林強(qiáng)，祁文兵，白明華，王明懷，于繼崗，彭頁(yè)

（1.陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院，陜西寶雞721000；2.人民解放軍空軍總醫(yī)院，北京100142）

靈仙通絡(luò)方對(duì)C518大鼠膝關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞增殖、Ⅱ型膠原及基質(zhì)金屬蛋白酶-13表達(dá)的影響

林強(qiáng)1，祁文兵1，白明華1，王明懷1，于繼崗1，彭頁(yè)2

（1.陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院，陜西寶雞721000；2.人民解放軍空軍總醫(yī)院，北京100142）

目的探討靈仙通絡(luò)方對(duì)C518大鼠膝關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞增殖、Ⅱ型膠原（COL-Ⅱ）及基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）的影響。方法選取C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞株，隨機(jī)分為中藥組（靈仙通絡(luò)方）、西藥組（氨糖美辛）和對(duì)照組（氯化鈉溶液），進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)退變等處理，于給藥后第1、2、3 d，分別檢測(cè)中藥組、西藥組和對(duì)照組不同濃度下對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、COL-Ⅱ及MMP-13表達(dá)的影響。結(jié)果同一時(shí)間點(diǎn)的中藥組、西藥組不同濃度之間噻唑藍(lán)（MTT）值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。對(duì)照組不同濃度氯化鈉溶液的MTT值差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在COL-Ⅱ免疫組化染色中，中藥組與西藥組和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且中藥組優(yōu)于西藥組（染色指數(shù)χ2=16.26，df=2，P＜0.01）。在MMP-13免疫組化染色中，對(duì)照組較中藥組、西藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且中藥組優(yōu)于西藥組（染色指數(shù)χ2=54.31，df=2，P＜0.01）。結(jié)論C518大鼠膝關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞經(jīng)靈仙通絡(luò)方干預(yù)后能夠促進(jìn)其增殖，調(diào)節(jié)COL-Ⅱ、MMP-13的表達(dá)，延緩膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)展進(jìn)程。

膝關(guān)節(jié)退變；軟骨細(xì)胞；Ⅱ型膠原；基質(zhì)金屬蛋白酶-13；軟骨細(xì)胞增殖；靈仙通絡(luò)方

〔Abstract〕Objective To investigate the effect of Lingxian Tongluo prescription on the expression of cartilage cell，COL-II and MMP-13 in C518 rats with knee joint degeneration.Methods Selected C518 rat knee cartilage cell line as the object，which were random ly divided into the Chinese medicine group（Lingxian Tongluo decoction）and Western medicine group（indometacin and glucosamine）and control group（sodium chloride solution），and then the above groups were treated with culture and induced degeneration.On the 1st d，2nd d，3rd d after administration，and then the expression of cartilage cell，COL-II and matrixmetalloproteinase-13（MMP-13）in rats with knee joint degeneration was detected.Results At the same time point，the MTT values of the Traditional Chinese medicine group and Western medicine group had significant difference（P＜0.01）.The MTT values of the control group were not statistically significant（P＞0.05）.Compared with the Western medicine group and the control group，the COL-II immunohistochemical staining of Traditional Chinese medicine group were statistically significant（P＜0.01），and the Traditional Chinese medicine group was better than the Western medicine group（dyeing indexχ2=16.26，df=2，P＜0.01）.The MMP-13 immunohistochemistry staining in the control group was significant comparing with the Traditional Chinese medicine group and the Western medicine group，with statistical significance（P＜0.05），and the Western medicine group compared with the Traditional Chinese medicine group was significantly different（P＜0.05），and the traditional Chinese medicine group was better than that of the Western medicine group（dyeing indexχ2=54.31，df=2，P＜0.05）.Conclusion The knee degenerative cartilage cells of C518rats intervened by Lingxian Tongluo prescription can promote its proliferation，regulate the expression of COL-II and MMP-13，and delay the development of knee osteoarthritis disease.

〔Keywords〕knee joint degeneration；cartilage cells；collagen TypeⅡ；matrixmetalloproteinase-13；cartilage cell proliferation；Xianling Tongluo prescription

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是臨床常見的嚴(yán)重骨關(guān)節(jié)疾?。?］，多發(fā)于中老年，然而其發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前，臨床用于治療KOA的方法有很多種，大部分與細(xì)胞因子的合成及分解代謝有關(guān)［2］，價(jià)格昂貴，不良反應(yīng)較多，不適合患者長(zhǎng)期應(yīng)用。中醫(yī)藥在治療KOA方面具有價(jià)廉、安全性高的優(yōu)勢(shì)［3］，深受廣大患者青睞。為此，筆者采用靈仙通絡(luò)方對(duì)C518大鼠膝關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、Ⅱ型膠原（COL-Ⅱ）及基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）表達(dá)的影響，為臨床治療KOA提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品靈仙通絡(luò)方（方藥組成：威靈仙、白芍、防己、黃芪、延胡索、全蝎、蜈蚣，由我院藥房提供），上述諸藥加水煎煮、抽濾、蒸發(fā)濃縮成水煎劑（相當(dāng)于生藥1.90 g/mL）。氨糖美辛腸溶片由廣東逸舒制藥有限公司提供，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H44022796。1.1.2試劑H2O2由蘇州市博洋化學(xué)品有限公司提供，DMEM培養(yǎng)基由上海鈺博生物科技有限公司提供，青-鏈霉素由上海基免生物技術(shù)有限公司提供，F(xiàn)BS由上海喬羽生物科技有限公司提供，0.25%胰蛋白酶由上海研謹(jǐn)生物科技有限公司提供，噻唑藍(lán)（MTT）由上海豐壽實(shí)業(yè)有限公司提供，二甲基亞砜（DMSO）由上海喬羽生物科技有限公司提供。COL-Ⅱ、MMP-13的Ⅰ抗以及Ⅱ抗均購(gòu)自上?；馍锛夹g(shù)有限公司。

恒溫水浴箱由江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠提供，HSX-150細(xì)胞培養(yǎng)箱由上海和呈儀器制造有限公司提供，多功能生化酶標(biāo)儀由上海益聯(lián)醫(yī)學(xué)儀器發(fā)展有限公司提供，ST16R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Thermo由北京聯(lián)合科力科技有限公司提供，奧林巴斯CKX41倒置顯微鏡由上海澤途機(jī)電設(shè)備有限公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞株由中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)院提供。wistar大鼠，15只，體質(zhì)量為（180± 20）g由山東魯抗醫(yī)藥有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20130001。

1.3分組、給藥及含藥血清制備

將上述大鼠隨機(jī)分為中藥組（靈仙通絡(luò)方組）、西藥組（氨糖美辛）和對(duì)照組（氯化鈉溶液），每組5只。中藥組大鼠給予靈仙通絡(luò)方水煎液（200 mg/kg，生理鹽水配置），灌胃給藥；西藥組給予氨糖美辛（200 mg/kg，生理鹽水配置），給藥途徑同靈仙通絡(luò)組，對(duì)照組僅給予同體積的氯化鈉溶液（蒸餾水配置）。連續(xù)給藥3天后，將所有大鼠麻醉，舌下靜脈取血，離心，取上層血清，高溫滅活，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4MTT實(shí)驗(yàn)

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)在C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞株加入含有1%青-鏈霉素和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，3 d更換1次培養(yǎng)液，當(dāng)瓶底被細(xì)胞鋪滿時(shí)，進(jìn)行傳代。

1.4.2誘導(dǎo)細(xì)胞退變上述細(xì)胞培養(yǎng)6 h后，用含有300μL H2O2的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d，觀察顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)，確認(rèn)誘導(dǎo)細(xì)胞退變成功。

1.4.3MTT操作步驟將誘導(dǎo)退變成功的細(xì)胞以每孔1.0×105cell/mL細(xì)胞種植于3個(gè)96孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分為3組：靈仙通絡(luò)方組［含藥血清（2.5%、5%和10%）的培養(yǎng)基］、氨糖美辛組［含藥血清（2.5%、5%和10%）的培養(yǎng)基］、氯化鈉溶液組［含氯化鈉血清（2.5%、5%和10%）的培養(yǎng)基］，每組中每個(gè)濃度培養(yǎng)4孔，每組12孔，1個(gè)96孔板培養(yǎng)36個(gè)孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在給藥第1 d、2 d和3 d后，分別每孔加入20μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，低速振蕩10 min，充分溶解。采用多功能生化酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)量各孔的吸光度。

1.5免疫組化檢測(cè)

1.5.1免疫組化染色將上述誘導(dǎo)退變成功的軟骨細(xì)胞分別植于培養(yǎng)板內(nèi)的蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后再用含3組藥物的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，之后用PBS沖洗，加入4%多聚甲醛固定，0.5 h后用PBS沖洗。隨后用85%、95%、100%的乙醇溶液脫水，脫水結(jié)束，用PBS沖洗，再用0.3%的H2O2浸泡，0.5 h后用PBS沖洗，37℃下用封閉液封閉20 min，吸去封閉液，分別滴加COL-Ⅱ、MMP-13Ⅰ抗，過夜。于第2日，再用PBS沖洗，滴加COL-Ⅱ、MMP-13Ⅱ抗，37℃溫度下孵育，之后用PBS緩沖液沖洗，滴加抗生蛋白鏈菌素，再用PBS洗滌，滴加顯色液顯色，鏡下觀察，待其顯色時(shí)用PBS洗滌終止上述反應(yīng)。然后，滴加蘇木素，用雙蒸水洗滌，滴加鹽酸-乙醇進(jìn)行分化，再次用95%、100%的乙醇脫水，封片，將其置于倒置顯微鏡下，觀察并用圖像分析系統(tǒng)采片。

1.5.2免疫組化結(jié)果統(tǒng)計(jì)每張切片鏡下隨機(jī)取5個(gè)高倍視野（×400），記錄每張切片的染色程度以及染色范圍。其中，染色程度分為弱（+）、中（++）、強(qiáng)（+++）3個(gè)等級(jí)。染色范圍分為染色范圍占視野＜1/4（+）、1/4～2/4（++）、2/4～3/4（+++）、＞3/4（++++）。將染色程度和染色范圍換算成染色指數(shù)，染色指數(shù)=染色程度×染色范圍，其中將“+”、“++”、“+++”、“++++”分別按1、2、3、4分計(jì)算。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，MTT結(jié)果為計(jì)量資料，屬正態(tài)分布，方差齊，用多組間均數(shù)兩兩比較的方差分析（LSD檢驗(yàn)），免疫組化染色結(jié)果用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同組別藥物對(duì)C518大鼠膝關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞增殖的影響

在同一時(shí)間點(diǎn)上，分別在2.5%、5%、10%濃度中，中藥組較西藥組、對(duì)照組MTT差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），西藥組較對(duì)照組MTT差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在同一的時(shí)間點(diǎn)上，中藥組、西藥組中，10%濃度較5%、2.5%濃度的MTT差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），5%濃度較2.5%濃度MTT差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在對(duì)照組中，2.5%、5%、10%濃度三者之間MTT差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1　不同組別藥物對(duì)C518大鼠膝關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞增殖的影響（±s，MTT值）

表1　不同組別藥物對(duì)C518大鼠膝關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞增殖的影響（±s，MTT值）

注：與同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度中藥組相比，**P＜0.01；與同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度對(duì)照組相比，▲▲P＜0.01；同組各濃度兩兩比較，△△P＜0.01。

組別中藥組西藥組對(duì)照組濃度（%）2.5 5 10 2.5 5 10 2.5 5 10第1天0.423±0.021△△0.626±0.058△△0.812±0.051△△0.238±0.023**▲▲△△0.389±0.041**▲▲△△0.496±0.092**▲▲△△0.145±0.015** 0.144±0.011** 0.152±0.026**第2天0.636±0.038△△0.848±0.034△△1.086±0.092△△0.451±0.022**▲▲△△0.678±0.037**▲▲△△0.786±0.042**▲▲△△0.263±0.021** 0.271±0.043** 0.253±0.022**第3天1.369±0.024△△1.558±0.036△△1.829±0.017△△0.782±0.076**▲▲△△1.064±0.021**▲▲△△1.352±0.043**▲▲△△0.341±0.023** 0.331±0.035** 0.352±0.023**

2.2COL-Ⅱ和MMP-13免疫組化結(jié)果

COL-Ⅱ免疫組化顯示，中藥組細(xì)胞顯示強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜均呈現(xiàn)棕黃色；西藥組細(xì)胞顯示陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜呈現(xiàn)黃色；對(duì)照組細(xì)胞顯示弱陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜呈現(xiàn)淡黃色。MMP-13免疫組化顯示，中藥組細(xì)胞顯示弱陽(yáng)性，細(xì)胞核呈現(xiàn)淡黃色；西藥組細(xì)胞顯示陽(yáng)性，細(xì)胞核呈現(xiàn)黃色；對(duì)照組細(xì)胞顯示強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色。結(jié)果見圖1-2。

2.3COL-Ⅱ和MMP-13免疫組化染色Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果

COL-Ⅱ免疫組化染色Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果如下：中藥組與西藥組及對(duì)照組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且中藥組優(yōu)于西藥組（染色指數(shù)χ2=16.26，df=2，P＜0.01）。MMP-13免疫組化染色Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果如下：對(duì)照組與中藥組、西藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且中藥組優(yōu)于西藥組（染色指數(shù)χ2=54.31，df=2，P＜0.01）。結(jié)果見表2。

3　討論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）是一種臨床常見的、可導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的退變性疾?。?］。軟骨細(xì)胞是存在于關(guān)節(jié)軟骨中的唯一細(xì)胞，其功能的異常是導(dǎo)致KOA發(fā)生的關(guān)鍵［5］。越來越多的研究證實(shí)［6］，在KOA發(fā)生過程中，細(xì)胞因子起著決定性的作用［6］。蛋白膠原是組成膝關(guān)節(jié)軟骨的主要物質(zhì)，COL-Ⅱ又是其中最重要的膠原之一，在正常狀態(tài)下，它們的存在能夠維持膝關(guān)節(jié)軟骨正常的組織形態(tài)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退變時(shí)，軟骨細(xì)胞中的一些細(xì)胞因子也將隨之變化［8］。KOA初期，COL-Ⅱ染色就會(huì)發(fā)生變化，表層COL-Ⅱ染色下降，深層染色加深［9］。研究認(rèn)為，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）對(duì)軟骨基質(zhì)巨分子的分解起著主要作用［10］，其中，MMP-13是裂解COL-Ⅱ最強(qiáng)的酶［11］，由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白聚糖及COL-Ⅱ［12］。有專家研究表明［13］，在KOA病變部位的軟骨中才發(fā)生COL-Ⅱ降解，在正常區(qū)域未見變化［14］。另外，研究發(fā)現(xiàn)，KOA關(guān)節(jié)軟骨中還能檢測(cè)到MMP-13，且MMP-13基因表達(dá)高于正常組織［15］。因此，檢測(cè)COL-Ⅱ、MMP-13的表達(dá)對(duì)于評(píng)判軟骨細(xì)胞退變意義重大。

圖1　COL-Ⅱ免疫組化結(jié)果

圖2　MMP-13免疫組化結(jié)果

表2　COL-Ⅱ、MMP-13 Kruskal-Wallis檢驗(yàn)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)學(xué)中屬“骨痹”的范疇［16］。中醫(yī)認(rèn)為，肝脾腎虛，風(fēng)寒濕邪閉阻經(jīng)絡(luò)［17］，氣血不通則導(dǎo)致KOA的關(guān)鍵病機(jī)，因此，治以調(diào)補(bǔ)肝脾腎虛、阻礙風(fēng)寒濕邪入侵［18］。本研究所用靈仙通絡(luò)方，具有活血化瘀止痛、消腫解毒之功效，方中威靈仙具有祛風(fēng)濕、通絡(luò)止痛之功效，配伍白芍以平抑肝陽(yáng)、養(yǎng)血收陰，配伍防己以行水、瀉下焦?jié)駸?，方中黃芪具有補(bǔ)氣固表、利水退腫、托毒排膿之功效，配伍延胡索以活血、利氣、止痛，配伍全蝎、蜈蚣以息風(fēng)止痙［19］。本方配伍合理，諸藥相合共奏化瘀止血、活血止痛、解毒消腫之功效。現(xiàn)代研究表明，靈仙通絡(luò)方具有抗炎、抗風(fēng)濕的作用，對(duì)關(guān)節(jié)病變具有較好的治療作用［20］。

本組研究結(jié)果顯示，在不同組別藥物對(duì)C518大鼠膝關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞增殖的影響上，在同一時(shí)間點(diǎn)的不同濃度中，各組之間均有差異；在同一時(shí)間點(diǎn)的靈仙通絡(luò)組、氨糖美辛組中，各濃度之間亦具有差異。上述結(jié)果說明靈仙通絡(luò)方對(duì)軟骨細(xì)胞有明顯的增殖作用。在COL-Ⅱ免疫組化染色中，中藥組與西藥組及對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而西藥組較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥組優(yōu)于西藥組；在MMP-13免疫組化染色中，對(duì)照組較中藥組、西藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而西藥組較中藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥組優(yōu)于西藥組。上述結(jié)果提示靈仙通絡(luò)方能夠通過調(diào)節(jié)COL-Ⅱ、MMP-13表達(dá)來延緩KOA的發(fā)生。

綜上所述，C518大鼠膝關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞經(jīng)靈仙通絡(luò)方干預(yù)后能夠促進(jìn)其增殖，調(diào)節(jié)COL-Ⅱ、MMP-13的表達(dá)，延緩KOA疾病的發(fā)展進(jìn)程。

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（本文編輯匡靜之）

Effect of Lingxian Tongluo Prescription on the Expression of Cartilage Cell，COL-II and MMP-13 in C518 Rats w ith Knee Joint Degeneration

LIN Qiang1，QIWenbing2，BAIMinghua1，WANG Minghuai1，YU Jigang1，PENG Ye2
（1 Baoji City Chinese Medicine Hospital，Baoji，Shanxi 721000，China；2 Air Force General Hospital，Beijing 100142，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.09.005

2016-05-10

中國(guó)博士后科學(xué)基金第八批特別資助（2015T81110）。

林強(qiáng)，男，主治醫(yī)師，碩士，研究方向：骨創(chuàng)傷，E-mail：llqq585@163.com。