趙紅磊楊麗蓉趙紅艷

（1.濰坊市食品藥品檢驗檢測中心 山東濰坊 261201；2.濱州醫(yī)學院 山東煙臺 264003）

超高效液相色譜-質譜聯用法（UFLC -MS/MS）測定山楂片中展青霉素含量的研究

趙紅磊1楊麗蓉1趙紅艷2

（1.濰坊市食品藥品檢驗檢測中心 山東濰坊 261201；2.濱州醫(yī)學院 山東煙臺 264003）

建立了超高效液相色譜-質譜聯用儀（UFLC-MS/MS）測定山楂片中展青霉素含量的方法。山楂片樣品經粉碎后酶解，以乙酸乙酯提取展青霉素，用HLB固相萃取小柱凈化并濃縮，以UFLC-MS/MS電噴霧離子源負離子（ESI-）多反應監(jiān)測模式（MRM）檢驗。方法線性相關系數0.9996，檢出限5μ g/kg，加標回收率81.34～96.4%，相對標準偏差1.7%～4.6%。結果表明，方法簡便、快速、準確，能應用于山楂片中展青霉素含量的測定。

超高效液相色譜-質譜聯用 展青霉素 山楂片

展青霉素（Patulin），化學名稱為4-羥基-4氫-呋喃-［3，2c］-吡喃-2（6）-酮［1］，化學式C7H6O4，分子量154，屬雜環(huán)內酮結構。展青霉素首先在霉爛蘋果和蘋果汁中發(fā)現，廣泛存在于各種霉變水果中。展青霉素是由曲霉和青霉等真菌產生的一種次級代謝產物， 具有影響生育、致癌和免疫等毒理作用，同時也是一種神經毒素。使人神經麻痹、肺水腫、腎功能衰竭［2］［3］。在食品檢驗中，常在蘋果和山楂制品中發(fā)現，是判斷該類產品是否安全的一個重要指標［4］。

鑒于展青霉素潛在的毒性及危害性，大多數國家和組織已建立了展青霉素的限量標準，如歐盟規(guī)定蘋果汁及含蘋果汁的飲料中展青霉素最大限量為 50μg/kg，WHO 規(guī)定展青霉素在蘋果汁中的最高限量標準為 50μg/kg［5］；我國對展青霉素的限量也作了規(guī)定，GB2761-2011《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》規(guī)定以蘋果及山楂為原料制成的產品中（果丹皮除外）展青霉素限量為50μg/ kg。目前我國的展青霉素檢驗標準為薄層色譜法（GB/T5009.185-2003《蘋果和山楂制品中展青霉素的測定》）以及液相色譜法（NY/ T1650-2008《蘋果及山楂制品中展青霉素的測定高效液相色譜法》）兩種。薄層色譜法在實際檢驗過程中操作繁瑣，重復性差，液相色譜法則存在羥甲基糠醛的干擾，影響展青霉素的測定，存在假陽性的可能。目前文獻報道中采用的檢測方法還有氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、免疫學檢測方法等［4，6］。本文在前人研究的基礎上，研究建立了山楂片及制品中展青霉素的超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS/MS）檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液相色譜-質譜聯用儀（液相為Shimadzu UFLCXR，質譜為美國AB公司

API4000+），分析天平 （XS205DU，梅特勒-托利多），食品粉碎機（屹立QE-100），渦旋混勻器 （IKA MS3 ），氮氣吹干儀（海能HN200），離心機（Thermo F16），pH計（梅特勒-托利多）。

1.2 試劑及耗材

乙腈、乙酸乙酯、冰乙酸（均為色譜純 ），果膠酶（Sigma公司），展青霉素標準品（98.8%，Pribolab公司），Oasis HLB柱（3mL/60mg，美國Waters公司）、山楂制品樣品來自市場購買。

1.3 標準溶液的配制

精密稱取適量展青霉素標準品于容量瓶中，用適量乙酸乙酯溶解后，加乙酸乙腈定容到刻度，配制成100μg/mL的標準儲備溶液，避光保存于-20℃冰箱中。準確移取適量的展青霉素標準儲備溶液于，氮氣吹干后用0.2%乙酸配制成1μg/mL的標準中間溶液，避光保存于4℃冰箱中。使用時，根據需要以空白基質溶液稀釋成適當濃度的標準使用溶液，標準使用溶液應臨用前配制。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

確稱取5g均勻試樣（精確到0.01g） 于50mL具塞刻度試管中，加入20mL水與100μL果膠酶溶液，40℃避光放置2h酶解。在酶解后溶液中加入20mL乙酸乙酯，渦旋震蕩提取后，于6000rpm離心3min，轉移上層乙酸乙酯提取液，再用20mL乙酸乙酯重復提取一次，收集兩次的乙酸乙酯溶液，40℃氮氣吹干后，用適量1%乙酸溶液溶解殘渣，并轉移至10mL容量瓶中并定容，待下一步凈化處理。

1.4.2 凈化

Oasis HLB柱首先用6mL色譜甲醇和6mL水活化，然后準確移取5.00mL上述樣品溶液（1.4.1）置于活化過的HLB柱內，使之以3mL/min的速度流過HLB柱，以乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液并用氮氣吹干，然后用1.00mL 0.2%乙酸溶液溶解殘渣，過0.22μm濾膜后上機。

1.5 試驗方法

1.5.1 液相色譜條件

液相色譜柱1 （Shim-pack XR-ODS， 2.0×75mm，2.2μ m），液相色譜柱2（Shim-pack XR-ODS， 2.0×100mm，2.2μm），液相色譜柱3（BEHC18， 2.1×100mm，1.7μm）。流動相：乙腈+水（10+90）；流速：0.20mL/ min，柱溫：35℃。進樣量：10μL。

1.5.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源ESI；掃描方式：負離子模式；檢測方式：多反應監(jiān)測MRM，利用保留時間和離子豐度判斷定性結果， 利用峰面積定量；噴霧電為-4500V；離子化溫度450℃；碰撞氣5；氣簾氣10；霧化氣13；輔助氣13；定量離子對m/z 152.8/108.8；定性離子對m/z 152.8/134.7；去簇電壓DP：-36；射入電壓EP：-6；碰撞電壓CE：-18；碰撞室射出電壓CXP：-15。

圖1 展青霉素二級質譜圖Fig.1 MS/MS spectrum of patulin

表1 不同色譜柱對展青霉素的分離能力比較Table1 separation effects of patulin by different chromatography columns

表2 精密度和準確度考察結果Table2 Results of precision and accuracy

圖2 50 μg/L展青霉素標準品UFLC-MS/MS分離圖左圖為m/z108.8，右圖m/z134.7Fig.2 UFLC-MS/MS spectrum of patulin with concentration of 50 μg/L Left is m/z108.8， right is m/z108.8

圖3 陽性樣品中展青霉素UFLC-MS/MS分離圖左圖為m/z108.8，右圖m/z134.7Fig.3 UFLC-MS/MS spectrum of patulin in hawthorn tablets Left is m/z108.8， right is m/z108.8

2 結果與討論

2.1 質譜條件的選擇

根據展青霉素的性質，其具有較強的電負性，因此在負離子模式下，對其進行檢測。采用針泵進樣的方式對質譜條件進行優(yōu)化。首先用針泵進樣1μg/mL展青霉素標準溶液，流速10μL/min，找準其母離子m/z 152.8，調整CE電壓使母離子峰高約為最大子離子峰高的1/3至1/4，同時確定其子離子碎片m/z 108.8、m/z 134. 7，以m/z 152.8/108.8為定量離子對，以m/z 152.8/134.7作為定性離子對（見圖1）。

2.2 色譜條件的選擇

展青霉素屬于強極性化合物，同時其分子量較低，因此本試驗采用常用的C18柱對展青霉素進行分離，分別考察了不同C18柱Proshell 120 SB-C18、Inertsil ODS-3、BEH C18分離能力，結果發(fā)現不同C18柱分離效果都能達到要求，出峰時間有所差別，綜合選擇了出峰時間較晚，峰寬最窄的Inertsil ODS-3色譜柱。

由于展青霉素的強極性，為了保證較好的分離洗脫，因此試驗選擇極性較低的乙腈作為流動相，同時將乙腈的比例設置為較低比例10%，結果發(fā)現該條件對展青霉素的分離有較好的效果。同時由于展青霉素在酸性條件下較為穩(wěn)定，因此本試驗選擇0.2%乙酸溶液為溶劑對樣品進行定容。

2.3 靈敏度和檢出限

試驗對該方法的靈敏度和檢出限進行了考察，靈敏度以標準曲線回歸方程考察。用空白樣品處理液稀釋展青霉素標準中間溶液，得到濃度為10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L、100 μg/L標準系列，以峰面積為Y軸、濃度為X軸進行線性回歸得到標準曲線方程Y=151.5x-55.7，r2=0.9996，線性相關性良好。

取空白樣品處理液添加適當濃度展青霉素標準溶液后進樣，按3倍信噪比S/N計算得出其最低檢測限為5μg/kg，而我國國家標準規(guī)定的展青霉素的限量為50μg/kg，此方法完全能滿足需要。

2.4 精密度和準確度

取不含展青霉素的空白樣品進行加標試驗，分別添加至10μg/ kg、30μg/kg、50μg/kg三個水平進行試驗，以回收率考察方法的準確度，同時每個水平進6針作平行測定，以相對標準偏差（RSD）考察方法的精密度。試驗結果見表。

2.5 實際樣品測試

根據本文確定的試驗方法，我們從市場上購買了10份山楂片樣品進行檢測，其中有一份樣品檢出陽性，檢出展青霉素含量為13.2 μg/kg。陽性樣品色譜圖見圖。

3 結果和討論

本文通過開展系列試驗研究，考察了不同色譜柱對展青霉素的分離能力，通過優(yōu)化質譜條件，確定了展青霉素的定性和定量離子對，從而能對展青霉素進行確證性檢測，考察了方法的靈敏度、檢出限、精密度和準確度，同時對實際樣品進行檢驗，結果表明該方法能夠快捷準確的對山楂片中的展青霉素進行檢測，能較好的滿足檢驗需求。

［1］徐明悅，李洪軍，王珊等.食品中展青霉素檢測方法及脫除技術研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2015，36（01）：375-380.

［2］周克權.展青霉素的化學檢測方法［J］.國外醫(yī)學衛(wèi)生學分冊，2001，28（1）：29-32.

［3］周玉春等.展青霉素的研究進展［J］.貴州農業(yè)科學，2010，38（2）：112-116.

［4］劉功良，陶嫦立，白衛(wèi)東，趙文紅.農產品中展青霉素檢測的研究進展［J］.安徽農業(yè)科學，2011，39（10）：6084-6092.

［5］毛艷玲，蔡艷等.蘋果中展青霉素的氣相色譜-質譜檢測研究［J］.核農學報，2015，29（9）：1757-1765.

［6］王婭芳，劉利亞，黃培林.展青霉素檢測方法及污染情況的研究進展［J］. 現代預防醫(yī)學，2012，39（19）：5116-5223.

Research of content determination of patulin in haw flakes by UFLC-MS/MS

Honglei Zhao1， Lirong Yang1， Hongyan Zhao2
（1 Weifang Center for Food and Drug Control， Weifang 261201， China）（2 Binzhou Medical University， Yantai264003， China）

A method was developed for content determination of patulin in haw flakes by UFLC-MS/MS. Haw flakes samples were enzymed after crushed，then patulin was extracted by ethyl acetate， purified by HLB solid-phase extraction column， and determined by UFLC-MS/MS with electrospray negative ionization （ESI-） in multiple reaction monitoring （MRM）. Good Linear correlation coefficient 0.9996 was observed. Detection limit of the method was 5μ g/kg. The recovery rate of patulin added was 81.34% ～ 96.4% with the relative standard deviation from 1.7% to 4.6%. The results showed that the method is simple，fast and accurate， and could be applied on content determination of patulin in the hawthorn tablets.

UFLC-MS/MS； patulin； haw flakes

R917

A

1674-2060（2016）02-0016-03

趙紅磊（1985-），男，工程師，主要從事食品檢驗方面的研究。