江賢君，包建波

(1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢430023，2.武漢博藍科技發(fā)展有限公司，湖北 武漢430014)

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β-半乳糖苷酶固定化研究

江賢君1，包建波2

(1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢430023，2.武漢博藍科技發(fā)展有限公司，湖北 武漢430014)

用微孔陶瓷吸附和戊二醛交聯復合法制備了固定化β-半乳糖苷酶。試驗結果表明：用3mm微孔陶瓷吸附，以2.0%戊二醛，時間1.5 h，溫度25 ℃交聯后，獲得固定化酶活為146 U/g，固定化酶活力回收率為60.8%。固定化酶最適溫度為50 ℃，最適pH=7。固定化酶的km=5.6 mmol/L。半衰期為33d。

微孔陶瓷；固定化；β-半乳糖苷酶

1　引言

β-半乳糖苷酶亦稱乳糖酶，廣泛用于乳制品工業(yè)，生產中以游離酶形式水解乳糖生產低乳糖牛奶以緩解乳糖不耐癥[1]。乳糖酶來源于微生物合成，分泌量小，提取成本高，導致乳糖酶價格高，因此很多科技工作者進行了大量研究尋找合適方法將乳糖酶固定化以降低生產成本。文獻報道固定化方法有[2～8]明膠包埋固定法，樹脂吸附交聯固定法，有機試劑交聯法，殼聚糖吸附交聯固定法以及磁性微球固定法等?？紤]到工業(yè)生產對固定化酶諸多要求，本研究以微孔陶瓷為固定化酶支撐載體，再用戊二醛交聯形成固定化酶，制得的固定化酶酶活回收高，最適溫度提高，半衰期延長，具有生產實用價值。

2　材料與方法

2.1材料與試劑

β-D-半乳糖苷酶(哈爾濱美華生物技術股份有限公司,比活力>3 000 IU/g,溫度39 ℃，pH6.8,溶液中25 ℃半衰期8d)；微孔陶瓷(廣東佛山陶瓷研究所，粒徑3 mm,孔容>46%，蛋白吸附專用)；其它試劑為市售(分析純)。

2.2主要儀器

實驗室玻璃填充柱：φ2×25 cm；

WFJ7200型可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)；

工件的加工表面質量直接影響到產品的使役性能，在實際生產中必須加以嚴格控制，如發(fā)動機零件的表面層燒傷會引起使用壽命大幅度下降。目前，工程中常用的燒傷評價方法主要有：目測法、酸洗法、表面顯微硬度法等，均屬于定性評價方法，且后兩者屬于破壞性方法。圖18為高溫合金典型的表面燒傷圖像，從圖18(a)到圖18(e)燒傷程度依次變得嚴重。

電子天平，pH儀，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，水浴鍋等。

2.3試驗方法

綜合新零售城市創(chuàng)新各分項指數來看，當前成都市新零售的領先之處在于：擁有全國領先的品牌數字化智慧門店數量、物流網點數量，同時在進口高端商品的消費上也擁有一定領先勢能。作為一個美食之都，成都外賣已經滲透在各個領域，品類多、味道好、客單價高的趨勢顯現。成都打造的“10分鐘經濟圈”，讓其成為國內便利店數量最多的城市之一。未來，成都人三公里范圍將有專屬理想生活圈。

2.3.1分析檢測方法

2.3.1.1葡萄糖標準曲線[8]

乳糖水解后還原糖含量增加，因此在稀溶液中可用DNS法繪制葡萄糖標準曲線，并以此為依據定義酶活力和比較酶活力大小。制得葡萄糖標準曲線如圖1(y = 0.953 3x, R2= 0.998 7)所示。

2.3.1.2酶活力測定[9]

用pH6.8的磷酸鹽緩沖液，配制濃度為1 g/L的乳糖酶溶液。取一定量的酶加入到45 g/l乳糖溶液中，在39 ℃條件下水浴10 min。然后取1 mL的反應溶液置于100 ℃沸水中滅活10 min。將滅酶活的溶液稀釋100倍后，量取0.3 mL放入15 mL的帶塞子的試管中，再滴加0.4 mL的DNS，100 ℃水浴顯色2 min。冷卻后測量吸光度，計算酶活。定義乳糖酶的活力為：在39 ℃，pH = 6.8條件下反應10 min，每分鐘使OD520增加0.000 1個單位為1個酶活力單位：

乳糖酶比活U/g=(OD1-OD0)n×10 000/(0.953 3×m×10)單位：mg/(mL*min*g)

OD1水解后乳糖液吸光度

OD0水解前乳糖吸光度

除了《合同法》上的一般規(guī)定，對于格式條款的效力問題，《合同法》第四十條還做出了特殊規(guī)定，認定提供格式條款的一方免除其責任、加重對方責任、排除對方主要權利的，該條款無效。那變更合同成立時點的格式條款是否屬于前述情形呢？

2.3.3.3米氏常數的測定[10]

女子望著他，努力抬高手臂，嘴巴微微開闔，似乎是想要說些什么。他急忙俯下身子，將耳朵貼到了女子的唇邊，女子卻只嘔出了一口血，然后便一動也不動了。

m酶量(g)

可見隨戊二醛濃度增加固定化酶失活越來越嚴重，因為戊二醛既是交聯劑也是蛋白質變性劑。

10 10 min

2.3.1.3固定化酶活力測定

參照2.3.1.2方法取一定量固定化酶加入到乳糖溶液中，并在合適溫度，pH條件下測定。

2.3.2固定化酶制備方法

2.3.2.1微孔陶瓷吸附試驗

配制120 U/mL乳糖酶溶液(Ph = 6.8)1L，將預處理后微孔陶瓷50 g裝入φ2×25 cm玻璃填充柱，以100 mL該酶溶液反復流經玻璃柱進行吸附直至酶溶液比活不再下降為止，緩沖液清洗微孔陶瓷，干燥后冰箱保存，并測定吸附固定酶活力。

2.3.2.2戊二醛交聯試驗

取1g吸附后的微孔陶瓷固定化酶加入交聯劑戊二醛復合固定化。分別在濃度為0.4 %、0.8 %、1.2 %、1.6 %、2 %，2.4%戊二醛溶液中進行交聯試驗確定合適戊二醛濃度；在0.5 h、1 h、1.5 h、2.0 h條件下交聯確定合適交聯時間；在20 ℃、25 ℃、30 ℃、3 5℃、40℃溫度條件下交聯確定合適交聯溫度；在此基礎上確定較佳戊二醛交聯條件組合。最后計算總活力回收率。

2.3.3固定化酶性質研究

2.3.3.1固定化酶合適溫度

一份菜加上一碗米飯是最常見的外賣搭配。有人喜歡吃葷，就點個紅燒排骨；有人喜歡吃素，常點素炒圓白菜，不管哪種菜肴，單獨與主食搭配都存在營養(yǎng)缺陷。因此，點外賣一定要注意葷素搭配，肉類和蔬菜都要有，不喜歡吃肉可以用蛋類代替。如果一葷一素兩個菜吃不完，推薦點一個半葷半素的菜，比如青椒炒肉絲、西紅柿炒雞蛋。

按2.3.1.2方法取等量酶溶液分別在25 ℃、30℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃條件下水解乳糖，比較相對活力大??；并取等量復合固定化酶分別在35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃條件下水解乳糖，比較相對活力大小。

2.3.3.2固定化酶合適溫度

按2.3.1.2方法分別取等量溶液酶在pH 5.5、6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5緩沖液中39 ℃水解乳糖，比較相對活力大??；再分別取等量復合固定化酶在pH 5.5、6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5緩沖液中50 ℃水解乳糖，比較相對活力大小。

n稀釋倍數

在兩組4個250 mL試劑瓶中用pH = 6.8緩沖液分別配制0.5,0.75,1.0,1.5 mmol/L的乳糖溶液，其中一組每瓶加入120 U游離酶，在39 ℃溫度下反應30 min，測定酶活并計算反應速度。在另一組每瓶加入1g固定化酶，在最適條件下測定酶活并計算反應速度。最后由米氏方程通過雙倒數作圖求米氏常數km。

對照組患者給予氨氯地平阿托伐他汀鈣（輝瑞制藥有限公司，國藥準字J20130030，規(guī)格5 mg∶10 mg/片）治療，1次/d，1片/次，口服給藥。

已知游離酶半衰期為8 d,測定固定化酶半衰期。稱取10 g復合固定化酶置于100 mL pH為6.8緩沖溶液中，放置25 ℃恒溫箱密封保存，分別在保存的第1,2,3,4,5 d取1 g固定化酶進行酶活力測定，然后依指數衰減定律測定固定化酶半衰期。

3　結果與分析

3.1吸附固定化酶回收率

按2.3.2.1方法比較了溫度對吸附的影響，結果如圖2：

圖2　溫度對吸附的影響

可見在室溫條件下操作比較適宜。在填充柱室溫操作條件下，測定微孔陶瓷固定酶平均比活為220 U/g，游離酶比活為120 U/mL：

莊昶認為邵雍以及李白、杜甫、陳師道、黃庭堅等人雖然在易、詩、文等方面有不足，但他們都是繼承先賢而來，白璧微瑕?；诖朔N認識，莊昶將文分成不同的類別，有詩人、文人之文，有圣人之文。在《滁州志序》中，莊昶以“天下之物固有遇不遇者，蓋亦數也”作喻，指出滁州不足為遇。不管是為官于此的韋應物、王元之、歐陽修，還是做客于此的蘇東坡、曾鞏、滿執(zhí)中，都是文人、詩人，他們不足以使滁州聞名，因為“騷雅余談，文章小技者，惡足以當此哉”［3］卷六，1葉b-2葉a！他還以“月亮”為例，指出有詩人之月、文人之月、詩顛酒狂之月、自得性天之月。在他看來，前三者之“月”無足取，唯有自得性天之月，即圣賢之月才值得追求和提倡：

酶活回收率 =(50 × 固定酶比活)/(溶液酶體積 × 游離酶比活)

=(50 × 220)/(100 × 120)

=91.6%

因此采用微孔陶瓷常溫下填充柱吸附操作簡便，酶活回收高。

從交聯試驗看出戊二醛濃度與酶活呈負相關?？紤]吸附洗脫影響并結合上述交聯試驗條件結果,再在戊二醛濃度0.4 %、0.8 %、1.2 %、1.6 %、2 %,交聯時間1.5 h,室溫下制備固定化酶，然后將制得的固定化酶裝入填充柱，用pH = 6.8的緩沖液柱中洗脫12 h，測定酶活，結果如圖6：

3.2.1戊二醛交聯濃度對固定化影響

本研究試驗地位于浙江紹興縣富盛鎮(zhèn)御茶村有限公司綠茶生產地，地理位置 29°56′N，120°43′E，海拔165.7 m，坡度為18°，屬于亞熱帶季風氣候，光能資源比較豐富；年平均降水量約1400 mm，多集中在春季和夏季，年平均降水天數為125.6 d，常年相對濕度80%，屬濕潤地帶；無霜期為200~230 d。供試的茶樹品種為豐綠，種植年限為10 a，行距1.5 m。茶園基礎肥力如表1所示。

讓我們從就業(yè)和收入開始討論，因為不管自由民主在哲學上有多大的吸引力，它的力量在很大程度上都得益于一個實際優(yōu)勢：在政治學和經濟學中，自由主義的特點是分散決策，這使得自由民主國家能夠勝過其他國家，并為人民帶來越來越多的財富。

所有檢測結果均以平均值±標準偏差（±sd，n=3）表示。數據采用Excel和SPSS 20.0對數據進行單因素分析（ANOVA）檢驗不同樣品間的差異顯著性，所有差異分析均在p=0.05水平進行。

圖3　戊二醛濃度對酶活性影響

0.953 3還原糖對吸光度轉換系數(葡萄糖標準曲線斜率)

3.2.2戊二醛交聯時間對固定化影響

在戊二醛濃度為2.0 %，室溫下在不同時間下交聯，得固定化酶相對酶活大小，結果如圖4：

圖4　交聯時間對酶活性的影響

隨著交聯時間增加，尤其時間>1.5 h固定化酶活性衰減嚴重，說明時間越長戊二醛對乳糖酶變性作用越強。

3.2.3戊二醛交聯時間對固定化影響

在戊二醛濃度2.0 %，交聯時間為1.5 h條件下分別在不同溫度下進行交聯，得固定化酶相對酶活大小，如圖5：

圖5　交聯溫度對固定化酶活的影響

可見合適交聯溫度為25 ℃，較高的溫度導致戊二醛與酶蛋白劇烈反應從而引起酶失活。

3.2.4交聯條件確定

2.3.3.4固定化酶半衰期測定[10]

3.2戊二醛交聯試驗結果

圖6　戊二醛濃度對固定化酶洗脫影響

可見，在低濃度條件下吸附制得固定化酶長時間洗脫后固定化酶脫附明顯。綜合上述試驗結果，確定固定化酶交聯條件為室溫下戊二醛濃度2.0 %，交聯時間1.5 h。

主要工藝如下：①使用工裝進行找中，確定機床主軸與螺孔中心重合。②殘余螺栓掏空：加工螺紋孔內螺栓，直至內徑為Φ149.60～Φ149.80mm時止。③螺孔內取殘絲：配合使用手動工具，將存留在主螺栓孔中的螺紋絲卷出來。

3.2.5復合固定化酶總活力回收計算

以2.3.2.1法制得的活力為220 U/g微孔陶瓷固定化酶按3.2.4法交聯制備50 g復合固定化酶，測得復合固定化酶活力為146 U/g,因此：

總活力回收率=吸附酶回收率×交聯酶回收率

=91.6 %×(146U / 220U)

=60.8 %

對鋼軌的表面狀態(tài)而言，在滾筒式校直機上對鋼軌進行標準校直，在較短的時間內就會出現磨耗，這是因為鋼軌在校直過程中會使鋼軌體內的內應力增大；在一定的壓力機上對鋼軌進行適量的校直，則對鋼軌波磨的影響程度較輕。

3.3固定化酶性質研究

3.3.1固定化酶合適溫度

在不同濃度戊二醛溶液中室溫下交聯1 h，得酶活相對大小如圖3：

可以看出，固定化酶最適溫度為50 ℃，相對于游離酶有明顯飄移。固定化酶由于交聯形成網狀結構從而提高穩(wěn)定性。50 ℃最適溫度對于固定化酶連續(xù)生產防止雜菌污染非常有利。

圖7　固定化酶最適溫度

3.3.2固定化酶合適pH

可見，固定化酶最適pH為7.0，與游離酶最適pH 6.8差異不明顯，固定化酶對pH波動略顯穩(wěn)定。

圖8　固定化酶最適pH

3.3.3固定化酶米氏常數

根據米氏方程,采用雙倒數法1/v ～ 1/s作圖(v為反應速度，此即酶活性;s為乳糖濃度)結果見圖9：

圖9　固定化酶米氏常數

游離酶回歸方程y= 0.031x+ 0.235 (R2= 0.992 5)

筆者在母豬人工授精站工作十年中經常遇到公豬發(fā)生睪丸炎，性欲缺失，精神不振，睪丸腫大、疼痛等病狀。使公豬精液供精站工作無法正常開展。公豬睪丸炎是睪丸實質的炎癥，由于睪丸和附睪緊密相連，容易引起附睪炎，兩者常同時發(fā)生或者互相繼發(fā)。根據病程和病性，臨床上可分為急性與慢性、非化膿性與化膿性。

固定化酶酶回歸方程y= 0.045x+ 0.252 (R2= 0.997 5)

通過回歸方程可以算出游離酶km= 7.58 mmol/L，固定化酶km= 5.6 mmol/L。較游離酶固定化酶km變小，因為酶分子交聯后空間構型發(fā)生一定改變導致固定化酶與底物親和力下降。

3.3.4固定化酶半衰期

根據酶活性指數衰減定律:E=E0exp(-k*t) 可得：

酶活性半衰期t1/2= 0.693 /k

衰減常數k= ln(E/E’) / △t；

E,E’分別為前后兩次測定酶活；

△t為兩次測定酶活間隔時間；

按2.3.3.4方法測定酶活，以ln(E/E’) ～ △t作圖，直線斜率即為k，結果如圖10：

圖10　固定化酶半衰期

經回歸擬合分析得k= 0.021,由此得固定化酶半衰期為33 d?？梢姀秃瞎潭ɑ赴胨テ诿黠@延長。半衰期對固定化酶用于實際生產具有特別重要意義。

4　結論

將微孔陶瓷填充柱室溫飽和吸附游離酶后，在戊二醛濃度2.0 %，溫度25 ℃，時間1.5 h條件下交聯制備得到的固定化酶比活力為146 U/g，酶活總回收率60.8 %；固定化酶km= 5.6 mmol/L,最適溫度為50 ℃，半衰期為33d。本研究結果酶活回收高，半衰期長，且酶最適溫度提高，另外微孔陶瓷機械強度高，為工業(yè)化固定化乳糖酶連續(xù)生產低乳糖牛奶提供了技術依據。

[1]趙志華．淺析乳業(yè)現狀、潛在發(fā)展瓶頸及對策[J]．中國乳品工業(yè)，2004，32(1)：55-58.

[2]Vassilis G，Migulel L L.Hydrolysis of lactosea literarure review[J].Process Biochem，1985，20(1)：2-12.

[3]潘道東，駱承癢.乳糖酶的固定化及其特性的研究[J].中國乳品工業(yè)，1991，19(6)：242-247.

[4]駱承癢.應用透性化細胞乳糖酶生產低乳糖乳制品的特點和技術要求[J].中國乳業(yè)，2001(3)：9-11.

[5]Papayannaks N,Matkas. Studies on modeling and simulate on of lactose hydrolysis free and immobilized beta-galactosidase from Asperillusniger[J].Chemical Engineering Journal，1993，51(1):575-586.

[6]Pererson R S，Hill C G.Lactose hydrolysis by immobilized β-galactosidase in capillary bed reactor[J].Biotechnology and Bioengineering.1989(34)：438-446.

[7]Miller J.Enzymiclactosehydrolysis[J].Food Technology，1980，32：144-151.

[8]魏群.生物工程技術實驗指導[M].北京：高等教育出版社.2002.

[9]Sufang You.Immobilizationand characterization of bera-galactosidase from the plant gram chichen bean.Evolution of its enzymatic actions in the hydrolysis of lactose[J].Journal of agricultural and Food Chemistry，1999，47(3)：819-823.

[10]戚依政，汪叔雄.生化反應動力學與反應器[M]. 北京：化學工業(yè)出版社.1999.

Study of immobilized β-galactosidase

JIANGXian-jun1，BAOJian-bo2

(1. School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China;2. Wuhan Bo Blue Technology Company, Wuhan 430000, China)

Immobilizedβ-galactosidase has made by microporous ceramic adsorption and glutaraldehyde crosslinking. The results are as follows: aftter 3mm microporous eramic adsorption,β-galactosidase was crosslinked into immobilized enzyme by glutaraldehyde with glutaraldehyde concentration 2.0 %, temperature 25 ℃, time 1.5 hr. The activity of immobilized enzyme is 146 U/g. The recovery rate of immobilized enzyme is 60.8 %. Immobilized enzyme optimumreaction temperature is 50 ℃, the optimum pH = 7,dynamics parameter of immobilized enzyme: km = 5.6 mmol / L. The half-life period of immobilized enzyme is 33 days.

microporous ceramic; immobilized; β-galactosidase

2016-07-10.

江賢君(1962-)，男，副教授，E-mail:1098377885@qq.com.

2095-7386(2016)03-0035-04

10.3969/j.issn.2095-7386.2016.03.006

TS 252

A