楊秦

（邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 湖南邵陽(yáng) 422000）

MshB基因突變對(duì)維羅納氣單胞菌菌毛動(dòng)力的影響

楊秦

（邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 湖南邵陽(yáng) 422000）

目的：通過(guò)探索野生型（菌毛表達(dá)）和MSHB基因突變型（菌毛不表達(dá)）維羅納氣單胞菌動(dòng)力方面的差別，證明菌毛在細(xì)菌運(yùn)動(dòng)方面的重要功能。方法：首先培養(yǎng)細(xì)菌長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，讓后進(jìn)行半固體培養(yǎng)基穿刺與平板挖溝培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，最后對(duì)陽(yáng)性率進(jìn)行T分析。結(jié)果：兩者之間具有顯著差別（P＜0.05）。結(jié)論： 菌毛對(duì)維羅納菌的動(dòng)力具有重要作用。

維羅納氣單胞菌 MSHB 動(dòng)力

維羅納氣單胞菌是人畜共患病菌種。它和弧菌親緣關(guān)系較近，曾近一度認(rèn)為是弧菌科家族。脂多糖、菌毛、S-layer、細(xì)胞毒素、蛋白酶等［1-2］等都是細(xì)菌常見(jiàn)的致病因子。本次工作的目的是通過(guò)MSHB基因野生型（有菌毛）和突變型（無(wú)菌毛）菌毛形成能力的差別，研究菌毛對(duì)于細(xì)菌動(dòng)力能力的影響，為了解維羅納氣單胞菌的致病能力和藥物開(kāi)發(fā)做基礎(chǔ)性研究。

1 材料和方法

1.1 細(xì)菌種類

野生型（MSHB+）和MSHB基因突變型（MSHB-）維羅納氣單胞菌均復(fù)蘇自-80℃。菌株均來(lái)自之前實(shí)驗(yàn)成果。MSHB基因?yàn)榫鞍谆颉Ｖ皩?shí)驗(yàn)已經(jīng)證明突變型的菌毛蛋白不表達(dá)，故而野生型有菌毛而突變型無(wú)菌毛［3］。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件

BHIB（Brain Heart Infusion Broth）培養(yǎng)基用作此次細(xì)菌的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)。待測(cè)試OD570=2.0左右（即對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌），取出細(xì)菌用作后繼實(shí)驗(yàn)。

1.3 半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

傳統(tǒng)半固體培養(yǎng)基有配制半固體干粉培養(yǎng)基購(gòu)自天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠，并嚴(yán)格按照其說(shuō)明書(shū)要求配制。裝入試管成3厘米高的半固體培養(yǎng)基，錫箔紙封口后高溫滅菌。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌接種半固體培養(yǎng)基， 從中央穿刺試管瓊脂的3/4，37 ℃培養(yǎng)，24～72 h 觀察結(jié)果。以細(xì)菌離開(kāi)穿刺線生長(zhǎng)， 擴(kuò)散到培養(yǎng)基中使培養(yǎng)基變混濁為動(dòng)力陽(yáng)性， 細(xì)菌沿穿刺線生長(zhǎng)，周圍培養(yǎng)基仍保持澄清為動(dòng)力陰性。每種菌株重復(fù)50次。

1.4 平板挖溝培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

鮮血瓊脂平板購(gòu)買(mǎi)自上海撫生生物科技有限公司。以無(wú)菌手術(shù)刀在鮮血瓊脂平板中央挖去一條1cm寬的瓊脂條，形成一條小溝，放置一條4cm×0.5cm的無(wú)菌濾紙橫跨于兩邊培養(yǎng)基上，使之與小溝相垂直。在濾紙條的一頂端接種細(xì)菌的純培養(yǎng)物，置37℃溫箱中培養(yǎng)，每天觀察生長(zhǎng)情況，直至7天，如接種端的隔溝對(duì)邊亦生長(zhǎng)同樣細(xì)菌，表示該菌有動(dòng)力。每種菌株重復(fù)50次。

1.5 SPSS統(tǒng)計(jì)分析。

每種使用SPSS19.0進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

圖1：A：半固體穿刺培養(yǎng)動(dòng)力陽(yáng)性。B半固體穿刺培養(yǎng)動(dòng)力陰性。A試管中可見(jiàn)動(dòng)力線渾濁，細(xì)菌向穿刺線周圍生長(zhǎng)。證明其具有動(dòng)力。B試管穿刺線清晰，細(xì)菌無(wú)動(dòng)力。

表1：野生型和突變型維羅納氣單胞菌動(dòng)力測(cè)試。半固體培養(yǎng)基穿刺實(shí)驗(yàn)及平板挖溝培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（共50支）均證明野生型（有菌毛）比突變型（無(wú)菌毛）維羅納氣單胞菌有更多的陽(yáng)性率。野生型與突變型之間有顯著差別（P＜0.05）.菌毛在其運(yùn)動(dòng)中起到很重要的作用。

半固體培養(yǎng)基穿刺平板挖溝培養(yǎng)菌株 　　野生型（M s h B +） 　　突變型（M s h B -） 　　野生型（M s h B +） 　　突變型（M s h B -）總數(shù)（支） 　5 0 　5 0 　5 0 　5 0陽(yáng)性（支） 　4 9 　4 0 　5 0 　3 7

3 討論

細(xì)菌的動(dòng)力具有重要的病理學(xué)意義。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)菌毛蛋白不表達(dá)的MSHB基因突變型維羅納菌與菌毛蛋白表達(dá)的野生型之前的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)菌毛在維羅納氣單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力中起的重要的作用。盡管在大多數(shù)細(xì)菌依靠鞭毛進(jìn)行動(dòng)力，但細(xì)菌也依靠菌毛動(dòng)力［4-5］。IV型菌毛是普遍的用作動(dòng)力的結(jié)構(gòu)［6-7］。本次實(shí)驗(yàn)所用維羅納氣單胞菌的菌毛便是屬于IV型菌毛。IV型菌毛的動(dòng)力功能一直沒(méi)有直接證據(jù)，直到Hong S等［8］用tethering assay第一次直接證明IV型菌毛參與細(xì)菌的動(dòng)力。IV型菌毛通過(guò)劃（Social Gliding Motility）和蹭動(dòng)（twitching motility）移動(dòng)，比如粘球菌用IV型菌毛進(jìn)行劃行，假單胞菌和奈瑟菌依賴IV型菌毛進(jìn)行蹭動(dòng)［3，9］。IV型菌毛是很多致病病原體，比如霍亂弧菌、致病大腸桿菌［10-11］等和用來(lái)定植與黏附在上皮細(xì)胞上的的結(jié)構(gòu)。相對(duì)于鞭毛的研究，菌毛的動(dòng)力和生物膜方面研究相對(duì)較少。通過(guò)這次研究進(jìn)一步證明菌毛在細(xì)菌動(dòng)力方面的重要作用，為將來(lái)其生物膜形成及耐藥性方面的研究也奠定了初步基礎(chǔ)。

［1］Hall-Stoodley L， Costerton J W，Stoodley P. Bacterial biofilms：From the natural environment to infectious diseases. J Nature Reviews Microbiology， 2004， 2（2）：95-108

［2］Dobrindt U. ［Virulence factors of uropathogens］. J Urologe A，2010， 49（5）：598-605

［3］楊秦，黃澤智. 維羅納氣單胞菌維管束狀纖毛mshB基因突變體的構(gòu) J 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2008，（4）10：14-16.

［4］Pate J L. Gliding motility in Cytophaga. J Microbiol Sci，1985， 2（10）：289-90， 93-5

［5］Strom M S，Lory S. Structure-function and biogenesis of the type IV pili. J Annu Rev Microbiol， 1993， 47：565-96.

［6］Wall D，Kaiser D. Type IV pili and cell motility. J Mol Microbiol，1999， 32（1）：1-10

［7］Sun H， Zusman D R，Shi W Y. Type IV pilus of Myxococcus xanthus is a motility apparatus controlled by the frz chemosensory system. J Current Biology， 2000， 10（18）：1143-46

［8］Mattick J S， Whitchurch C B，Alm R A. The molecular genetics of type-4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa--a review. J Gene， 1996， 179（1）：147-55

［9］Chanyi R M，Koval S F. Role of type IV pili in predation by Bdellovibrio bacteriovorus. J PLoS One， 2014， 9（11）：e113404

［10］Sharma D P， Stroeher U H， Thomas C J， et al. The toxincoregulated pilus （TCP） of Vibrio cholerae： molecular cloning of genes involved in pilus biosynthesis and evaluation of TCP as a protective antigen in the infant mouse model. J Microb Pathog，1989， 7（6）：437-48.

［11］Barnett T C， Kirov S M， Strom M S， et al. Aeromonas spp. possess at least two distinct type IV pilus families. J Microb Pathog， 1997， 23（4）：241-7.

Q2

A

1674-2060（2016）02-0019-02

1.2015年湖南省教育廳科研課題（15C1255） 2.2015年度湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（653）

楊秦（1981—），男，講師，主要研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。