孟婷婷何建平尚叢珊史敏

（1.西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院 陜西西安 710125；2.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 陜西西安 710062）

Clock蛋白在甘肅鼢鼠的表達(dá)

孟婷婷1何建平2尚叢珊1史敏1

（1.西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院 陜西西安 710125；2.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 陜西西安 710062）

本研究旨在探討甘肅鼢鼠的光周期調(diào)節(jié)機(jī)制，利用免疫熒光技術(shù)觀察了甘肅鼢鼠眼和腦內(nèi)生物鐘基因Clock蛋白的陽性表達(dá)顆粒。結(jié)果顯示：甘肅鼢鼠視網(wǎng)膜上Clock蛋白陽表達(dá)顆粒主要在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其樹突所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，在視網(wǎng)膜的網(wǎng)層、內(nèi)核層、外網(wǎng)層、外核層及視桿視錐層均有Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒，且網(wǎng)層Clock蛋白的陽性表達(dá)顆粒較核層多。視交叉上核（SCN）有Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒。Clock蛋白在甘肅鼢鼠的表達(dá)，為其調(diào)節(jié)機(jī)體晝夜節(jié)律提供分子學(xué)基礎(chǔ)。

Clock蛋白 甘肅鼢鼠（Myospalax cansus） 免疫熒光技術(shù)

全世界約有300種哺乳動(dòng)物多數(shù)時(shí)間生活在黑暗的洞穴中，它們很少接受到光刺激［1］，因此，喪失了地面生活動(dòng)物所具有的一些感覺特征［2-3］。嚴(yán)重退化的眼睛被肥厚的哈氏腺包圍，光線透過厚厚的皮膚及組織才能到達(dá)視網(wǎng)膜，嚴(yán)重阻礙了眼睛正常的成像功能，經(jīng)長(zhǎng)期適應(yīng)性進(jìn)化，眼只具有微弱的視覺，甚至不具有視覺功能，但是地下鼠仍然能夠進(jìn)行正常的節(jié)律活動(dòng)，證明感受光周期的能力還存在［4-5］。

甘肅鼢鼠（Myospalax cansus）是嚙齒目（Rodentia），倉鼠科（Cricetidae），鼢鼠亞科（Myospalacinae），鼢鼠屬（Myospalax）動(dòng)物，是我國(guó)黃土高原特有的營(yíng)地下生活鼠類，終年生活在地下洞道內(nèi)，極少到地面活動(dòng)，黑暗洞穴呈封閉狀態(tài)。生存空間對(duì)自身結(jié)構(gòu)，生理機(jī)能，特別是感覺器官產(chǎn)生了深刻影響。感覺系統(tǒng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了很大變化，聽覺靈敏、視覺退化，眼睛發(fā)生極度萎縮，感光細(xì)胞減少，視網(wǎng)膜變薄［6-7］，但是視交叉上核（SCN）結(jié)構(gòu)保留完整［8］，機(jī)體還可以感受光周期變化，調(diào)節(jié)自身節(jié)律，保持與外界晝夜節(jié)律變化同步，甘肅鼢鼠是研究地下鼠晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)機(jī)制的理想模式動(dòng)物。

以往關(guān)于甘肅鼢鼠的研究較多涉及生活習(xí)性、形態(tài)學(xué)、生理生化學(xué)等各方面，并已獲得了很多寶貴的資料。甘肅鼢鼠的生活環(huán)境幾乎無光，但依然具有節(jié)律活動(dòng)，光照是否影響了節(jié)律基因Clock的表達(dá)，繼而影響了晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)。甘肅鼢鼠嚴(yán)重退化的眼和視交叉上核在光照刺激下是否有Clock的表達(dá)，這是其參與晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)。本文以甘肅鼢鼠為研究對(duì)象，運(yùn)用免疫熒光技術(shù)觀察甘肅鼢鼠視網(wǎng)膜、大腦SCN區(qū)Clock蛋白的表達(dá)，分析光因素對(duì)地下鼠晝夜節(jié)律蛋白表達(dá)的影響。

1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

甘肅鼢鼠（采自陜西省延安市）共16只，體重約180-350g，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)單籠飼養(yǎng)，棉花做巢材，鋸末做墊料，喂以胡蘿卜，食物充足。室溫251℃，自然光照，適應(yīng)一個(gè)月。用于實(shí)驗(yàn)的甘肅鼢鼠均為健康成年個(gè)體，雌雄皆可。

2　實(shí)驗(yàn)方法

運(yùn)用免疫熒光技術(shù)觀察視網(wǎng)膜和下丘腦視交叉上核Clock蛋白的表達(dá)。

2.1主要試劑和儀器

0.01mol/L PBS、0.1mol/L PBS、4%多聚甲醛、30%蔗糖液、20%的氨基甲酸乙酯、0.5% TritonX-100溶液、10%正常山羊血清封閉液、Rabbit Monoclonal Antibody、FITC-羊抗兔IgG、50%無熒光甘油、倒置熒光顯微系統(tǒng)觀察（Leica DFC425 C）、數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6、搖床、培養(yǎng)皿、凹板等。一抗（Rabbit Monoclonal Antibody）購(gòu)自（上海艾博抗貿(mào)易有限公司），二抗（FITC-羊抗兔IgG）和正常山羊血清封閉液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

2.2樣品的制備

圖a：甘肅鼢鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)（20×）（HE染色），引用自戴月琴，2007.cb：甘肅鼢鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層上Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒（20×）（箭頭所指）RPE：色素上皮層；POS：感光細(xì)胞外節(jié)；ONL：外核層；OPL：外網(wǎng)層；INL：內(nèi)核層；IPL：內(nèi)網(wǎng)層；GCL：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；c：Clock蛋白在腦SCN區(qū)的表達(dá)（箭頭所指）：*下方黑色區(qū)域?yàn)榈谌X室

20%氨基甲酸乙酯麻醉甘肅鼢鼠，（劑量按0.75ml/100g體重）；打開胸腔，暴露心臟，左心室注0.1mol/L PBS 250ml、4%多聚甲醛-PB（4℃）250ml進(jìn)行前固定，同時(shí)右心房放血，進(jìn)行心臟灌注；斷頭，取眼和腦，迅速放入4%多聚甲醛-PB進(jìn)行后固定24h（4℃）；30%蔗糖-PB（4℃）溶液隔夜待沉底；OTC冰凍包埋劑包埋（5min），冰凍切片機(jī)（Leica CM1900），冠狀面切片，腦切片厚40μm，眼切片厚10um，置PH7.4 0.01mol/L PBS（4℃） 培養(yǎng)皿中1-2min；待冷凍劑溶解后，將切片挑到0.01mol/L PBS液，反復(fù)2次，每次2min，去除PBS液，加入0.5% TritonX-100溶液1ml，室溫下30min；后將切片浸于10%正常山羊血清封閉液，室溫2h；4℃ 0.01mol/L PBS洗滌3min，共5次；加入一抗（Rabbit Monoclonal Antibody），稀釋比例1：100，4℃過夜；次日，37℃水浴孵育1h，搖床用0.01mol/L PBS充分洗滌，10min，共5次；加入二抗（FITC-羊抗兔IgG）避光孵育1h，0.01 mol/L PBS洗滌10min，3次；50%無熒光甘油（丙三醇）貼片透明 30min，倒置熒光顯微系統(tǒng)觀察（Leica DFC425 C），并拍照。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

甘肅鼢鼠Clock蛋白被特異性抗體標(biāo)記出來，其陽性表達(dá)顆粒呈現(xiàn)綠色熒光。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層以及外核層均有Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒；另外，在下丘腦SCN區(qū)也發(fā)現(xiàn)Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒。

視網(wǎng)膜上有Clock蛋白的陽性表達(dá)顆粒，呈明亮的綠色熒光，與未表達(dá)Clock蛋白陽性顆粒的暗視野形成鮮明對(duì)比（圖b）。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，個(gè)體偏大，有Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒，整個(gè)卵圓形的細(xì)胞胞體呈綠色熒光。由神經(jīng)節(jié)細(xì)胞樹突形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上也有Clock蛋白的陽性表達(dá)顆粒，較胞體熒光亮度較暗。由于熒光染液的彌漫作用，整個(gè)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層呈現(xiàn)明亮的熒光。內(nèi)網(wǎng)狀層也有Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒，熒光亮度同神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，內(nèi)核層Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒較少，熒光亮度明顯減弱，外網(wǎng)狀層Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒增多，熒光亮度增加，外核層Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒亦減少，熒光亮度又減弱。在視網(wǎng)膜十層細(xì)胞結(jié)構(gòu)中Clock蛋白的陽性表達(dá)顆粒網(wǎng)狀層多于核層，網(wǎng)狀層的熒光亮度也大于核層細(xì)胞，隨著Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒多少在網(wǎng)狀層和核層細(xì)胞的交替分布，熒光亮度也出現(xiàn)明暗交替的現(xiàn)象，說明Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上，細(xì)胞核相對(duì)較少。由神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層到色素上皮層熒光亮度整體逐漸減弱，說明Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒主要在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層上。

以第三腦室為參照標(biāo)準(zhǔn)（圖c，*），參考George Paxinos等編著的《大鼠腦立體定位圖譜》，在甘肅鼢鼠下丘腦SCN區(qū)發(fā)現(xiàn)Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒，呈現(xiàn)較為清晰的綠色熒光（圖III，圖2，箭頭所指）。

4　討論

甘肅鼢鼠常年生活在密閉、潮濕、陰暗、土質(zhì)疏松的地下洞道，鋒利的前爪利于它們挖掘洞道，長(zhǎng)期的地下生活對(duì)甘肅鼢鼠的身體結(jié)構(gòu)、生理機(jī)能及感覺器官產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，高度退化的眼，遠(yuǎn)小于地面活動(dòng)的其它嚙齒類動(dòng)物，不能視物僅可感光。

甘肅鼢鼠的晶狀體發(fā)育完整，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)分層明顯、結(jié)構(gòu)清晰，感光細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，視交叉上核結(jié)構(gòu)亦保留完整，具有感受光的基本結(jié)構(gòu)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞體遠(yuǎn)大于其它核層細(xì)胞，但是很稀少，排列也不均勻。Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、神經(jīng)細(xì)胞及其樹突所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，在視網(wǎng)膜的內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層、外核層以及視桿視錐層均有Clock蛋白陽性表達(dá)顆粒，網(wǎng)狀層較多，核層較少。（圖b）這與同樣是節(jié)律蛋白-黑視蛋白的表達(dá)位點(diǎn)相似。

下丘腦視交叉上核（SCN）是哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律的起搏器，控制著機(jī)體大多數(shù)組織器官的行為和生理活動(dòng)。下丘腦SCN自身具有內(nèi)在的遺傳基礎(chǔ)，產(chǎn)生內(nèi)源性周期節(jié)律，同時(shí)也會(huì)受外界環(huán)境，特別是光照周期的影響或者體內(nèi)分泌激素的影響和引導(dǎo)。以《大鼠腦達(dá)顆粒（圖c）。這與大鼠Clock蛋白在腦的表達(dá)位點(diǎn)一致。

本研究表明，Clock蛋白在甘肅鼢鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞體和樹突網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上以及大腦SCN區(qū)都有表達(dá)，為其調(diào)節(jié)機(jī)體晝夜節(jié)律提供分子學(xué)基礎(chǔ)。

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Q7

A

1674-2060（2016）05-0008-02

孟婷婷（1983—），女，漢，陜西西安人，西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院，助教，理學(xué)碩士，比較神經(jīng)生理學(xué)。