吳梅姐

（泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 福建泉州 362000）

欖綠粗葉木莖甲醇提取物體外抗菌活性研究

吳梅姐

（泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 福建泉州 362000）

目的 研究欖綠粗葉木莖甲醇提取物（以下簡(jiǎn)稱MESLL）的抗菌作用及機(jī)理。方法 體外抗菌實(shí)驗(yàn)，采用抑菌圈法及MIC法測(cè)定了金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌和大腸桿菌5種臨床常見致病性菌株的抗菌活性。②結(jié)果 MESLL對(duì)金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌均有一定程度的抗菌活性，而對(duì)其它3種菌株則無明顯抑制作用；結(jié)論 MESLL對(duì)金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌兩種測(cè)試菌株具有一定抗菌活性。

欖綠粗葉木 抗菌活性 抑菌圈 MIC

近年來，隨著抗生素、合成及半合成抗菌藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，使許多嚴(yán)重的感染性疾病得到有效控制。然而，由于抗生素的廣泛使用及濫用情況，臨床上細(xì)菌耐藥日益嚴(yán)重。減少細(xì)菌耐藥和耐藥菌株的產(chǎn)生是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界面臨的重要課題［1］。目前，隨循證醫(yī)學(xué)的發(fā)展，中藥及其復(fù)方制劑在抗感染新藥的研發(fā)方面日益引發(fā)關(guān)注。中藥有抗菌，緩解和消除細(xì)菌耐藥的作用。在幾千年的臨床應(yīng)用中仍未發(fā)現(xiàn)明顯的耐藥菌產(chǎn)生。粗葉木屬是茜草科中的一個(gè)大屬，約有180個(gè)種，間斷分布于亞洲、非洲至中、南美洲［2］。欖綠粗葉木為粗葉木屬中的一個(gè)變種，我國(guó)特有，分布于浙江、江西、福建等地，生長(zhǎng)在海拔300～1500米處的林下［3］?，F(xiàn)關(guān)于欖綠粗葉木的提取物的研究尚處于初始階段，民間對(duì)治療肝炎等疾病具有一定療效，至于欖綠粗葉木植物在抗菌方面的研究至今卻未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究對(duì)欖綠粗葉木甲醇提取物及其抗菌活性進(jìn)行了研究，并且通過測(cè)定經(jīng)MESLL處理后細(xì)菌培養(yǎng)液總糖濃度在不同時(shí)間內(nèi)的變化，初步探討其抑菌機(jī)理，以期為臨床研發(fā)藥物提供基礎(chǔ)資料。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥材和菌株

欖綠粗葉木購(gòu)自藥材市場(chǎng)；實(shí)驗(yàn)菌株購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)的凍干標(biāo)準(zhǔn)菌株，具體名稱和編號(hào)分別為：金黃色葡萄球菌（CMCC26003）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）、肺炎克雷伯菌（CMCC4 6 1 17）、奇異變形桿菌（CMCC4 9 005）、大腸桿菌（CMCC25922）。

1.2試劑和儀器

甲醇（分析純）、0.9%氯化鈉購(gòu)自廣東利泰制藥股份有限公司；多功能粉碎機(jī)（上海高翔食品機(jī)械廠GX-02）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司R-1002）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（精宏DNP-9162）；生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司BSC-1500IIA2-X）；高壓蒸汽滅菌鍋（日本Hirayama HAV-50）；雙目顯微鏡（日本尼康E-200）；電子天平 （瑞安市安特稱重設(shè)備有限公司LQ-A3002）。

1.3培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)及制備

肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L；牛肉膏3g/L；NaCl5g/L。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：在肉湯培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入瓊脂25g/L；；pH7.35-7.45。大致過程：配料；熔化；矯正pH；分裝；滅菌；倒板；檢定；保存。

1.4MESLL制備

收集欖綠粗葉木莖，經(jīng)鑒定后，洗凈并放于陰涼處自然晾干；用剪刀將其剪成長(zhǎng)2～3cm、寬0.5～1 cm碎片，置于多功能粉碎機(jī)內(nèi)粉碎，用100目篩子過。稱量500g，倒入5L棕色玻璃瓶中，加入甲醇浸泡、過濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)其上清液，得到甲醇提取物浸膏。配制成含50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10mg/ mL MESLL的溶液。放入4℃冰箱保存，待用。

1.5菌懸液的制備［4］

將供試的菌株進(jìn)行活化，取適量一活化培養(yǎng)好的菌株置于裝有9ml無菌水的試管中，制成菌懸液，再用無菌吸管取充分混合的菌懸液于試管中，加入9ml無菌水，用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法測(cè)菌體個(gè)數(shù)，調(diào)制濃度為含菌體為108cfu/ml的菌懸液，標(biāo)記備用。

2　MESLL體外抗菌實(shí)驗(yàn)

2.1抑菌圈的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用牛津杯結(jié)合紙片法測(cè)定抑菌圈。①取一無菌平板，在其底面作四等分，用蠟筆標(biāo)記菌株名稱、黃酮濃度和陰陽(yáng)性對(duì)照。②分別取0.1ml待試菌懸液注入標(biāo)記好的培養(yǎng)基表面，并使其均勻地涂布于平板表面。③用無菌鑷子將滅菌過的牛津杯置于預(yù)定位置，再用鑷尖輕壓牛津杯上部使之與平板緊貼。④用移液槍分別將100 、50mg/mL兩種濃度的MESLL各100ml打入牛津杯內(nèi)，以相同方式將生理鹽水作為陰性對(duì)照打入牛津杯內(nèi)。⑤用無菌鑷子夾取對(duì)該菌敏感的抗生素紙片貼于培養(yǎng)基表面，作為陽(yáng)性對(duì)照。⑥如上方法和步驟，將其余菌株做相同處理。⑦置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，18～24h測(cè)量抑菌圈直徑，并計(jì)算其平均值。

表1　MESLL抑菌圈直徑

表2　MESLL體外抗菌作用的MIC

2.2最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定［5-6］

MESLL50 g/L濃度起始，各細(xì)菌試驗(yàn)均采用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基倍比稀釋藥液8次，各藥液質(zhì)量濃度依次為：25，12.5，6.25，3.12，1.56，0.78，0.39，0.20 g/L，每孔1ml加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每稀釋度藥液設(shè)2個(gè)復(fù)孔，分別加入各試驗(yàn)菌液50ul，并設(shè)各菌液不加藥物的對(duì)照孔，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。以無細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最高稀釋度為MIC。

3　結(jié)果與討論

3.1MESLL對(duì)5種菌株的抗菌活性的測(cè)定

抑菌圈法測(cè)定50mg/ml、25 mg/ml 的抗菌效果如表1所示。陽(yáng)性對(duì)照參照2013年CLSI部分細(xì)菌抑菌圈直徑和最低抑菌濃度（MIC）解釋標(biāo)準(zhǔn)［7］?？傮w來看，欖綠粗葉木對(duì)供試菌肺炎克雷伯菌的抑制作用最強(qiáng)，其次為金黃色葡萄球菌。而對(duì)銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌等無明顯抑制作用，是否與MESLL濃度偏低，有待進(jìn)一步研究和探討。

3.2MIC的測(cè)定

MESLL對(duì)肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌均有一定強(qiáng)度的抑制作用，MIC分別達(dá)到0.39和0.2mg/ml，而銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌和大腸桿菌均為25 mg/ml，與抑菌圈結(jié)果相對(duì)應(yīng)，具體見表2

4　討論

4.1抗菌藥物自誕生起為細(xì)菌感染性疾病貢獻(xiàn)了非凡的成就。但隨著抗菌藥物的廣泛及不合理應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性問題近年來已經(jīng)發(fā)展到了非常嚴(yán)重的地步，醫(yī)學(xué)界雖已采取了一系列積極應(yīng)對(duì)措施，但細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性問題仍日趨嚴(yán)重，細(xì)菌耐藥性依然是當(dāng)前國(guó)內(nèi)乃至全世界普遍存在卻至今仍無法攻克的難題，已成為了全球關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。如汪復(fù)等［8］研究國(guó)內(nèi)主要地區(qū)各醫(yī)院證實(shí)細(xì)菌耐藥性仍是臨床重要問題，依然需要引起高度關(guān)注。

4.2肺炎克雷菌可引起典型的原發(fā)性肺炎，也可引起其他各部位感染。肺炎克雷伯菌是臨床感染性疾病和醫(yī)院感染中常見的、重要的病原菌。全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)和全國(guó)醫(yī)院感染監(jiān)控網(wǎng)報(bào)道，肺炎克雷伯菌的分離率居第2或第3位。隨抗菌藥的普遍使用，肺炎克雷伯菌多藥耐藥及耐藥的菌株問題日益嚴(yán)重［9］。金黃色葡萄球菌，特別是MRSA等多重耐藥菌的出現(xiàn)，使其成為了名副其實(shí)的超級(jí)細(xì)菌。且據(jù)美國(guó)CDC統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，MRSA感染的致死率已超過了艾滋病、帕金森和謀殺［10］。

4.3我國(guó)自20世紀(jì)40年代起研究中藥的體外抑菌試驗(yàn)，證明了一大批中藥對(duì)各種細(xì)菌有抑制作用［11］。，中藥及相關(guān)提取物制劑是祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，隨著循證醫(yī)學(xué)的發(fā)展和中藥抗菌機(jī)制及方法的不斷出現(xiàn)和更新，特別是“血清藥理學(xué)”的提出，極大地推動(dòng)抗菌中藥體內(nèi)外的研究和開發(fā)，讓研究者更加重視中藥的臨床研究，以此緩解和控制抗生素濫用給人類帶來的長(zhǎng)期懸而未解的難題。

［1］劉云寧，李小鳳，班旭霞，等.中藥抗菌成分及其抗菌機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2015，8（8）1012-1016.

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1674-2060（2016）05-0020-02