(chǔ)。目前為止，Visfatin已在人類[6]、嚙齒動物[7]、豬[8]和雞[4]等動物中均有研究報道，其在糖脂代謝、胰島素抵抗、心血管疾病、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和癌癥中都起到重要的作用[1，9-11]。2008年，M.A.Cline等研究表明，向腦室內(nèi)注射人重組Visfatin可以顯著增加肉仔雞食欲[12]；2011年，該結(jié)論在小鼠中再次得到了驗證[13]。由此猜測，Visfatin在家禽采食量調(diào)控中可能扮演關(guān)鍵作用。2010年，韓瑞麗等已成功克隆出雞Visfatin全長序列，并對其相關(guān)SNP進行了分析[5，14]；此后，J.Li等對該基因的克隆、組織表達(dá)及啟動子等做了更為詳細(xì)的分析研究[15]。這些研究均為Visfatin在雞上的研究奠定了基礎(chǔ)。近年來有關(guān)Visfatin在家禽方面的研究所用試劑均為人重組Visfatin，市場上也只售有人和鼠重組內(nèi)脂素，且未見有關(guān)雞重組Visfatin的相關(guān)報道。不同物種之間的同種蛋白存在一定差異，異源蛋白可能會對試驗結(jié)果產(chǎn)生一定程度的影響。

本研究以肉仔雞肝總RNA為模板，克隆Visfatin序列，通過構(gòu)建載體，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)并純化，并通過3T3-L1細(xì)胞的分化情況驗證其活性，從而獲得具有生物活性的雞Visfatin蛋白，為其在家禽領(lǐng)域的深入研究提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

試驗于2013年5月至2014年8月在河南省家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程研究中心完成。

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物、菌株和質(zhì)粒試驗所用艾拔益加(AA)肉仔雞由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)種雞站提供。pGEM-T Easy Vector System購自Promega公司。TOP10、E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、原核表達(dá)載體pET-30a質(zhì)粒由河南省家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程研究中心保存。3T3-L1細(xì)胞購自美國模式菌種收集中心(ATCC)。

1.1.2主要生化試劑與酶總RNA提取試劑Trizol、PrimeScriptTMRT-PCR Kit、IPTG、X-gal、Premixed Protein Marker(Low)購自TaKaRa 公司；One Step Western Kit HRP(mouse)、TaqDNA聚合酶購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，6*His，His-Tag Monoclonal Antibody購自Proteintech公司；T4 DNA Ligase、硫酸卡那霉素、氨芐青霉素、PVDF膜、濾紙購自Promega公司；SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、 β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán) R-250、TEMED、過硫酸胺、二硫蘇糖醇(DTT)等常用試劑均為國產(chǎn)分析純；引物合成、基因測序由上海生工生物工程有限公司完成；DMEM、青鏈霉素、EDTA購自Gibco公司；細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑(Dex、IBMX、Insulin)與油紅O購自Simga公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量Mix等購自TaKaRa公司。

1.2試驗方法

1.2.1Visfatin基因的克隆與鑒定按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit的說明，從AA肉仔雞肝組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得其cDNA。根據(jù)GenBank公布的雞VisfatinmRNA(NM_001030728)序列，應(yīng)用DNAstar (Version 4.0)及Primer(Version 5.0)基因分析軟件，設(shè)計雞Visfatin編碼區(qū)引物，Visfatin-F(5′-ATACCATGGCTATGGAGTGCGCGGCGG-3′)，Visfatin-R(5′-CGCCTCGAGTTAGTGAGACGCCGTTTCTAG-3′)，下劃線部分分別為NcoⅠ和XhoⅠ的酶切位點。以cDNA為模板，進行PCR擴增，反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各2.0 μL，cDNA為2.5 μL，加ddH2O至總體積為50 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR結(jié)束后，再在樣品中加入10 μL的普通DNA Mix，混勻后72℃繼續(xù)擴增30 min，進行加A尾巴，隨后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，觀察并記錄結(jié)果。檢測合格后，對擴增產(chǎn)物進行膠回收，并對回收結(jié)果進行凝膠檢測。

1.2.2雞Visfatin重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定為了提高轉(zhuǎn)化效率，本試驗采用雙載體系統(tǒng)來構(gòu)建目的質(zhì)粒，具體載體序列和技術(shù)路線如圖1和圖2所示。先將回收純化的PCR產(chǎn)物與克隆載體pGEM?-T Easy進行連接，轉(zhuǎn)化進入到感受態(tài)細(xì)胞E.coliTOP10中，篩選陽性菌落提取重組質(zhì)粒，進行雙酶切(NcoⅠ和XhoⅠ)檢測，并測序鑒定，獲得重組質(zhì)粒pGEM?-T-visfatin。

將得到的pGEM?-T-Visfatin重組質(zhì)粒與pET30a質(zhì)粒同時用NcoⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，并純化回收。將酶切后的Visfatin基因片段用T4 DNA連接酶連接到pET30a載體上，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落進行重組質(zhì)粒提取，經(jīng)雙酶切鑒定正確后送上海生工生物工程有限公司測序，鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)化子。測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET30a-Visfatin，用于誘導(dǎo)表達(dá)。

圖1　PET-30a-c(+)載體序列圖Fig.1　The sequence map of PET-30a-c(+) vector

1.2.3Visfatin重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化將含pET30a-Visfatin重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)劃線，37 ℃培養(yǎng)過夜；次日挑單菌于LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h；按照1%～2%的比例加入LB培養(yǎng)液中，再加入1‰比例的Kna，然后按照1∶100的比例接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基(pH分別為6、7、8)中擴大培養(yǎng)至OD600 nm值為0.6～1時，菌液進行分組誘導(dǎo)培養(yǎng)。分別檢測誘導(dǎo)溫度(30 ℃、37 ℃)、IPTG終濃度(0.4、0.8、1.2 mmol·L-1)、誘導(dǎo)時間(2、4、6、8、10、12 h)對Visfatin重組蛋白可溶性表達(dá)量的影響。收集菌體后使用超聲波細(xì)胞破碎儀將菌體裂解30 min和50 min。離心后取上清，加入Loading buffer，煮沸加熱5 min后，用12%的SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)情況。1.2.4Visfatin重組蛋白的純化按優(yōu)化后條件表達(dá)出大量菌體，收集后用50 mmol·L-1的咪唑平衡緩沖液(pH7.4)重懸，于冰浴中超聲破碎裂解。12 000 r·min-1，4 ℃，離心10 min，取上清。將上清經(jīng)鎳離子親和層析柱進行純化，用50 mmol·L-1咪唑洗滌雜蛋白，150 mmol·L-1咪唑洗脫目的蛋白。然后采用低溫透析的方法除去蛋白溶液中的咪唑，根據(jù)該重組蛋白的消光系數(shù)測定純化的蛋白濃度，取100 μL進行12%的SDS-PAGE電泳，鑒定Visfatin重組蛋白的純度。

圖2　原核表達(dá)技術(shù)路線圖Fig.2　Construction of prokaryotic expression vector

1.2.5Western blot鑒定Visfatin蛋白通過Western blot檢驗純化后的重組目的蛋白，陰性對照為未誘導(dǎo)的pET30a-Visfatin。SDS-PAGE電泳后100 V轉(zhuǎn)膜(PVDF)1.5 h。用5%脫脂奶粉4 ℃過夜封閉PVDF；TBST漂洗后，加入1∶500稀釋的抗His標(biāo)簽的鼠源一抗，室溫孵育2 h；TBST沖洗后，加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(二抗)，室溫孵育1 h。采用DAB顯色試劑盒顯色，觀察結(jié)果。

1.2.63T3-L1細(xì)胞檢測Visfatin重組蛋白活性小鼠的脂肪前體細(xì)胞(3T3-L1)分化成為脂肪細(xì)胞，需要胰島素(Insulin)等誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)。有活性的Visfatin具有類胰島素作用，可通過脂肪庫和葡萄糖加速三酰甘油的積累，同時促進三酰甘油?；D(zhuǎn)移酶-1(DGAT-1)、脂肪酸合成酶(FAS)、重組人CCAT/增強子結(jié)合蛋白α(c/EBPα)、過氧化物酶體增殖因子活化受體γ(PPAR-γ)、轉(zhuǎn)錄因子aP2等調(diào)節(jié)脂肪分化的關(guān)鍵因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分裂周期，促使前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。從而可以通過觀察檢測3T3-L1的分化情況來檢驗Visfatin重組蛋白的活性。

3T3-L1的培養(yǎng)與染色：3T3-L1細(xì)胞復(fù)蘇于培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，至其密度達(dá)到70%～80%時，將其傳代到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；待密度達(dá)100%后，接觸抑制2 d，隨后換為含0.5 mmol·L-1IBMX和0.25 μmol DEX的10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，換成含0.5 mmol·L-1IBMX、0.25 μmol DEX和0.1 μg·mL-1Insulin/human Visfatin/chicken Visfatin/PBS(此濃度由預(yù)試驗選定)的10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)6 d，每2 d換一次培養(yǎng)液；分別在分化的第4和第8天收取細(xì)胞，用于檢測脂肪細(xì)胞的分化情況。分化第8天時，采用油紅O染色來觀察細(xì)胞分化情況。先用PBS洗滌后，用4%多聚甲醛37 ℃固定細(xì)胞1 h，PBS洗2～3次，加入油紅O染液，37 ℃靜置染色1～2 h，PBS漂洗2次。倒置顯微鏡下觀察結(jié)果，拍照。

1.2.7實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測相關(guān)基因表達(dá)量收集誘導(dǎo)分化8 d的脂肪細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。本試驗采用SYBR GreenⅡ染料法，以β-actin為內(nèi)參。qRT-PCR的反應(yīng)體系：5 μL Mix，上下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA，加水至10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性180 s；三步法95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min熔解，55 ℃ 30 s冷卻。參照2-ΔΔCt的方法計算目的基因的表達(dá)量變化，并通過SPSS分析其差異性。

試驗所用引物由Primer 5.0軟件設(shè)計完成，由上海生工生物工程有限公司合成，具體引物信息見表1。使用qRT-PCR技術(shù)檢測PPARγ、aP2、FAS、C/EBPα等3T3-L1誘導(dǎo)分化標(biāo)志基因的相對表達(dá)量，其表達(dá)的變化就體現(xiàn)了細(xì)胞分化能力的強弱，即相應(yīng)誘導(dǎo)劑活性作用的大小。

表1擴增脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的引物序列

Table 1Amplifying primers of marker genes for adipocyte differentiation

基因Gene上游引物序列(5'-3')Forwardprimer下游引物序列(5'-3')Reverseprimerβ-actinCGTGAAAAGATGACCCAGATCACACAGCCTGGATGGCTACGTPPARγCCAAGAATACCAAAGTGCGATCACCCACAGACTCGGCACTCAATaP2AAGAAGTGGGAGTGGGCTTTGCTCTTCACCTTCCTGTCGTCTGC/EBP-αTTTGCACCTCCACCTACATCCCCCCGTGTCCTCCTATCCCFASGCTGGCATTCGTGATGGAGTCGTAGGCCACCAGTGATGATGTAACTCT

2　結(jié)　果

2.1目的片段擴增產(chǎn)物鑒定

Visfatin基因的擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和測序鑒定，在1 500 bp左右位置出現(xiàn)特異性條帶(圖3)，設(shè)計的VisfatinDNA擴增長度為1 482 bp，從電泳圖片可見擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期設(shè)計結(jié)果相符，可用于后續(xù)試驗。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2.RT-PCR產(chǎn)物M.DNA markerV；1，2.Products of RT-PCR圖3　qRT-PCR擴增Visfatin產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3　Agarose gel electrophoresis of qRT-PCR amplification products for Visfatin

2.2雞Visfatin重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

2.2.1pGEM?-T-Visfatin重組質(zhì)粒鑒定提取菌液PCR為陽性的菌液質(zhì)粒，通過XhoⅠ和NcoⅠ雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖4)，出現(xiàn)3 015 bp和1 482 bp兩個片段，分別為載體和目的片段，經(jīng)測序證實序列完全正確，說明重組質(zhì)粒pGEM?-T-Visfatin構(gòu)建成功。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2.pGEM?-T-Visfatin質(zhì)粒酶切M.DNA markerV；1，2.Digestion of pGEM?-T-Visfatin plasmid圖4　重組質(zhì)粒pGEM?-T-Visfatin酶切鑒定Fig.4　Identification of pGEM?-T-Visfatin digestion

2.2.2表達(dá)載體pET30a-Visfatin的構(gòu)建與鑒定挑取陽性克隆質(zhì)粒，通過NcoⅠ、XhoⅠ酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖5)，分別出現(xiàn)載體和目的片段2條帶，符合pET30a-Visfatin酶切圖譜，且重組質(zhì)粒測序結(jié)果與Visfatin完全一致(結(jié)果未展示)。結(jié)果表明，已成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET30a-Visfatin，可以進行后續(xù)試驗。

2.3Visfatin重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

將構(gòu)建成功的pET30a-Visfatin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，得到含有目的基因的工程菌。利用SDS-PAGE、革蘭氏染色技術(shù)對誘導(dǎo)表達(dá)的溫度、IPTG濃度、時間、培養(yǎng)基pH以及超聲破碎時間等條件的優(yōu)化結(jié)果進行檢測。由圖6可確定，最優(yōu)的誘導(dǎo)條件是培養(yǎng)基pH為8.0，IPTG終濃度為0.4 mmol·L-1，30 ℃下誘導(dǎo)10～12 h。低溫下超聲破碎50 min可使菌體蛋白最大程度釋放(圖7)，且破碎上清中目的蛋白含量明顯多于破碎沉淀，可確定純化對象為破碎上清。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2.pET30a-Visfatin質(zhì)粒酶切M.DNA markerⅤ；1，2.Digestion of pET30a-Visfatin plasmid圖5　表達(dá)質(zhì)粒pET30a-Visfatin酶切檢測Fig.5　Identification of pET30a-Visfatin digestion

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。A．誘導(dǎo)溫度優(yōu)化：1.未誘導(dǎo)重組質(zhì)粒；2～5.37 ℃重組質(zhì)粒誘導(dǎo)全菌、沉淀、沉淀、上清；6～8.30 ℃重組質(zhì)粒誘導(dǎo)全菌、上清、沉淀。B．IPTG濃度優(yōu)化：1～3.IPTG濃度為1.2 mmol·L-1時的誘導(dǎo)全菌、上清、沉淀；4～6.IPTG濃度為0.8 mmol·L-1；7～9.IPTG濃度為0.4 mmol·L-1。C．誘導(dǎo)時間優(yōu)化：1～3.誘導(dǎo)2 h時的全菌、上清、沉淀；4～6.誘導(dǎo)4 h；7～9.誘導(dǎo)6 h；10～12.誘導(dǎo)8 h；13～15.誘導(dǎo)10 h；16～18.誘導(dǎo)12 h。D．培養(yǎng)基pH優(yōu)化：1～3.pH為7時的全菌、上清、沉淀；4～6.pH為6；7～9.pH為8M.Protein marker.A.Optimization of induction temperature：1.Not induced；2-5.Bacteria，sediment，sediment and supernatant of recombinant plasmid at 37 ℃；6-8.Bacteria，supernatant and sediment of recombinant plasmid at 30 ℃.B.Optimization of IPTG：1-3.Bacteria，supernatant and sediment of recombinant plasmid with 1.2 mmol·L-1 IPTG；4-6.0.8 mmol·L-1 IPTG；7-9.0.4 mmol·L-1 IPTG.C.Optimization of induction time：1-3.Bacteria，supernatant and sediment of recombinant plasmid induced for 2 h；4-6.4 h；7-9.6 h；10-12.8 h；13-15.10 h；16-18.12 h.D.Optimization of pH：1-3.Bacteria，supernatant and sediment of recombinant plasmid at pH7；4-6.pH6；7-9.pH8圖6　重組蛋白誘導(dǎo)條件優(yōu)化Fig.6　Optimization of induction condition of recombinant protein

A．超聲破碎前；B．超聲破碎30 min；C．超聲破碎50 minA.Before ultrasonication；B.Ultrasonication for 30 min；C.Ultrasonication for 50 min圖7　超聲破碎條件的優(yōu)化 100×Fig.7　Optimization of ultrasonication 100×

2.4Visfatin重組蛋白的純化及鑒定

2.4.1Visfatin重組蛋白的純化經(jīng)DNAstar軟件分析，pET30a-Visfatin重組蛋白大小為60 ku左右。將超聲破碎所得上清經(jīng)鎳離子親和層析進行純化，經(jīng)預(yù)試驗洗滌、洗脫濃度梯度摸索后，最終確定洗滌液為50 mmol·L-1咪唑，采用150 mmol·L-1咪唑洗脫液洗脫目的蛋白，可得到較純的目的蛋白。用20 mmol·L-1PB(pH7.4)進行透析，經(jīng)12% SDS-PAGE分析純化蛋白(圖8)，結(jié)果可見一條清晰的大小為60 ku的單一蛋白條帶，與預(yù)期的蛋白大小一致。經(jīng)檢測，200 mL菌液可得到濃度為1 mg·mL-1的蛋白溶液約10 mL，計算可知，1 L菌液可得到10 mg Visfatin重組蛋白。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.流出液；2.純化前蛋白；3.純化后洗脫的目的蛋白M.Protein marker；1.Effluent；2.Not purified protein；3.Purified protein圖8　SDS-PAGE檢驗重組蛋白純化結(jié)果Fig.8　SDS-PAGE analysis on expression products of Visfatin

2.4.2Visfatin重組蛋白的Western blot鑒定將純化的Visfatin蛋白進行Western blot后，結(jié)果顯示，純化后的Visfatin蛋白能與6*His，His-Tag Monoclonal Antibody特異性結(jié)合，在約60 ku處可看到一條明顯的條帶，進一步證實該純化蛋白為含6*His標(biāo)簽的雞Visfatin融合蛋白，即已純化得到目的蛋白Visfatin。

2.53T3-L1細(xì)胞檢驗重組Visfatin活性

2.5.1油紅O染色分別將由0.1 μg·mL-1人重組Insulin/雞重組Visfatin/對照(PBS)誘導(dǎo)8 d的3T3-L1細(xì)胞進行油紅O染色。倒置熒光相差顯微鏡100倍放大拍照觀察，染色結(jié)果顯示，Visfatin可以促進細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積聚，促進細(xì)胞分化，但是作用不及胰島素(圖8)。由此可初步判斷，雞重組Visfatin具有生物學(xué)活性。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3.陰性對照；2、4.純化后蛋白M.Protein marker；1，3.Control；2.Purified protein圖9　Western blot鑒定純化蛋白Fig.9　Identification results of Visfatin by Western blot

2.5.2qRT-PCR檢測相關(guān)基因mRNA表達(dá)量試驗處理分為4組，分別用Chicken Visfatin、Human Visfatin、Insulin和PBS誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化，通過qRT-PCR方法檢測3T3-L1脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因(PPARγ、aP2、FAS、C/EBPα)的mRNA表達(dá)量變化，進一步驗證雞Visfatin對脂肪細(xì)胞分化的影響，即雞重組Visfatin的活性。定量結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化第4天時，各基因各組間差異顯著情況不盡相同，但總體表達(dá)趨勢一致；分化第8天時，除FAS基因外，Human Visfatin與對照組相比表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，其余各組間各基因表達(dá)量差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)(圖11)。由此可進一步說明雞重組Visfatin與胰島素、人重組Visfatin作用類似，可以促進3T3-L1向脂肪細(xì)胞分化，同時表明雞重組Visfatin具有生物學(xué)活性。

圖10　3T3-L1細(xì)胞的油紅O染色 100×Fig.10　Oil Red O staining of 3T3-L1 100×

圖11　3T3-L1分化標(biāo)志基因的mRNA相對表達(dá)量Fig.11　mRNA relative expression of marker genes

3　討　論

Visfatin是新發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞因子[10]，由于其在糖尿病、肥胖、胰島素抵抗、代謝綜合征、心血管疾病、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和癌癥等疾病的防治上均表現(xiàn)出一定的作用[11，16]，在人和哺乳動物上研究眾多，而作為潛在的家禽增食因子[1]，也開始受到關(guān)注。雖然研究逐漸在深入，但雞Visfatin的重組表達(dá)卻仍未見報道。雞Visfatin是一個由493個氨基酸殘基組成的分子量為52 ku的多肽。韓瑞麗等人預(yù)測雞Visfatin的氨基酸序列具有6個功能基序，26個磷酸化位點；該蛋白具有NAPRTase家族保守結(jié)構(gòu)域特征，不具有信號肽序列，但存在一個疏水性區(qū)域；在第145～163位氨基酸殘基處存在一個由內(nèi)向外的跨膜螺旋肽段；不同物種之間該蛋白的相似性達(dá)90%以上，具有高度保守性[5]。本研究成功構(gòu)建雞Visfatin的原核表達(dá)質(zhì)粒，定向轉(zhuǎn)化獲得高表達(dá)工程菌，通過簡單的純化步驟獲得了純度較高、活性較好的Visfatin蛋白，為其在家禽領(lǐng)域的進一步研究奠定了基礎(chǔ)，并填補了雞重組Visfatin成功表達(dá)這一科研空白。

Visfatin在家禽領(lǐng)域中的研究較少，其生理作用尚不明確。研究表明，雞Visfatin在不同組織中均有表達(dá)，胸肌表達(dá)量最高，其次是肝和腿肌[4]。鑒于肝RNA較易提取，本試驗選擇肝組織作為克隆Visfatin基因的樣本。本試驗選用的大腸桿菌表達(dá)菌株遺傳背景研究較為清楚且經(jīng)濟方便，是目前應(yīng)用較為廣泛的外源重組蛋白表達(dá)研究方法[17]。由于pET系統(tǒng)所帶標(biāo)簽小，表達(dá)量大，不影響目的蛋白活性，且pET-30a表達(dá)載體N端含有編碼6個組氨酸的標(biāo)簽序列，純化、鑒定極為方便，故選其作為表達(dá)載體[18-19]。此外，為了更為高效的定向轉(zhuǎn)化目的基因，我們采用了雙載體系統(tǒng)(pGEM-T和pET-30a)構(gòu)建目的質(zhì)粒。

活性蛋白的產(chǎn)率取決于蛋白合成、折疊及聚集速率，如果新生肽鏈的聚集速率超過蛋白折疊的速率就會形成包涵體。外源蛋白在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)時，多以無活性的包涵體形式存在，因此需要對表達(dá)條件進一步優(yōu)化進而獲得可溶性目的蛋白[20]。一般情況下，蛋白的可溶性表達(dá)可以通過降低重組蛋白的合成速率(如降低培養(yǎng)溫度)或改變培養(yǎng)基的成分來實現(xiàn)[21]。因此，一方面，本試驗選擇37和30 ℃進行培養(yǎng)溫度優(yōu)化，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)時蛋白的表達(dá)量很高，但90%是以包涵體的形式存在；30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)時，可溶性蛋白的表達(dá)量占總表達(dá)量的80%，同時蛋白總表達(dá)量沒有降低，所以30 ℃是最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)溫度；另一方面，基于培養(yǎng)基的pH距重組蛋白等電點越遠(yuǎn)，其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物就越不容易形成包涵體這一理論特點，本研究通過軟件預(yù)測出Visfatin重組蛋白的等電點是6.93，因此選擇培養(yǎng)基的pH梯度為pH6、7、8，當(dāng)培養(yǎng)基的pH為8時，蛋白的可溶性表達(dá)量達(dá)到最大。此外，本試驗還從誘導(dǎo)時間、IPTG濃度以及超聲破碎時間等方面對其誘導(dǎo)表達(dá)條件進行了優(yōu)化，確定了最優(yōu)表達(dá)條件，獲得了較為理想的表達(dá)效果。其中，超聲破碎菌體易產(chǎn)生大量的熱，容易使蛋白變性，故試驗中采取低溫處理措施[21]。

重組蛋白純化時，His標(biāo)簽?zāi)芘c鎳離子特異性結(jié)合，因此目的蛋白可以特異結(jié)合到鎳離子柱表面，其他雜蛋白則隨洗滌液流出；洗脫時，則只需提高咪唑濃度與His標(biāo)簽競爭鎳離子結(jié)合位點，將目的蛋白從柱子上洗脫[22]。前期做了大量咪唑濃度梯度摸索(結(jié)果未展示)，最終確定最佳洗滌濃度為50 mmol·L-1，洗脫濃度為150 mmol·L-1。SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示，純化所得重組蛋白與預(yù)期大小一致，且純度較高，特異性較好。

有關(guān)Visfatin活性鑒定的報道并不多，就目前來說，通過檢測Visfatin對3T3-L1細(xì)胞分化的影響來間接說明Visfatin有無活性可能是唯一一種檢驗Visfatin活性的方法。3T3-L1細(xì)胞具有分化成為脂肪細(xì)胞的潛能，一般需要在Insulin、Dex、IBMX等試劑的誘導(dǎo)下分化成為成熟的脂肪細(xì)胞。該過程由多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控完成，不但環(huán)狀脂滴逐漸明顯形成，可用油紅O染色觀察[23]；同時分化相關(guān)標(biāo)志基因PPARγ、aP2、FAS、C/EBPα表達(dá)量也會跟著發(fā)生改變[24-25]，可通過實時熒光定量技術(shù)檢測。Visfatin具有類胰島素作用，且市面有售人重組Vistatin成品，故試驗設(shè)Insulin/重組Visfatin/雞重組Visfatin/空白(PBS)4組進行比較。試驗結(jié)果很好地證明了雞重組Visfatin具有生物學(xué)活性。

4　結(jié)　論

本試驗通過克隆表達(dá)雞重組Visfatin成功構(gòu)建了pET30a-Visfatin質(zhì)粒表達(dá)載體，并優(yōu)化了目的基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)條件，經(jīng)過純化得到了純度較高的雞Visfatin蛋白，且該蛋白具有生物學(xué)活性。由此建立了一套雞重組Visfatin的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)程序，為Visfatin在家禽領(lǐng)域的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]FUKUHARA A，MATSUDA M，NISHIZAWA M，et al.Visfatin：a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin[J].Science，2005，307(5708)：426-430.

[2]REVOLLO J R，K?MER A，MILLS K F，et al.Nampt/PBEF/visfatin regulates insulin secretion in β cells as a systemic NAD biosynthetic enzyme[J].CellMetab,2007，6(5)：363-375.

[3]REVOLLO J R，GRIMM A A，IMAI S.The regulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis by Nampt/PBEF/visfatin in mammals[J].CurrOpinGastroenterol，2007，23(2)：164-170.

[4]ONS E，GERTLER A，BUYSE J，et al.Visfatin gene expression in chickens is sex and tissue dependent[J].DomestAnimEndocrinol，2010，38(2)：63-74.

[5]韓瑞麗.雞 visfatin 和 PRDMl6 基因遺傳變異及其效應(yīng)與表達(dá)研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

HAN R L.Study on genetic variation and its effects and expression of visfatin and PRDM16 gene in chickens[D].Yangling：North West Agriculture and Forestry University，2010.(in Chinese)

[6]SAMAL B，SUN Y，STEARNS G，et al.Cloning and characterization of the cDNA encoding a novel human pre-B-cell colony-enhancing factor[J].MolCellBiol，1994，14(2)：1431-1437.

[7]KL?TING N，KL?TING I.Visfatin：gene expression in isolated adipocytes and sequence analysis in obese WOKW rats compared with lean control rats[J].BiochemBiophysResCommun，2005，332(4)：1070-1072.

[8]CHEN H，XIA T，ZHOU L，et al.Gene organization，alternate splicing and expression pattern of porcine visfatin gene[J].DomestAnimEndocrinol，2007，32(3)：235-245.

[9]CHEN M P，CHUNG F M，CHANG D M，et al.Elevated plasma level of visfatin/pre-B cell colony-enhancing factor in patients with type 2 diabetes mellitus[J].JClinEndocrinolMetab，2006，91(1)：295-299.

[10]OGNJANOVIC S，BRYANT-GREENWOOD G D.Pre-B-cell colony-enhancing factor，a novel cytokine of human fetal membranes[J].AmJObstetGynecol，2002，187(4)：1051-1058.

[11]YE S Q，SIMON B A，MALONEY J P，et al.Pre-B-cell colony-enhancing factor as a potential novel biomarker in acute lung injury[J].AmJRespirCritCareMed，2005，171(4)：361-370.

[12]CLINE M A，NANDAR W，PRALL B C，et al.Central visfatin causes orexigenic effects in chicks[J].BehavBrainRes，2008，186(2)：293-297.

[13]BRUNETTI L，RECINELLA L，DI NISIO C，et al.Effects of visfatin/PBEF/NAMPT on feeding behaviour and hypothalamic neuromodulators in the rat[J].JBiolRegulHomeostAgents，2011，26(2)：295-302.

[14]韓瑞麗，康相濤，魏楊，等.雞 visfatin 基因第 9 內(nèi)含子 4 個 SNPs 的關(guān)聯(lián)分析[C].南京：第十二次全國畜禽遺傳標(biāo)記研討會，2010.

HAN R L，KANG X T，WEI Y，et al.Association analysis of 4 SNPs in the ninth intron of visfatin gene in chicken[C].Nanjing：Conference Proceedings of the 12th National Symposium on Genetic Markers of Livestock and Poultry，2010.(in Chinese)

[15]LI J，MENG F，SONG C，et al.Characterization of chicken visfatin gene：cDNA cloning，tissue distribution，and promoter analysis[J].PoultSci，2012，91(11)：2885-2894.

[16]SETHI J K，VIDAL-PUIG A.Visfatin：the missing link between intra-abdominal obesity and diabetes[J].TrendsMolMed，2005，11(8)：344-347.

[17]范翠英，馮利興，樊金玲，等.重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)的研究進展[J].生物技術(shù)，2012，22(2)：76-80.

FAN C Y，F(xiàn)ENG L X，F(xiàn)AN J L，et al.Recent advances on the expression systems for recombinant protein production[J].Biotechnology，2012，22(2)：76-80.(in Chinese)

[18]RIBAS A V，HO P L，TANIZAKI M M，et al.High-level expression of tetanus toxin fragment C-thioredoxin fusion protein inEscherichiacoli[J].BiotechnolApplBiochem，2000，31(2)：91-94.

[19]ZHAO J H，XU Z，HUA Z C.Expression of human cardiac-specific homeobox protein in Escherichia coli[J].ProteinExprPurif，2000，18(3)：316-319.

[20]KANE J F，HARTLEY D L.Formation of recombinant protein inclusion bodies inEscherichiacoli[J].TrendsBiotechnol，1988，6(5)：95-101.

[21]葉姣，陳長華，夏杰，等.溫度對重組大腸桿菌生長及外源蛋白表達(dá)的影響[J].華東理工大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2002，28(4)：364-367.

YE J，CHEN C H，XIA J，et al.Effect of temperature on the growth of recombinantE.coliand on the expression of recombiant protein[J].JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology，2002，28(4)：364-367.(in Chinese )

[22]PORATH J.Immobilized metal ion affinity chromatography[J].ProteinExprPurif，1992，3(4)：263-281.

[23]LIN F T，LANE M D.CCAAT/enhancer binding protein alpha is sufficient to initiate the 3T3-L1 adipocyte differentiation program[J].ProcNatlAcadSci，1994，91(19)：8757-8761.

[24]初明，胡志強，魏蘭蘭，等.白黎蘆醇對垂體腺瘤GH3細(xì)胞生長及其分子機制的研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2003，83(22)：2004-2006.

CHU M，HU Z Q，WEI L L，et al.Studies on the effect of resveratrol on growth of GH3 cells and its molecular mechanism in pituitary adenomas[J].NationalMedicalJournalofChina，2003，83(22)：2004-2006.(in Chinese )

[25]WU Z，ROSEN E D，BRUN R，et al.Cross-regulation of C/EBPα and PPARγ controls the transcriptional pathway of adipogenesis and insulin sensitivity[J].MolCell，1999，3(2)：151-158.

(編輯郭云雁)

Prokaryotic Expression，Purification and Bioactivity Identification of Recombinant Chicken Visfatin Protein

ZHANG Pan-pan#，SHANG Peng-fei#，TIAN Fang-yuan，HAN Rui-li，JIANG Rui-rui，SUN Gui-rong，KANG Xiang-tao，LIU Xiao-jun，TIAN Ya-dong*

(HenanInnovativeEngineeringResearchingCenterofPoultryGermplasmResources，CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

The objective of the present study was to obtain recombinant chicken Visfatin protein with biological activity.The total RNA was extracted from livers of AA broilers.TheVisfatincDNA was first amplified by qRT-PCR and cloned into pGEM?-T vector.The cDNA was then cut out from pGEM?-T vector by digestion with endonucleaseNcoⅠ andXhoⅠand inserted into corresponding cloning sites of the plasmid pET-30a.The positive recombinant plasmid designated as pET-30a-Visfatin was transformed intoE.coliBL21 (DE3) competent cells.The cells containing pET-30a-Visfatin were identified.The conditions of IPTG induction were optimized by examining the expression level of recombinant protein using SDS-PAGE analysis.The recombinant protein was purified by Nickel ion affinity chromatography.The identification of the purified recombinant protein was checked by Western blot and the bioactivity was examined by looking into differentiation status of 3T3-L1 cells.A fragment which was the same size to prediction was observed when the recombinant plasmid pET-30a-Visfatin was digested with endonucleaseNcoⅠ andXhoⅠ.It indicated that the recombinant expression vector was constructed successfully.The SDS-PAGE analysis revealed that the optimum conditions of induction were 0.4 mmol·L-1IPTG，pH 8.0，at 30 ℃ for 10-12 h.The molecular weight of the recombinant protein was about 60 ku，which was the same to prediction.The Western blot analysis indicated that the recombinant protein could be recognized by anti-His antibody.Additionally，the Oil Red O stain assay showed that there were more lipid droplets formation in 3T3-L1 cells induced by Visfatin than that in the controls.Meanwhile，the results of qRT-PCR revealed that the expression levels of genes involved in cell differentiation such asPPARγ，aP2，F(xiàn)ASandC/EBPαincreased significantly (P<0.05) when 3T3-L1 cells induced by Visfatin.This study successfully established a standardized expression program for recombinant chicken Visfatin protein production，and obtained the purified recombinant protein with biological activity，which laid a foundation for further research in the field of poultry.

chicken recombinant Visfatin；cloning；prokaryotic expression；condition optimization；3T3-L1

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.006

2016-03-02

國家自然科學(xué)基金(31372330)；教育部創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(IRT1236)；農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)科研杰出人才及其創(chuàng)新團隊；河南省重大科技專項(151100110800)

張盼盼(1989-)，女，河南商丘人，碩士，主要從事家禽分子營養(yǎng)研究，E-mail：jqzxzpp2013@126.com；商鵬飛(1986-)，女，河南濟源人，碩士，主要從事家禽分子營養(yǎng)研究，E-mail：shangpengfei13@163.com。二者同為第一作者

田亞東，副教授，博士，研究生導(dǎo)師，主要從事家禽營養(yǎng)和家禽生產(chǎn)研究，E-mail：ydtian111@163.com

S831.2

A

0366-6964(2016)09-1785-10