陳靜，胡海峰

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院 國藥集團(tuán)健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，上海 200040)

HPLC測定馬黛茶中咖啡因和可可堿含量

陳靜，胡海峰*

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院 國藥集團(tuán)健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，上海 200040)

目的建立了同時(shí)測定馬黛茶生物堿(可可堿和咖啡因)含量的高效液相色譜法。方法采用華譜Unitary C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇和0.5%甲酸水溶液為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為280 nm。結(jié)果馬黛茶中可可堿和咖啡因在5.010～200.0 μg·mL-1呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，r均大于0.999，RSD均小于1.70%，平均回收率分別為96.59%和97.20%。結(jié)論該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可用于馬黛茶的質(zhì)量控制。

馬黛茶；生物堿；可可堿；咖啡因；HPLC

馬黛Ilexparaguaynensis生長于南美叢林，是冬青科大葉冬青近似的一種多年生木本植物，樹上嫩葉經(jīng)人工采摘、烘焙，就制成了南美人常飲用的巴拉圭茶，俗稱馬黛茶，與咖啡、茶(紅茶、綠茶等)并稱為“世界三大茶”[1]。馬黛茶富含196種活性元素，長期飲用可改善人體內(nèi)環(huán)境，提升血液品質(zhì)，全面保持機(jī)體營養(yǎng)平衡，是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)的能實(shí)現(xiàn)雙向生理調(diào)節(jié)作用的少數(shù)幾種單科植物之一[2-3]。除了馬黛多酚，生物堿也是馬黛茶的主要活性成分，含量最多的是咖啡因和可可堿[4]。目前國內(nèi)對(duì)馬黛茶生物堿的分析及定量研究均未見報(bào)道。本研究建立HPLC定量分析馬黛茶中2種生物堿的方法，有助于完善馬黛茶的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 1525二元泵，2707自動(dòng)進(jìn)樣器，2998DAD檢測器，Breeze色譜工作站；BUCHI R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (瑞士Buchi公司)；粉碎機(jī)(XL-400B型)；分析天平(METTLER TOLEDO AG135)；eppendorf Research plus(100 μL、200 μL、1 mL)。

1.2 試藥

對(duì)照品：可可堿(上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1056/15687，含量≥98.0%)；咖啡因(上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1392/15686，含量≥98.0%)；青色和黃色馬黛茶(巴西BARAO馬黛茶)；甲醇為色譜級(jí)，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為華譜Unitary C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.5%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)；采用梯度洗脫(0～10 min，90%A，10%B；10～30 min，50%A，50%B)；流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為280 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為10 μL；分離度大于1.5；理論塔板數(shù)按可可堿峰和咖啡因峰計(jì)算不低于5000。HPLC圖見圖1。

注：A.混合對(duì)照品；B.提取物樣品；1.可可堿；2.咖啡因。圖1 馬黛茶提取物及混合對(duì)照品HPLC圖

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

2.2.1 可可堿對(duì)照品的制備 由于可可堿在水中的溶解度較小，需要在熱水中溶解。精密稱定可可堿對(duì)照品10.00 mg，加水溶解并定容到25 mL容量瓶中制成對(duì)照品貯備液。使用時(shí)根據(jù)需要用水稀釋至相應(yīng)的濃度。

2.2.2 咖啡因?qū)φ掌返闹苽?精密稱定咖啡因?qū)φ掌?0.00 mg，加水溶解并定容到10 mL容量瓶中制成對(duì)照品貯備液。使用時(shí)根據(jù)需要用水稀釋至相應(yīng)的濃度。

2.2.3 可可堿和咖啡因混合對(duì)照品溶液制備 分別取可可堿、咖啡因?qū)φ掌焚A備液250、100 μL，將其混合液定容至1 mL，配制成混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備[5]

將青色馬黛茶粉碎，過32目篩備用，稱取青色馬黛茶3.00 g，加入60 mL娃哈哈純凈水，在80 ℃下回流提取1.0 h，趁熱過4層紗布，定容至50 mL的容量瓶中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取可可堿對(duì)照品適量，加水制成每1 mL含可可堿0.400 mg的溶液，即得。精密稱取咖啡因?qū)φ掌愤m量，加水制成每1 mL含咖啡因1.000 mg的溶液，即得。將上述可可堿和咖啡因?qū)φ掌贩謩e依次稀釋，制成一系列濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)行測定。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果可可堿在5.010～200.0 g·mL-1、咖啡因在5.010～200.0 g·mL-1線性關(guān)系良好，符合外標(biāo)法定量測定的要求?？煽蓧A回歸方程：Y=36 123X-66 922(r=0.999 1)?？Х纫蚧貧w方程：Y=21 852X-13 916(r=0.999 8)。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液(批號(hào)：20150208)，按2.1色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄可可堿和咖啡因的峰面積，結(jié)果可可堿和咖啡因峰面積的RSD分別為0.70%、0.61%，結(jié)果表明，所用儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品(批號(hào)：20150208)，分別于0、2、4、6、8、19、24 h，按2.1色譜條件進(jìn)樣測定，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果可可堿和咖啡因峰面積的RSD分別為0.38%、0.90%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(20150208)6份，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，結(jié)果可可堿和咖啡因峰面積的RSD分別為1.34%、1.65%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的樣品(批號(hào)：20150208，可可堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.020%，咖啡因質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.13%)樣品6份，每份約2.0 g，精密稱定，分別加入一定量的可可堿和咖啡因?qū)φ掌啡芤海凑?.3方法制備供試品溶液，按照2.1方法進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 馬黛茶中可可堿和咖啡因回收率測定

2.9 樣品測定

各種馬黛茶葉樣品按2.3方法平行制備3份樣品溶液，在2.1色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 不同馬黛茶產(chǎn)品中生物堿含量測定(n=3) /mg·g-1

注：總生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為可可堿、咖啡因的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)最初選擇等度洗脫，流動(dòng)相比例為甲醇-水(15∶85)，在該條件下進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)可可堿和咖啡因?qū)φ掌芬合鄨D譜存在拖尾現(xiàn)象。為了解決拖尾現(xiàn)象，可在流動(dòng)相中添加酸[6-7]，如：磷酸、甲酸、乙酸。由于磷酸的酸性較強(qiáng)，容易損壞儀器和柱子，因此選用甲酸。流動(dòng)相選為甲醇-0.5%甲酸溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入甲酸后，可可堿和咖啡因?qū)φ掌芬合鄨D譜中峰的拖尾現(xiàn)象明顯減少。

3.2 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器對(duì)2種生物堿對(duì)照品進(jìn)行波長掃描，可可堿和咖啡因最大波長均在272 nm，其280 nm處生物堿的吸收與270 nm處無明顯差異，通過對(duì)比有關(guān)馬黛茶生物堿參考文獻(xiàn)中可可堿和咖啡因的含量測定方法，檢測波長定為280 nm[8-9]。

3.3 梯度條件的優(yōu)化

由于馬黛茶水提物中存在多種物質(zhì)，等度洗脫無法將樣品中的各種物質(zhì)很好地分離，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了多種梯度洗脫條件研究，最終確定以下洗脫程序：0～10 min，甲醇為10%；10～30 min，甲醇為50%。在此梯度條件下，可可堿和咖啡因均能得到較好的分離，峰形良好，保留時(shí)間穩(wěn)定。

實(shí)驗(yàn)建立的分析方法簡便、準(zhǔn)確、分離度與穩(wěn)定性好，可作為馬黛茶的質(zhì)量控制方法。

[1] 趙琪，臧曉韻，胡海峰.馬黛茶多酚的加壓毛細(xì)管電色譜法的定量分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41(1):234-238.

[2] Márquez V，Martínez N，Guerra M，et al.Characterization of aroma-impact compounds in yerba mate (Ilex paraguariensis) using GC-olfactometry and GC-MS[J].Food Research International，2013，53(2)：808-815.

[3] 于少泓，吳俊玲，劉昭純.馬黛茶臨床作用研究進(jìn)展[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，34(4)：370-372.

[4] 吳俊玲，高紅莉，劉昭純.馬黛茶及有效成分研究概況[J].山東中醫(yī)雜志，2010，29(9)：650-652.

[5] 王忠華，史姍姍，陳雨，等.浙貝母生物堿提取工藝研究[J].中藥材，2010，33(1)：128-132.

[6] 宋玉國，張新茹，李秀芬，等.HPLC測定清咳平喘顆粒中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量[J].中國現(xiàn)代中藥，2014，16(4)：319-322.

[7] 劉軍鋒，邵萌，李景源，等.RP-HPLC測定苦木生物堿體外對(duì)磷酸二酯酶4的抑制活性[J].中國現(xiàn)代中藥，2009，11(3)：30-33.

[8] Mazzafera P.Maté drinking：caffeine and phenolic acid intake[J].Food Chemistry，1997，60(1)：67-71.

[9] Heck C I，De Mejia E G.Yerba Mate Tea (Ilex paraguariensis)：a comprehensive review on chemistry，health implications，and technological considerations[J].Journal of Food Science，2007，72(9)：R138-R151.

DeterminationofCaffeineandTheobromineinMateTea(Ilexparaguariensis)byHPLC

CHENGJing，HUHaifeng*

(SinopharmHealthIndustryInstituteCo，Ltd，ChinaStateInstituteofPharmaceuticalIndustry，Shanghai200040,China)

Objective：An HPLC method was established for simultaneous determination of theobromine and caffeine—two bioactive compounds from Mate Tea (Ilexparaguariensis).MethodsAn Unitary C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)column was used with the mobile phase of methanol and water containing 0.5% of formic acid at the detection wave length of 280 nm and the flow rate of 1.0 mL·min-1.ResultsThe two alkaloids were successfully separated in 30min，and the calibration curves of theobromine and caffeine were linear in the range of 5.010-200.0 μg·mL-1with correlation coefficient of 0.999.The recovery rates were 96.59% and 97.20%，respectively with RSD less than 1.70%.ConclusionThe established method is simple，accurate，sensitive and good repeatability，which can be applied for the quality control of Mate Tea (I.paraguariensis).

Mate Tea (Ilexparaguarienses)；alkaloids；theobromine；caffeine；HPLC

2015-04-13)

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胡海峰，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：微生物藥物研究與開發(fā)；E-mail：haifenghu88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.011