許曉鵬鄭志永朱莉詹曉北

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝及技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 江蘇無(wú)錫 214122）

通過(guò)N-乙酰葡萄糖胺測(cè)定Sphingomonas sp.31555菌體量方法探討

許曉鵬1，2鄭志永1朱莉1詹曉北1，2

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝及技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 江蘇無(wú)錫 214122）

建立了一種新的方法測(cè)定威蘭膠發(fā)酵液中的生物量，對(duì)該新方法進(jìn)行初步條件優(yōu)化以及干擾因子的排除，研究氨糖與菌體量的相關(guān)性。結(jié)果表明：隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，產(chǎn)膠量也會(huì)上升，而本方法應(yīng)用于威蘭膠發(fā)酵液中的生物量，并不受威蘭膠及威蘭膠水解產(chǎn)物的干擾影響。

N-乙酰葡萄糖胺 Sphingomonas sp.31555 威蘭膠

前言

Sphingomonas sp.31555是鞘氨醇單胞屬，革蘭氏陰性細(xì)菌，用于PVC降解，發(fā)酵產(chǎn)威蘭膠多糖等用處［1］。威蘭膠具有優(yōu)良的觸變性、懸浮性、水溶性等流變性能，且具有卓越的穩(wěn)定性，市場(chǎng)前景廣闊。它主要作為增稠劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)滑劑、成膜劑和粘合劑應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)的各個(gè)方面，尤其在混凝土、石油、石墨等工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景［2］。威蘭膠是美國(guó)的CP Kelco公司上世紀(jì)80年代繼黃原膠、結(jié)冷膠之后開(kāi)發(fā)的最具市場(chǎng)前景的微生物代謝多糖之一。

雖然已有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)商品威蘭膠的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究［3-4］，但是對(duì)威蘭膠發(fā)酵液中的菌體量準(zhǔn)確測(cè)定的全面研究也鮮見(jiàn)報(bào)道，盡管生物量的準(zhǔn)確測(cè)定在工業(yè)應(yīng)用中對(duì)威蘭膠的代謝調(diào)控過(guò)程非常重要［5］。因?yàn)橥m膠是高粘度微生物多糖，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液的粘度不斷升高，因此采用傳統(tǒng)測(cè)定菌體量的方法不能準(zhǔn)確的測(cè)定威蘭膠發(fā)酵液中的菌體含量，因此探討用測(cè)定微生物細(xì)胞中的特定成分，使此方法不受威蘭膠的產(chǎn)生的干擾，從而準(zhǔn)確測(cè)得微生物量是本文的研究?jī)?nèi)容。

細(xì)菌的細(xì)胞壁與原生質(zhì)膜之間，有一層很薄的胞外質(zhì)空間，是分隔細(xì)胞壁的最內(nèi)層，由一種高度交織的物質(zhì)組成，稱為胞壁質(zhì)。其主要成分為肽聚糖，是構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞壁骨架的基礎(chǔ)物質(zhì)，占G+細(xì)菌細(xì)胞壁成分的95%，G-細(xì)菌細(xì)胞壁也含有5%～10%的肽聚糖。肽聚糖都是由N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸以β-1，4糖苷鍵結(jié)合的多聚體［6］不同菌株的細(xì)胞壁各自所含肽聚糖的含量相對(duì)穩(wěn)定，因此本文利用測(cè)定菌株中胞壁酸中含有的N-乙酰葡萄糖胺［7］來(lái)?yè)Q算成菌體的含量。

1　實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1材料與試劑

Sphingomonas sp.31555江南大學(xué)生化工程與生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)室自行保藏 蔗糖、葡萄糖、酵母粉、大豆蛋白胨、麥芽提取物、魚(yú)粉蛋白胨、NaNO3、KH2PO4、NaOH、MgSO4·7H2O、N-乙酰葡萄糖胺、對(duì)二甲氨基苯甲醛均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，酵母粉3，麥芽提取物3，魚(yú)粉蛋白胨5；pH 7.0，115℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖40，大豆蛋白胨0.7，NaNO34，KH2PO40.6，MgSO4·7H2O 0.2，121℃滅菌20 min。

1.2.2發(fā)酵工藝

取2環(huán)經(jīng)活化的菌種，接種到500 mL的種子瓶中，裝液量為100 mL，200 r/min，30℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h得到種子液。

1.2.3氨糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

圖1　N-乙酰葡萄糖胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　N-乙酰葡萄糖胺與菌體重量相關(guān)性圖

表1　在不同水浴溫度和時(shí)間條件下細(xì)菌細(xì)胞的水解程度

氨糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸線方程：分別取0.00，0.20，0.40，0.60，0. 80，1.00，1.20，1.40，1.60，1.80，2.00mL已配好的氨糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為200μg·mL-1），依次置于1-11號(hào)具塞比色管中，補(bǔ)蒸餾水至2. 00mL，各加1.00mL乙酰丙酮試劑，搖勻，沸水浴25min，取出水冷至室溫，加無(wú)水乙醇2.00mL搖勻，加入對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑1. 00mL，再以無(wú)水乙醇定容至10.00mL，搖勻，于65℃水浴1h，水冷至室溫，以1號(hào)管作參比溶液，于525nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管溶液吸光度。

1.2.4氨糖含量與威蘭膠菌體量的相關(guān)性

取兩組平行樣，一組樣品用作氨糖含量的測(cè)定，另一組烘干稱菌體干重。

菌體中氨糖含量測(cè)定：取發(fā)酵12小時(shí)的種子液，分別稱5g、10g、15g、20g、25g、30g，移入50mL離心管中，離心機(jī)12000rpm離心20min后加入10mL去離子水?dāng)噭蛟匐x心，重復(fù)2次。將沉淀放入100ml錐形瓶中，加濃鹽酸5ml在室溫下浸泡24h，加入去離子水2mL稀釋至HCl濃度為8.5mol/ml，在70℃水浴6h進(jìn)一步消化，冷卻后用2mol/L NaOH溶液中和至pH=7，移入100ml容量瓶，定容，濾紙過(guò)濾。

準(zhǔn)確量取濾清液1.00ml，加入1.00ml蒸餾水，置10ml具塞比色管中，加1.00ml乙酰丙酮試劑，搖勻，沸水浴25min，取出冷水至室溫，再加無(wú)水乙醇2.00ml搖勻，加入對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑1.00ml，再以無(wú)水乙醇定容至10ml，搖勻，于65℃水浴1h，水冷至室溫，以空白溶液（不加試樣，其余步驟相同）為參比，測(cè)定525nm波長(zhǎng)處的吸光度。顯色反應(yīng)后溶液呈紫紅色。每個(gè)試樣平行測(cè)定2次。

菌體干重測(cè)定：取發(fā)酵12小時(shí)的種子液，分別稱5g、10g、15g、20g、25g、30g，移入50mL離心管中，大離心機(jī)12000rpm離心20min后加入10mL去離子水?dāng)噭蛟匐x心，重復(fù)2次。小心取出沉淀，放在錫箔紙上65℃烘干至恒重，稱取重量。

1.2.5發(fā)酵液中氨糖及菌體含量測(cè)定

取各個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液5g，按照上述測(cè)量氨糖的步驟測(cè)定其中氨糖。再將所測(cè)數(shù)值對(duì)應(yīng)在氨糖含量與菌體量的相關(guān)性曲線中，得出菌體含量。

1.2.6菌體細(xì)胞的水解條件優(yōu)化

氨糖測(cè)定過(guò)程有很多因素對(duì)其影響，本論文不做討論。采用控制單一條件改變而其他條件不變，通過(guò)比較最后的吸光度值，得出最優(yōu)的細(xì)胞水解條件。本文由于各方面因素影響，只對(duì)水解過(guò)程中的水浴條件環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化，選取了最優(yōu)的水浴溫度和水浴時(shí)間。

取5g發(fā)酵12h的發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)洗滌離心前處理后，加入5mL濃鹽酸室溫下水解消化12h，加入去離子水稀釋至HCl濃度為8.5mol/L后，分別放在100℃、90℃、80℃、70℃、65℃、60℃的水浴溫度下進(jìn)一步消化，根據(jù)時(shí)間加長(zhǎng)觀察有無(wú)顏色變化。如有顏色變化，淘汰該溫度條件，剩下沒(méi)有顏色變化的溫度條件，再分別進(jìn)行水浴時(shí)間的條件優(yōu)化。直至在該溫度下所測(cè)出的吸光值不再增大。比較各個(gè)水浴溫度和最大時(shí)間所得出的最大吸光值，取其中吸光值最大的一組水浴溫度和時(shí)間為最優(yōu)條件。

2　結(jié)果與討論

由圖1看到N-乙酰葡萄糖胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸性很好（R2= 0.9989）說(shuō)明此種方法能夠準(zhǔn)確的測(cè)定N-乙酰葡萄糖胺的濃度

從圖2可以看出，利用該方法測(cè)定出來(lái)的氨糖含量與菌體量的關(guān)系呈正相關(guān)線性關(guān)系。證明以下兩點(diǎn)：首先，以本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定氨糖含量，發(fā)酵液中的其他雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾較小，可以說(shuō)基本不會(huì)影響到最終的結(jié)果；其次，通過(guò)數(shù)據(jù)，氨糖含量是隨著發(fā)酵液量的增多呈直線增長(zhǎng)，沒(méi)有出現(xiàn)數(shù)值跳躍，升降不一，這一點(diǎn)更加說(shuō)明了該方法所測(cè)定出來(lái)的氨糖含量比較準(zhǔn)確，誤差較小。

讓我們分別分析一下，菌體烘干稱取干重，所得到的數(shù)據(jù)換算以后，發(fā)酵12h的發(fā)酵液中菌體濃度達(dá)到了5.5g/L，而根據(jù)大量文獻(xiàn)記載，12h的發(fā)酵液中生物量應(yīng)該在5g/L左右。另外，從氨糖含量測(cè)定的數(shù)據(jù)上分析，革蘭氏陰性菌（G-）細(xì)胞壁肽聚糖有1～3層，含量少，占細(xì)胞壁干重的5～20%左右；而細(xì)菌中的細(xì)胞壁占細(xì)胞干重的10%—25%。經(jīng)過(guò)粗略計(jì)算，菌體量在5g/L左右。說(shuō)明用干重法測(cè)得的菌體量與通過(guò)氨糖回推得到的菌體量大致相等，并且氨糖濃度與菌體干重呈正相關(guān)且相關(guān)性很高R2=0.9929，由此可以證明測(cè)定氨糖的量與Sphingomonas sp.31555的量呈正比關(guān)系。

下面工作是驗(yàn)證發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的威蘭膠是否會(huì)對(duì)氨糖的測(cè)定產(chǎn)生影響。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蔗糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸這幾種單糖在使用氨糖測(cè)定的方法對(duì)其測(cè)定時(shí)均無(wú)顯色反應(yīng)。說(shuō)明威蘭膠水解的單糖對(duì)N-乙酰葡萄糖胺的顯色反應(yīng)都無(wú)影響。

表1得出：在100℃、90℃、80℃下濃鹽酸會(huì)與威蘭膠水解的葡萄糖發(fā)生褐變反應(yīng)，70℃以下，褐變反應(yīng)不會(huì)進(jìn)行。在70℃，隨著水浴時(shí)間變長(zhǎng)細(xì)胞水解程度更加徹底，水浴6h時(shí)水解程度達(dá)到最大，ODmax=0.078；60℃下，水浴8h水解程度達(dá)到最大，ODmax=0. 062；但是70℃條件要比60℃水解程度大，即是：70℃下水浴細(xì)胞水解效果更好。由此，我們選取的水浴消化的溫度和時(shí)間條件為：70℃下水浴6h。

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Q5

A

1674-2060（2016）05-0010-02

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAD23B04）；國(guó)家“863”計(jì)劃（2012AA021505）；無(wú)錫市科技支撐計(jì)劃（CLE01N1208）

許曉鵬（1978—），男，吉林白山人，江南大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與工程專(zhuān)業(yè)，工學(xué)碩士，生物工程學(xué)院發(fā)酵工程專(zhuān)業(yè)，在職博士研究生，實(shí)驗(yàn)師，主要從事發(fā)酵工程及產(chǎn)物分離提取的研究。

詹曉北（1962—），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向：工業(yè)發(fā)酵與生物化工、糖生物技術(shù)。

課題：國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目+科技部+天然多糖的制備與功能多糖的研制+2012AA021505。