林永青　梁　穎　張海峰　劉文浩　楊　瑩　王景峰

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院心內(nèi)科　廣東省心電生理與心律失常實驗室，廣東　廣州　510120)

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維生素C聯(lián)合內(nèi)皮素-1促進胚胎干細胞向心肌細胞分化及機制

林永青梁穎張海峰劉文浩楊瑩王景峰

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院心內(nèi)科廣東省心電生理與心律失常實驗室，廣東廣州510120)

目的探討維生素(Vit)-C聯(lián)合內(nèi)皮素(ET)-1對胚胎干細胞(ESC)向心肌細胞分化的影響及其可能機制。方法體外培養(yǎng)ESC并給予Vit-C，摸索Vit-C作用于ESC的最佳濃度和干預時間；然后給予ET-1(100 nmol/L)或Vit-C(100 μmol/L)+ET-1(100 nmol/L)，觀察兩組對擬胚體搏動、Nkx 2.5、GATA-4及Shox2表達的影響。同時，以RNA干擾方法沉默Nkx 2.5、GATA-4及Shox2表達，觀察沉默相應啟動子表達水平后對Vit-C聯(lián)合ET-1介導的擬胚體搏動增加的影響。結果Vit-C最佳作用濃度為100 μmol/L，最佳干預時間為分化的第4～9天，可使擬胚體搏動增加11.19%，同時上調(diào)擬胚體中心肌細胞標志物cTnT以及心肌發(fā)育啟動子Nkx 2.5、GATA-4及Shox2表達。在Vit-C基礎上進一步給予ET-1，可進一步使擬胚體搏動增加11.07%，同時進一步上調(diào)cTnT、Nkx 2.5、GATA-4及Shox2表達水平。沉默Shox2基因表達使擬胚體搏動幅度減少最明顯，達12.94%。結論Vit-C聯(lián)合ET-1可獲得進一步純化的心肌細胞，上調(diào)Shox2是其促進ESC分化的最重要機制。

維生素C；內(nèi)皮素-1；胚胎干細胞；心肌細胞；Shox2

起搏細胞退行性變導致的病理生理改變(如病態(tài)竇房結綜合征等)是老年人常見病之一。但起搏細胞為不可再生細胞，不能通過自身分裂而復制增殖，因此，起搏細胞獲取依賴于其他類型細胞的轉化。目前，已經(jīng)證實包括胚胎干細胞(ESCs)、多能干細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞在內(nèi)的多種細胞均可能向起搏細胞分化，而ESCs因其強大的增殖能力及多向分化潛能而成為起搏細胞研究中的熱點〔1〕。盡可能地獲得多量純化的起搏細胞是ESCs分化研究的主要目標，而干預措施及干預時機是關鍵。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的第3～8天加入內(nèi)皮素(ET)-1不增加擬胚體數(shù)量，但可在一定程度上增加擬胚體中心肌細胞數(shù)量，但仍不足60%〔2〕。因此，進一步研究獲得更多的心肌細胞是ESCs分化中亟待研究的問題。維生素(Vit)-C是一種多效的藥物，有少量研究提示其可能促進ESCs及多能干細胞向心肌細胞分化〔3,4〕。然而，Vit-C聯(lián)合ET-1是否能進一步增加擬胚體中心肌細胞的純度目前尚不得知。本研究旨在探討Vit-C聯(lián)合ET-1是否能夠進一步增加擬胚體中心肌細胞數(shù)量及其可能機制。

1　材料與方法

1.1材料小鼠胚胎干細胞及其飼養(yǎng)層細胞均購自美國ATCC；培養(yǎng)基、胎牛血清、鏈霉素及青霉素均購自美國Gibco公司；逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)、SYBR?Fast qPCR Mix及內(nèi)切酶購自大連寶生物公司；病毒包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2及p-VSVG購自日本Clontech公司；核苷酸序列由廣州銳博生物公司合成；Nkx2.5、GATA-4及Shox2抗體購自美國Abcam公司。

1.2細胞培養(yǎng)ESCs培養(yǎng)于滅活的小鼠胎兒成纖維細胞的飼養(yǎng)層上，培養(yǎng)基為DMEM，含15%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素及1 000 U/ml白血病抑制因子。誘導ESCs分化為心肌細胞方法采用本課題組報道的懸滴培養(yǎng)法〔5〕，即約500個ESC細胞滴于培養(yǎng)皿內(nèi)維持滴狀培養(yǎng)72 h后將其吹散并繼續(xù)培養(yǎng)48 h以形成擬胚體。擬胚體形成后，將其置于分化培養(yǎng)基中，并于分化開始后的第0～3、4～9及10～14天加入10、100及1 000 μmol/L的Vit-C誘導分化為心肌細胞。同時，取最優(yōu)的Vit-C作用濃度及干預時間，對比單獨使用Vit-C或者聯(lián)合ET-1(100 nmol/L)對ESC向心肌細胞分化的影響。使用慢病毒介導的基因沉默(見下述)下調(diào)心臟發(fā)育啟動子Nkx2.5、GATA-4及Shox2表達后再觀察這些基因下調(diào)對Vit-C聯(lián)合ET-1介導的擬胚體搏動增加的影響。

1.3病毒包裝與感染以慢病毒介導ESC外源基因表達。取pLL 3.7載體并以XpaI及XhoI雙酶切載體與取退火后Nkx2.5、GATA-4、Shox2或無義(Scramble)RNA干擾序列混合，在連接酶作用下重組為pLL 3.7-shRNA-Nkx2.5、pLL 3.7-shRNA-GATA-4、pLL 3.7-shRNA-Shox2或pLL 3.7-shRNA-Scramble。重組載體與pLP1、pLP2及pVSV-G共轉染293T細胞后收集上清，以超高速離心2 h后獲得相應慢病毒，以MOI = 50感染ESC。Nkx2.5干擾序列為：5′-TTTAGGATGTCTTTGACTGAG-3′；GATA-4干擾序列為：5′-AAAGAAAATCCCAAATTGGAT-3′；Shox2干擾序列為：5′-AATAATAACACATCAATGGGG-3′。

1.4指標檢測采用Real-Time PCR方法測定cTnT、Nkx2.5、GATA-4及Shox2 mRNA表達。收集處理后細胞，以TRIZOL-氯仿法提取總RNA并逆轉錄；以下述引物用SYBR法行實時熒光定量PCR檢測mRNA表達量，以GAPDA為內(nèi)參；以Western印跡檢測上述蛋白表達量。取細胞以蛋白裂解液充分裂解細胞并煮沸變性；經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉膜及抗體孵育，最后加入化學發(fā)光液并以凝膠成像系統(tǒng)捕獲圖像。Nkx2.5引物序列：正義:5′-CGACGGAAGCCACGCGTGCT-3′；反義:5′-CCGCTGTCGCTTGCACTTG-3′；GATA-4引物序列：反義:5′- CTCGATATGTTTGATGACTTCT-3′；正義:5′-CGTTTTCTGGTTTGAATCCC-3′；Shox2引物序列：正義:5′-GTCGGTGGAGCCTCCTAAG-3′；反義:5′-ATTTTAGTCCCAAGGGCGGG-3′；cTnT引物序列：正義:5′-ATCAACGTTCTGCGAAACCG-3′；反義:5′-TTCTAGCTAAGCCAGCTCCC-3′；GAPDH引物序列：正義:5′-TACAGCAACAGGGTGGTGGAC -3′；反義:5′-GATGGTATTCAAGAGAGTAGGG -3′。

1.5統(tǒng)計學處理使用STATA12.0軟件，正態(tài)分布計量資料采用單因素方差分析比較，并用SKS方法校正。

2　結　果

2.1Vit-C對ESC分化的影響ESC培養(yǎng)至第5天時開始形成擬胚體(圖1)，轉移擬胚體至培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)至第3天時開始出現(xiàn)擬胚體搏動。分化第4～9天加入Vit-C增加搏動擬胚體最明顯，達12.89%；0～3 d次之，為8.86%；10～14 d再加入Vit-C對搏動的擬胚體數(shù)量無影響。見表1。

A.胚胎干細胞開始分化；B.懸浮的擬胚體；C.貼壁的擬胚體圖1　胚胎干細胞培養(yǎng)形態(tài)

時間Control組Vit-C組P值0～3d54.03±6.8162.89±6.380.044～9d58.37±6.2371.26±7.320.00810～14d53.27±4.3356.49±8.320.42

除干預時間點外，Vit-C濃度可能也是影響ESC分化的重要因素。結果顯示，在分化第4～9天給予100 μmol/L Vit-C增加搏動的擬胚體數(shù)量最為明顯，而10 μmol/L及1 000 μmol/L的Vit-C亦能增加搏動擬胚體數(shù)量，但增加幅度較100 μmol/L濃度低，與Control組無統(tǒng)計學差異。Control組、10、100、1 000 μmol/L組擬胚體搏動百分比分別為(52.37±6.39)%，(57.37±7.27)%,(67.39±7.07)%，(63.88±8.32)%。

在確認Vit-C增加搏動擬胚體數(shù)量后，進一步研究Vit-C對心肌標志蛋白cTnT及心臟發(fā)育過程中關鍵啟動子Nkx2.5、GATA-4及Shox2表達的影響。RT-qPCR及Western印跡結果顯示，與Control相比，Vit-C可全面上調(diào)cTnT、Nkx2.5、GATA-4及Shox2表達，而3個啟動子中，以Shox2上調(diào)幅度最明顯。見圖2，表2。

圖2　Western印跡分析Vit-C對cTnT、Nkx2.5、GATA-4及Shox2表達的影響

指標RT-qPCRControl組Vit-C組Western印跡Control組Vit-C組cTnT0.73±0.081)1.43±0.150.59±0.071)1.6±0.23Nkx2.50.92±0.081)1.3±0.200.81±0.071)1.26±0.16GATA-40.5±0.041)1.27±0.190.42±0.051)1.36±0.3Shox20.62±0.061)1.62±0.170.5±0.061)1.58±0.32

與Vit-C組比較：1)P<0.01；下表同

2.2Vit-C聯(lián)合ET-1對ESC分化的影響與單純加入Vit-C相比，于分化的第4～9天加入Vit-C+ET-1(0.1 μmol/L)能進一步增加搏動的擬胚體數(shù)量(Vit-C vs. Vit-C+ET-1:65.93%±7.39% vs 77.0%±9.07%,P=0.04)，增幅達11.07%；對cTnT、Nkx2.5、GATA-4及Shox2表達檢測亦呈現(xiàn)出類似趨勢。見圖3，表3。

圖3　Western印跡分析Vit-C聯(lián)合ET-1對cTnT、Nkx2.5、GATA-4和Shox2表達的影響

指標RT-qPCRVit-C組Vit-C+ET-1組Western印跡Vit-C組Vit-C+ET-1組cTnT0.53±0.061.03±0.21)0.67±0.051.13±0.191)Nkx2.50.58±0.050.98±0.091)0.52±0.060.83±0.071)GATA-40.89±0.081.1±0.091)0.81±0.071.03±0.081)Shox20.62±0.051.23±0.131)0.57±0.041.36±0.091)

2.3不同啟動子對Vit-C聯(lián)合ET-1促ESC向心肌細胞分化中的影響RT-qPCR結果顯示，shRNA抑制上述啟動子表達程度大致相同，約65%～70%。在這種抑制程度下，shRNA-Shox2逆轉Vit-C聯(lián)合ET-1促ESC向心肌分化效應最明顯，約減少12.94%搏動的擬胚體；shRNA-Nkx2.5次之，約減少8.31%擬胚體搏動；而shRNA-GATA-4作用最小(減少6.21%擬胚體搏動)。shRNA-Scr、shRNA-Nkx2.5、shRNA-GATA-4、shRNA-shox2擬胚體搏壓力分別為74.56%±7.87%，61.11%±7.19%,67.02%±5.69%,57.96%±8.01%,shRNA-Scr與shRNA-shox2、shRNA-NKx2.5比較差異顯著(均P<0.05)，與shRNA-GATA-4比較無顯著差異(P>0.05)。

3　討　論

Vit-C及ET-1均被單獨證實為可能促進ESC向心肌細胞分化，但兩者聯(lián)合作用未明。本研究證實Vit-C聯(lián)合ET-1可進一步促進ESC向心肌細胞分化。此外，本研究還證實Shox2在Vit-C聯(lián)合ET-1促ESC心肌分化過程中發(fā)揮重要作用。

有研究結果顯示Vit-C可促進ESC向心肌細胞分化。早于2003年，Takahashi等〔6〕即已證實Vit-C可使ESC內(nèi)心肌細胞特異性啟動子α-MHC具有轉錄活性；同時，促進心臟發(fā)育相關啟動子GATA-4及β-MHC表達。隨后不同學者研究均證實了Vit-C具有促進ESC向心肌細胞分化的作用〔4,7,8〕。除此以外，Vit-C亦被證實可能與其他措施協(xié)同作用共同促進ESC向心肌細胞分化，Vit-C可協(xié)同丹酚酸B促進ESC向心肌細胞分化達3倍，進一步研究顯示這種促進作用與其促進膠原生成有關〔9〕。

ESC向心肌分化是一系列心臟發(fā)育相關啟動子表達的結果，而在這一系列相關啟動子中，以對Nkx2.5和GATA-4的研究最為充分〔10〕。Nkx2.5是心臟前體細胞分化的最早期標志之一，是同源盒基因家族NK2型成員，決定著心肌細胞定型及分化，在心肌發(fā)育過程中，其表達早于β-MHC等心肌特異性標志物，這一基因的缺失將導致心肌細胞形成受阻〔11〕。GATA-4是心肌細胞發(fā)育過程中另一關鍵啟動子，在心肌細胞形成的極早期即可被檢出且將一直持續(xù)〔11〕。本研究結果顯示，在Nkx2.5和GATA-4介導的心臟發(fā)育通路可能在其中發(fā)揮同等重要的作用。且兩者相互作用在房室結及心臟房室傳導系統(tǒng)形成中發(fā)揮關鍵作用〔11〕。

相對Nkx2.5及GATA-4、Shox2在心臟發(fā)育過程中的研究較晚，但近年持續(xù)受到關注。Shox2是同源結構域轉錄因子，被認為在靜脈竇及竇房結中表達且對竇房結細胞起搏功能是必須的〔12〕，Shox2缺失導致胚胎不能存活而Shox2表達低下則可存活但將導致心動過緩且過早死亡〔11〕。近年研究顯示，Shox2高表達可促進ESC向起搏細胞分化，同時增強其生物起搏的可應用性〔13〕。值得注意的是，研究結果顯示Shox2可能拮抗Nkx2.5并調(diào)節(jié)細胞分化。研究者使肺靜脈附近心房細胞高表達Shox2時，則拮抗了Nkx2.5作用并使細胞呈現(xiàn)出竇房結細胞的電生理特性；而在竇房結細胞高表達Nkx2.5時，則拮抗了Shox2作用，使細胞出現(xiàn)類似病態(tài)竇房結綜合征這一在老年人中常見病變的狀態(tài)〔14〕。本研究首次提示Vit-C聯(lián)合ET-1可能促進ESC更傾向于竇房結細胞分化。因竇房結細胞為生物起搏的理想細胞，故Vit-C聯(lián)合ET-1除獲得更心肌細胞外，其獲得的細胞可能更適用于生物起搏。

本研究存在一定不足之處。首先，本研究并未直接證實Shox2與Nkx2.5及GATA-4的相互作用。雖然如上述之Nkx2.5與Shox2相互拮抗已經(jīng)證據(jù)，但這種現(xiàn)象是否亦在ESC存在尚有待闡明。其次，本研究未探討Vit-C聯(lián)合ET-1上調(diào)Nkx2.5、GATA-4及Shox2的機制，這有待進一步研究來揭示。

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3Chung TL,Brena RM,Kolle G,etal.Vitamin C promotes widespread yet specific DNA demethylation of the epigenome in human embryonic stem cells〔J〕.Stem Cells,2010;28(10):1848-55.

4Gao Y,Han Z,Li Q,etal.Vitamin C induces a pluripotent state in mouse embryonic stem cells by modulating microRNA expression〔J〕.FEBS J,2015;282(4):685-99.

5Chen M,Lin YQ,Xie SL,etal.Enrichment of cardiac differentiation of mouse embryonic stem cells by optimizing the hanging drop method〔J〕.Biotechnol Lett,2011;33(4):853-8.

6Takahashi T,Lord B,Schulze PC,etal.Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes〔J〕.Circulation,2003;107(14):1912-6.

7Ren M,Han Z,Li J,etal.Ascorbic acid delivered by mesoporous silica nanoparticles induces the differentiation of human embryonic stem cells into cardiomyocytes〔J〕.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2015;56:348-55.

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〔2015-06-11修回〕

(編輯曲莉)

Synergistic effect of vitamin C and endothelin-1 in differentiation of cardiomyocytes from embryonic stem cell

LIN Yong-Qing,LIANG Ying,ZHANG Hai-Feng,et al.

Sun Yat-Sen Memorial Hospital,Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510120,Guangdong,China

ObjectiveTo explore the effects of vitamin (Vit) -C in combination with endothelin (ET) -1 on embryonic stem cell (ESC) differentiation into cardiomyocytes and underline mechanism.MethodsDifferent Vit-C concentrations and intervention time were tested to optimize Vit-C treatment.After that,Vit-C (100 μmol/L) alone or together with ET-1 (100 nmol/L) were administered to ESC at day 4～9 after differentiation.The beating of embryoid bodies (EBs) were calculated and compared between groups.Expressions of cardiac marker,cTnT,cardiac promoter,Nkx 2.5,GATA-4 and Shox2 were determined.Lentivirus mediated RNA interference was used to knockdown expressions of Nkx 2.5,GATA-4 and Shox2 and EBs beating under Vit-C and ET-1 treatment were observed.ResultsOptimal Vit-C treating concentration was 100 μmol/L and day 4～9 after differentiation was the best time to intervent,which increased EBs beating by 11.19% and increased expression of cTnT,Nkx 2.5,GATA-4 and Shox2 expressions at the same time.In combination with ET-1 further increased EBs beating by 11.07% and expression profiles of the above proteins.Knocking down of Shox2 reversed the effects of Vit-C and ET-1 at the greatest extent,reduced EBs beating by 12.94%.ConclusionsVit-C plus ET-1 produce more purified cardiomyocytes from ESC differentiation.The up-regulation of Shox2 is the most important underline mechanism.

Vitamin C;Endothelin-1;Embryonic stem cell;Cardiomyocyte;Shox2

國家自然科學基金(81300071)；廣東省自然科學基金(2014A030313655，2014A030313049)；廣東省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)省級核心攻關項目(2012A080800007)；廣州市科技科學研究專項(201510010050，201510010048)；中山大學青年教師培育項目(13ykpy29)

王景峰(1963-)，男，教授，博士生導師，主要從事心力衰竭及干細胞分析研究。

林永青(1977-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事冠心病介入治療及干細胞分化研究。

R541.9

A

1005-9202(2016)17-4148-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.005