李曉華，劉春迎，張科強，呂　哲，陳　巖，倪曉鳳，高海成*

(1.吉林大學第二醫(yī)院，吉林 長春130041；2.公主嶺市范家屯第三醫(yī)院；3.吉林大學藥學院)

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蘆丁對高糖誘導心肌細胞中tTG表達的調(diào)控作用

李曉華1，劉春迎2，張科強1，呂哲3，陳巖3，倪曉鳳3，高海成3*

(1.吉林大學第二醫(yī)院，吉林 長春130041；2.公主嶺市范家屯第三醫(yī)院；3.吉林大學藥學院)

糖尿病性心肌病(DCM)在代謝紊亂及微血管病變的基礎(chǔ)上可引發(fā)心肌灶性壞死，出現(xiàn)心功能異常，導致心力衰竭、心律失常以及心源性休克，甚至猝死[1，2]。組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族的成員，它是鈣離子的依賴劑[3]。據(jù)報道，tTG存在于各種組織器官中，可在各組織中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。蘆丁作為黃酮類單體，已在市場上應用多年，那么其是否可調(diào)控tTG的表達，進而對DCM起到防治作用。本實驗將從細胞角度探究蘆丁對高糖誘導的心肌細胞中tTG表達的調(diào)控作用，進而為臨床診斷和治療DCM提供寶貴的意見。

1　材料和方法

1.1大鼠心肌細胞的培養(yǎng)

用大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)于含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞長至90%以上時傳代。

1.2流式細胞術(shù)

細胞培養(yǎng) 48h后，消化、收集細胞，每管細胞數(shù)為3×104，冷PBS洗2次，75%冰乙醇固定，搖勻、吹打，4℃保存過夜，用于細胞周期檢測。

1.3ELISA方法

各組培養(yǎng)孔中的上清液，按tTGELISA檢測試劑盒說明嚴格操作，顯色后，在酶標儀上、用波長 405-650nm間讀取數(shù)值。

1.4實時PCR方法

Trizol法提取總RNA,進行反轉(zhuǎn)錄。實時定量PCR反應體系20μl。反應條件為:95℃預變性30s，95℃變性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s,共30個循環(huán)。tTG: 5′-AAGGGAAGTCTTCACCAGAGCCAA-3′和 5′-CGATGTGGGCAAACACGTCAAAGT-3′。

1.5Westernblot方法

加入組織蛋白裂解液,研磨,4℃、12 000r/min離心20min，測定上清液蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入抗tTG及β-actin抗體,4℃過夜,加入二抗,37℃孵育2h，ECL試劑顯色。

1.6統(tǒng)計學方法

采用SPSS11.5 軟件統(tǒng)計，應用單因素方差分析(One-WayANOVA) 進行處理，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1蘆丁對大鼠心肌細胞周期的影響

由圖1可見，正常心肌細胞數(shù)為63.3%，B3區(qū)為61.1%；高糖刺激后心肌細胞數(shù)61.7%，B3區(qū)為61.6%。給予陽性藥和羅布麻提取物蘆丁后，其細胞數(shù)分別是65.04%和63.46%，B3區(qū)為87.7%和78.4%。

圖1　蘆丁對心肌細胞周期的影響

2.2ELISA測定心肌細胞上清液中FN和Col-I的含量

高糖誘導后，F(xiàn)N和Col-I的蛋白表達量有所增加(P< 0.05)；而給予陽性藥和蘆丁后，F(xiàn)N和Col-I表達量降低(P< 0.05)，說明蘆丁抑制了FN和Col-I膠原蛋白的表達，見表1。

表1　細胞上清液中FN 和 Col-I的含量(ng/ml)

*P<0.05vscontrol,△P<0.05vsmodel.

2.3心肌細胞上清液中tTG的基因表達

給予高糖后，tTG的基因表達量增加，說明高糖誘導心肌細胞損傷時，tTG參與了損傷的發(fā)生過程；注射陽性藥和蘆丁后，tTG的表達量降低(P<0.05)，抑制了tTG基因表達，見圖2。

2.4Westernblot測定心肌細胞上清夜中tTG的含量

高糖誘導后，tTG的蛋白表達量有所增加(P<0.05)；而給予陽性藥和蘆丁后，tTG表達量降低(P< 0.05)，說明蘆丁抑制了tTG膠原蛋白的表達，見圖3。

圖2各組心肌細胞上清液中tTG基因表達

圖3各組心肌細胞上清液中tTG的蛋白表達

3　討論

糖尿病(DM)為慢性代謝性、內(nèi)分泌失調(diào)性疾病，其并發(fā)癥包括眼、腦、心、腎以及血管等[5]。1974年，DCM被Hamby等[6]提出后，便引起科研人員的廣泛重視，其特點為心力衰竭發(fā)生率較高。DCM的發(fā)病是由糖脂代謝紊亂、細胞因子以及生長因子表達或活性增加等多種因素綜合作用的結(jié)果[7]。近年來，tTG在組織器官纖維化中的作用已備受關(guān)注。它屬于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族，它能催化細胞外基質(zhì)蛋白(谷氨酰胺殘基與賴氨酸殘基間的轉(zhuǎn)谷氨酰胺)反應，它可使纖維連接蛋白、膠原纖維、層粘連蛋白等發(fā)生交聯(lián)，形成穩(wěn)固結(jié)構(gòu)而抵抗基質(zhì)金屬蛋白酶的降解，是器官纖維化發(fā)生的重要因子[4]。研究證實[8]，糖尿病大鼠腎臟組織中tTG的蛋白活性及其交聯(lián)產(chǎn)物的水平均明顯增高。蘆丁作為黃酮類藥物，廣泛應用于臨床，其含量占總黃酮的70%-90%。蘆丁的又名蕓香甙、維生素P，其具有降低毛細血管脆性，改善微循環(huán)的作用。在臨床上，其主要用于糖尿病、高血壓、高血糖等輔助治療作用。在本研究中，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，蘆丁對細胞的周期有調(diào)控作用；高糖誘導的心肌細胞中tTG的蛋白和mRNA表達明顯增加，而蘆丁干預后其表達降低。

[1]WangK,HanD,ZhangY,etal.Protectiveeffectandmechanismofβ-CM7onreninangiotensinsystem&diabeticcardiomyopathy[J].ShengWuGongChengXueBao,2016,32(2):195.

[2]TorellaD,EllisonGM,TorellaM,etal.Carbonicanhydraseactivationisassociatedwithworsenedpathologicalremodelinginhumanischemicdiabeticcardiomyopathy[J].JAmHeartAssoc,2014,3(2):e000434.

[3]MunsieL,CaronN,AtwalRS,etal.Mutanthuntingtincausesdefectiveactinremodelingduringstress:defininganewrolefortransglutaminase2inneurodegenerativedisease[J].HumMolGenet,2011,20(10):1937.

[4]GaoHC,ZhuK,GaoHM,etal.Roleoftissuetransglutaminaseinthepathogenesisofdiabeticcardiomyopathyandtheinterventioneffectofrutin[J].ExpTherMed,2015,9(4):1103.

[5]QuilliotD,WaltersE,BonteJP,etal.Diabetesmellitusworsensantioxidantstatusinpatientswithchronicpancreatitis[J].AmJClinNutr,2005,81(5):1117.

[6]HambyRI,ZoneraichS,ShermanL.Diabeticcardiomyopathy[J].JAMA,1974,229(13):1749.

[7]簡春燕,吳鏗.糖尿病性心肌病發(fā)病機制和治療的研究現(xiàn)狀[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2012,6(1) :164.

[8]劉森炎,黃海長,李曉玫.組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與腎臟纖維化[J].生理科學進展,2005,36(4):314.

吉林省科技廳項目(3D515BR83432)；吉林大學共青團項目(451160306038)

1007-4287(2016)09-1445-02

2015-08-02)