歐陽資章，劉曉萍，陳　方，肖誠胤，賴香茂，鐘志華，阮　勁，鄧惠容，江　晟，王秋玲

(廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院·清遠市人民醫(yī)院，廣東清遠511518)

壞死性凋亡特異性抑制劑抗環(huán)孢素A致壞死性凋亡的機制研究＊

歐陽資章，劉曉萍，陳方，肖誠胤，賴香茂，鐘志華，阮勁，鄧惠容，江晟，王秋玲

(廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院·清遠市人民醫(yī)院，廣東清遠511518)

目的研究壞死性凋亡特異性抑制劑（Nec-1）抗環(huán)孢素A致壞死性凋亡的機制。方法將30只C57/BL6雄性小鼠隨機分為對照組、環(huán)孢素A組、Nec-1組，對照組給予橄欖油口服，環(huán)孢素A組以100 mg/(kg·d)灌胃給予環(huán)孢素A，Nec-1組在給予環(huán)孢素A前0.5 h采取腹腔注射方式給予Nec-1 2.5 mg/kg。14 d后測定小鼠血液肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)含量變化，皮質(zhì)中還原型谷胱甘肽(GSH)活性變化，丙二醛(MDA)含量變化;檢測皮質(zhì)中受體連接蛋白(RIP3)表達。結(jié)果處理后14 d，與對照組比較，環(huán)孢素A組能使血清中SCr及BUN水平明顯升高，皮質(zhì)中GSH活性下降，丙二醛(MDA)水平升高;與環(huán)孢素A組比較，Nec-1組SCr及BUN水平明顯下降，GSH活性增加，丙二醛含量下降(P＜0.05)，但3組小鼠皮質(zhì)中RIP3表達無明顯差異。結(jié)論Nec-1對環(huán)孢素A腎毒性具有保護作用，表明環(huán)孢素A腎毒性可能與壞死性凋亡有關(guān)。

環(huán)孢素A;壞死性凋亡特異性抑制劑;壞死性凋亡

環(huán)孢素A為傳統(tǒng)的免疫抑制藥物，用于腎抑制等，但其具有較明顯的腎毒性，影響了臨床應(yīng)用。關(guān)于環(huán)孢素A腎毒性的研究及其機制的研究已有許多，但引起腎毒性的機制目前仍未完全清楚［1-5］。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種新的細胞死亡方式，即能被壞死性凋亡特異性抑制劑（Nec-1）特異性抑制的壞死性凋亡［6-10］。環(huán)孢素A的腎毒性機制是否涉及壞死性凋亡，目前研究甚少。筆者曾采用大鼠腎小管上皮細胞NRK52E細胞，研究了環(huán)孢素A的腎毒性機制，研究結(jié)果顯示壞死性凋亡可能是環(huán)孢素A腎毒性的機制之一［11］。本研究中，筆者制作了小鼠環(huán)孢素A急性腎損傷模型，研究Nec-1是否對環(huán)孢素A的腎毒性有保護作用?，F(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1藥品、動物與分組

環(huán)孢素軟膠囊(商品名新賽斯平，杭州中美華東制藥有限公司，國藥準字H10960121，批號為140232，規(guī)格為每粒10 mg)，Nec-1(SIGMA公司，批號為MB5067);橄欖油為食用級別。

30只C57/BL6雄性小鼠購于廣東醫(yī)學實驗動物中心，動物注冊號為SCXK（粵）2013-0002;鼠齡(7.2±1.4)周;體重(20.7±2.5)g。各組試驗動物自由采食，常規(guī)商品飼料，自由飲水，每日12 h光照。將其隨機分為對照組、環(huán)孢素A組、Nec-1組，各10只。

1.2給藥方法

對照組給予橄欖油口服，環(huán)孢素A組以100 mg/(kg·d)灌胃給予環(huán)孢素A，Nec-1組在給予環(huán)孢素A前0.5 h采取腹腔注射方式給予Nec-1 2.5 mg/kg。

1.3觀察指標

小鼠經(jīng)處理后14 d，采集其靜脈血以全自動生化分析儀器測定血液肌酐(SCr)、尿素氮（BUN）含量變化;分離大鼠腎皮質(zhì)，剪碎，勻漿，取上清液，采用試劑盒測定小鼠腎皮質(zhì)中還原型谷胱甘肽(GSH)活性及丙二醛(MDA)含量。提取小鼠腎皮質(zhì)中蛋白質(zhì)，采用Western Blotting檢測RIP3表達。

1.4統(tǒng)計學處理

2　結(jié)果

2.1小鼠ScR，BUN，GSH，MAD含量

結(jié)果見表1。處理前，對照組與環(huán)孢素A組、Nec-1組在ScR，BUN，GSH，MDA水平等方面差異不顯著(P＞0.05);處理后14 d，Nec-1組的SCr，BUN，GSH，MDA各項指標水平與對照組差異不顯著(P＞0.05)，但環(huán)孢素A組SCr，BUN，MDA水平均顯著高于其他2組，而GSH水平顯著低于其他2組(P＜0.05)。

2.2小鼠全腎、皮質(zhì)、髓質(zhì)中RIP3表達情況

3組小鼠各部位中RIP3表達檢測結(jié)果見圖1。Wwestern Blotting結(jié)果顯示，3組RIP3表達無明顯差異(P＞0.05)。

表1　3組小鼠ScR，BUN，GSH，MDA水平變化水平比較(X±s，n=10)

圖1　3組小鼠皮質(zhì)部RIP3表達情況

3　討論

環(huán)孢素A目前仍是器官移植抗免疫排斥反應(yīng)主要藥物，然而其可導致腎小球濾過率降低、腎小管上皮細胞壞死、腎間質(zhì)纖維化等不良反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用［12-16］。目前有關(guān)環(huán)孢素A腎毒性的機制研究甚多，包括氧自由基損傷，血管的因子如血管內(nèi)皮素、血烷酸素分泌過多，腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活，局部交感神經(jīng)的激活等［17］。目前認為，環(huán)孢素A毒性分子機制集中在以下幾個方面［18］:環(huán)孢素A對腎小管上皮細胞有直接毒性，能啟動細胞內(nèi)、外凋亡途徑使腎小管上皮細胞凋亡或者壞死、甚至老化;環(huán)孢素A誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;環(huán)孢素A可直接刺激腎小管上皮細胞產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)。

細胞死亡方式包括凋亡與壞死，認為凋亡屬于一種程序性的死亡方式，可被調(diào)控;而在相當長的一段時間內(nèi)，認為細胞壞死并不能被調(diào)控，壞死只是一種被動的、偶然性的、無規(guī)律的死亡過程。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)一些不依賴于細胞色素釋放及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶活性的細胞死亡途徑同樣受到細胞內(nèi)許多信號通路的影響和精確調(diào)節(jié)。2005年，哈佛大學醫(yī)學院的袁鈞英首次報道了的一種由精確的細胞信號通路引起的壞死，即程序性壞死（necroptosis）。Necroptosis概念的提出顛覆了所有細胞壞死是被動、偶然、不能被調(diào)控的舊觀點。與傳統(tǒng)意義上壞死不同，其是一種由死亡受體通路介導的細胞死亡途徑，是主動的、程序性的細胞死亡，其涉及的信號蛋白包括RIP1與RIP3。它在形態(tài)學和功能上與凋亡也不同，在損傷早期就有胞膜完整性的損失和線粒體膜電位的下降。袁鈞英同時還從2萬個化合物中篩選了一種抑制壞死性凋亡的化學小分子，即Nec-1，其可作為壞死性凋亡的特異性抑制劑，凡是能被Nec-1抑制的細胞死亡方式被認為是壞死性凋亡。壞死性凋亡可能是某些藥物導致組織、器官毒性的重要機制，甚至可能是某些疾病發(fā)生的重要機制。已經(jīng)有研究嘗試將Nec-1用來預防、治療毒性物質(zhì)的毒性等［19］。

筆者在既往研究中曾運用NRK52E細胞模型研究表明壞死性凋亡參與了環(huán)孢素A的細胞毒性［11］，但目前尚無實驗動物方面的研究，故本研究采用小鼠探討環(huán)孢素A的腎毒性機制是否與壞死性凋亡有關(guān)。

本研究中，環(huán)孢素A組小鼠在處理14 d后，血液肌酐與尿素氮水平顯著提高，但Nec-1組無顯著變化，說明Nec-1能顯著抑制環(huán)孢素A對小鼠腎臟的毒性作用，防止腎小管上皮細胞凋亡或死亡的發(fā)生。環(huán)孢素A組小鼠處理14 d后，還原性谷胱甘肽顯著降低、丙二醛水平顯著上升，表明環(huán)孢素A處理后，小鼠體內(nèi)氧化程度加劇，但Nec-1組小鼠還原性谷胱甘肽與丙二醛水平與對照組無顯著差異，且顯著低于環(huán)孢素A組，說明Nec-1能有效降低環(huán)孢素A引起腎毒性。但遺憾的是，筆者并未測得RIP3蛋白表達的變化，環(huán)孢素A腎毒性壞死性凋亡的機制是否只影響RIP3的上游蛋白RIP1或只影響RIP3活性的變化，仍需要進一步研究。

綜上所述，壞死性凋亡參與了環(huán)孢素A的腎毒性，但目前尚無證據(jù)表明環(huán)孢素A可誘導RIP3的表達。

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Mechanism of Necrostatin-1 on Necroptosis Induced by Cyclosporin A

Ouyang Zizhang，Liu Xiaoping，Chen Fang，Xiao Chenyin，Lai Xiangmao，Zhong Zhihua，Ruan Jin，Deng Huirong，Jiang Sheng，Wang Qiuling
（The Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University·Qingyuan People's Hospital，Qingyuan，Guangdong，China511518）

ObjectiveTo explore the protective effect mechanism of necrostatin-1（Nec-1），a specific inhibitor of necroptosis，on nephrotoxicity of cyclosporin A（CsA）in vivo.Methods30 C57/BL6 male mice were randomly divided into the control group，CsA group and Nec-1 group.The control group was treated with olive oil.The CsA group was treated with CsA 100 mg/kg·d by gavage.The Nec-1 group was treated with Nec-1 2.5 mg/kg 0.5 h before treated with CsA.After 14 d of treatment，the content change of SCr，BUN were determined，the activity change of GSH and content change of MDA in the cortex were determined.The expressions of RIP3 in the cortex were detected.ResultsAfter 14 d of treatment，compared with the control group，the levels of SCr，BUN were increased，the activity of GSH in the cortex deceased，and MDA level increased in the CsA group；the levels of SCr，BUN were obviously decreased，the activity of GSH increased，and MDA level decreased in the Nec-1 group；however，the expression of RIP3 in the cortex of the 3 groups showed no significant difference.ConclusionNec-1 has obvious protective effect on nephrotoxicity induced by CsA.Necroptosis underlies mechanism of the toxicity of CsA.

cyclosporin A；necrostatin-1；necroptosis

R965;R979.5

A

1006-4931（2016）13-0010-03

2016-02-22;

2016-03-24）

＊廣東省醫(yī)學科學技術(shù)研究基金，項目編號:A201484016060888。