劉青萍，晏峻峰，楊欣，夏相宜，張水寒，劉芳，王宇紅，蔡光先*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)管理與信息工程學(xué)院，湖南長沙410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南長沙410006；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地、中藥粉體關(guān)鍵技術(shù)及裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室，湖南長沙410208）

基于PCA-GRA的補陽還五湯及其精簡方抗腦缺血損傷功效的譜效關(guān)系研究

劉青萍1，晏峻峰1，楊欣2，夏相宜2，張水寒2，劉芳3，王宇紅3，蔡光先3*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)管理與信息工程學(xué)院，湖南長沙410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南長沙410006；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地、中藥粉體關(guān)鍵技術(shù)及裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室，湖南長沙410208）

采用高效液相色譜法獲取12批補陽還五湯全方、14批補陽還五湯精簡方指紋圖譜化學(xué)成分的數(shù)據(jù)，運用主成分分析法（principal component analysis，PCA）對采集的數(shù)據(jù)進行降維處理，計算出綜合排名第一的中藥材指紋圖譜批次。運用灰色關(guān)聯(lián)度法（grey relational analysis，GRA）將所求批次的指紋圖譜特征峰和腦損傷的保護作用關(guān)聯(lián)起來，探討補陽還五湯全方及精簡方中指紋圖譜共有峰和特有峰與腦損傷保護作用貢獻程度的強弱關(guān)系。本研究結(jié)合PCA和GRA開展補陽還五湯譜效關(guān)系研究，能提升數(shù)據(jù)的有效性和準確度。

補陽還五湯；譜效關(guān)系；主成分分析；灰色關(guān)聯(lián)度；腦缺血損傷

〔Abstract〕The HPLC fingerprint of the 12 batches of Buyang Huanwu Decoction and the 14 batches of its optimized prescriptions were determined.The principal component analysis（PCA）was used to reduce the data dimension.The ranked first batch of fingerprints of Chinese medicines were evaluated.The protective effects of brain damage and the characteristic peaks were correlated by grey relational analysis（GRA）.The correlation between common peaks and charactersistic peaks of Buyang Huanwu Decoction and its optimized prescriptions with its contribution onthe protective effect of cebebral ischemia were discussed.According to the method of PCA and GRA，the spectrum-effect relationship research of Buyang Huanwu Decoction can be improved effectively and accurately.

〔Keywords〕Buyang Huanwu Decoction；spectrum-effect relationship；PCA；GRA；cebebral ischemia injury

譜效關(guān)系［1］通過色譜及其聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的理論和方法，分析所提取的指紋圖譜特征信息，能實現(xiàn)指紋圖譜數(shù)據(jù)的量化或優(yōu)化。運用數(shù)據(jù)挖掘的方法能將指紋圖譜數(shù)據(jù)中標識的活性成分群特征峰與中藥的藥效貢獻度關(guān)聯(lián)起來，計算中藥復(fù)方中指紋圖譜和藥效之間的關(guān)系，為中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。本研究采用PCA和GRA探討補陽還五湯腦損傷保護作用的譜效關(guān)系，考察補陽還五湯全方及精簡方的指紋圖譜特有峰、共有峰與藥效間的關(guān)聯(lián)度，探討補陽還五湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，為經(jīng)典名方的再次開發(fā)提供新思路。

1　材料

1.1藥材

補陽還五湯、補陽還五湯精簡方（黃芪30 g，地龍6 g，川芎9 g）干浸膏均由湖南中醫(yī)研究院中藥所張水寒教授提供。補陽還五湯是由不同批次中藥材，按照傳統(tǒng)水煎法濃縮干燥后制備成干浸膏［2］，相當(dāng)于含4.5 g原藥材/g；補陽還五湯精簡方由不同批次中藥材，按新工藝制備成干浸膏，相當(dāng)于4.7 g原藥材每克。

1.2儀器與試劑

島津LC-20AT型高效液相色譜儀（SPD-20AVP紫外檢測器，日本島津公司）；FNl01-2型鼓風(fēng)干燥箱（長沙儀器儀表廠）；Image-Pro Express圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）；AE 240電子分析天平（METTLER公司）。紅四氮唑（英國BIOFER公司，批號20110728）；水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號20111114）；乙腈為色譜純；水為純凈水。

1.3動物

60只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量為250～280 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2012-0001。

1.4色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗

Hypersil BDS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫40℃；流速1.0 mL/min；檢測波長264 nm；梯度洗脫程序為0-70 min，96%-5%（水），4%-75%（乙腈）；進樣量10μL。

1.5供試品溶液的制備

稱取補陽還五湯全方浸膏0.2410 g，精密加入10 mL甲醇，超聲20 min，過濾，備用；稱取補陽還五湯精簡方浸膏0.2560 g，精密加入10 mL甲醇，超聲20 min，過濾，備用。

2　方法

2.1造模、分組與給藥

采用大腦中動脈線栓法，經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線，建立大腦中動脈閉塞模型［3］。室溫保持為20～30℃，手術(shù)時使用加熱墊。術(shù)后將動物置于裝有清潔墊料的飼養(yǎng)盒內(nèi)，自由飲水、進食。按照本研究設(shè)計方案的需求，將大鼠分成假手術(shù)組、模型組、補陽還五湯精簡方高、中、低劑量組和補陽還五湯全方組，每組各有大鼠10只。給予假手術(shù)組和模型組等容積的無菌蒸餾水；補陽還五湯全方組和精簡方組在術(shù)后第1日起給藥［4］，分別以2.41 g/kg和3.15 g/kg藥液灌胃，給藥容積10 mL/kg，給藥7 d后處死取材，并按文獻［5］方法檢測腦干濕重和腦梗死面積。前期研究的結(jié)果表明，補陽還五湯中劑量組抗腦缺血損傷的效果最佳，其療效優(yōu)于補陽還五湯全方組。本研究中的補陽還五湯精簡方采用中劑量組的給藥劑量。

2.2補陽還五湯HPLC指紋圖譜比較分析研究

本研究選取12批補陽還五湯全方（簡稱全方）和14批補陽還五湯精簡方（簡稱精簡方）供試品溶液，測定其指紋圖譜，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2004A版軟件進行分析，按照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》的規(guī)定，建立不同批次補陽還五湯全方和補陽還五湯精簡方的指紋圖譜［4］。相似度結(jié)果表明：全方和精簡方色譜圖中主要色譜峰在0-70分鐘內(nèi)基本分布均勻，指紋圖譜相似度在0.9-1.0之間，各批樣品之間相似度高，制備工藝比較穩(wěn)定。

2.3基于PCA的補陽還五湯指紋圖譜分析研究

PCA［6］是對數(shù)據(jù)進行降維處理的技術(shù)。這種方法利用數(shù)據(jù)中原本存在的相關(guān)性，將高維的原始數(shù)據(jù)壓縮成低維的數(shù)據(jù)（主成分），在該過程中通過選取數(shù)據(jù)集中分布的主方向，減少因數(shù)據(jù)壓縮而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)精度損失。PCA能在盡量不丟失原有信息的基礎(chǔ)上，對原始數(shù)據(jù)進行降維，降低后續(xù)數(shù)據(jù)處理的難度。

本研究采用標準差標準法（zero-mean normalization，z-score），對精簡方和全方指紋圖譜特征峰峰面積的數(shù)據(jù)進行標準化，轉(zhuǎn)化為均值為0，標準差為1的數(shù)據(jù)。運用PCA將精簡方指紋圖譜特征峰峰面積標準化后的數(shù)據(jù)進行降維處理，計算得到各主成分的累積貢獻率為［0.683，0.784，0.863，0.931，0.979，0.992，0997，0.998，0.999，1，1，1，1］，由此可知，精簡方前5個主成分包含原始數(shù)據(jù)中98%的信息。同理，計算得到全方各成分的累積貢獻率為［0.599，0.79，0.884，0.934，0.963，0.982，0.990，0.994，0.997，0.999，1，1］，全方中前4個主成分包含原始數(shù)據(jù)93%的信息。采用PCA能對14批精簡方樣本和12批全方樣本進行綜合評價［2］（如表1所示），探討不同批次樣本質(zhì)量的穩(wěn)定性。

表1　精簡方及全方各樣本主成分綜合得分和排名精簡方

2.4基于GRA的補陽還五湯譜效關(guān)系研究

GRA［7］是在部分信息未知的情況下，用來度量事物之間、因素之間關(guān)聯(lián)性大小的數(shù)據(jù)分析方法。該方法能定量描述事物、因素之間的變化情況，并通過其變化趨勢判斷事物間、因素間關(guān)系的強弱、大小和次序。

本研究計算全方及精簡方的指紋圖譜特征峰峰面積［7］，將全方的數(shù)據(jù)作為子序列，精簡方數(shù)據(jù)作為母序列。采用公式Y(jié)nk=Xnk/Xk進行計算（Xnk為原始數(shù)據(jù)，Ynk為規(guī)格化處理后的數(shù)據(jù)，Xk為第k行數(shù)據(jù)的均值），將原始數(shù)據(jù)進行規(guī)格化處理，以解決子序列和母序列測度不統(tǒng)一的問題。結(jié)合前期研究中全方及精簡方對腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死面積和腦干濕重比的影響［8］，運用GRA判斷全方及精簡方的指紋圖譜特有峰、共有峰與其調(diào)節(jié)腦缺血損傷藥效之間的關(guān)聯(lián)度（如表2所示）。

3　結(jié)果

3.1基于PCA的補陽還五湯指紋圖譜研究結(jié)果

本研究從全方及精簡方各批樣本指紋圖譜綜合得分的結(jié)果可知，精簡方第11批樣本和補陽還五湯全方第9批樣本質(zhì)量穩(wěn)定性排名第一。通過PCA降維后的綜合指標，能反映全方及精簡方的主成分信息，篩選出綜合排名第一、質(zhì)量穩(wěn)定的樣本指紋圖譜作為譜效關(guān)系研究的基礎(chǔ)。

表2　全方及精簡方與神經(jīng)功能評分、腦梗死面積和腦干濕比的關(guān)聯(lián)度

3.2基于GRA的補陽還五湯譜效關(guān)系研究結(jié)果

本研究采用GRA開展補陽還五湯的譜效關(guān)系研究，具體結(jié)果如下：全方及精簡方與神經(jīng)功能評分關(guān)聯(lián)度結(jié)果表明，兩者共有峰排名均大于各自的特有峰；精簡方的特有峰排名大于全方，保留時間為tR=32.59、44.10、20.65、6.47和26.40 min的化學(xué)成分貢獻度分別排在前5位；從全方及精簡方與腦梗死面積關(guān)聯(lián)度結(jié)果可知，兩者中9個共有峰排名大于各自的特有峰，補陽還五湯全方特有峰排名大于補陽還五湯精簡方；保留時間為tR=20.65、6.47、26.40、33.42和40.18 min的化學(xué)成分貢獻度分別排在前5位；全方及精簡方與腦干濕比關(guān)聯(lián)度結(jié)果表明，兩者的共有峰排名均大于各自的特有峰，且精簡方的特有峰排名大于全方，保留時間為tR=20.65、6.47、26.40、32.59和44.10 min的化學(xué)成分貢獻度分別排在前5位。

采用PCA-GRA分析補陽還五湯的譜效關(guān)系，結(jié)果表明全方及精簡方的共有峰中，保留時間為tR= 6.47、20.65、26.40 min的化學(xué)成分，調(diào)控腦梗死面積、腦水腫的貢獻度排名位于前三位，調(diào)節(jié)神經(jīng)功能癥狀的貢獻度排名位于第3、4、5位。從上述研究結(jié)果可知，全方及精簡方三個共有峰可能對調(diào)控腦缺血損傷起到關(guān)鍵作用。

4　結(jié)論

本研究采用PCA，將補陽還五湯全方及精簡特征峰的高維數(shù)據(jù)壓縮成低維數(shù)據(jù)（主成分），并計算出綜合排名第一、質(zhì)量穩(wěn)定的樣本指紋圖譜序列，將其作為補陽還五湯抗腦缺血損傷功效譜效關(guān)系研究的基礎(chǔ)。該方法揭示了不同批次全方及其精簡方指紋圖譜特征峰的相似性和差異性，為評價中藥復(fù)方的品質(zhì)特征研究提供了數(shù)據(jù)支撐。運用GRA將全方及精簡方指紋圖譜標識的特征峰峰面積與神經(jīng)功能評分、腦梗死面積、腦干濕比等藥效指標相關(guān)聯(lián)，計算兩者指紋圖譜化學(xué)成分中，對腦損傷具有保護作用的主要成分。通過PCA和GRA對采集的指紋圖譜和藥效數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果客觀評價了補陽還五湯抗腦缺血損傷保護作用的譜效關(guān)系，提升了數(shù)據(jù)的有效性和準確度，為中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)方法研究提供了新思路。

［1］李生茂，劉琳，譚睿，等.市售沙棘HPLC指紋圖譜一致性及抗氧化活性譜效關(guān)系［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2016，21（11）：47-50.

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［4］劉青萍.補陽還五精簡方腦健片治療腦缺血后腦損傷的譜效關(guān)系和藥代動力學(xué)數(shù)學(xué)模型研究［D］.長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

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［8］劉青萍，晏峻峰，劉芳，等.補陽還五湯精簡方對腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能及腦梗死面積的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（10）：54-57.

（本文編輯李杰）

The Spectrum-Effect Relationship of Buyang Huanwu and its Optim ized Prescriptions on Cebebral Ischem ia Injury Based on PCA-GRA M ethod

LIU Qingping1，YAN Junfeng1，YANG Xin2，XIA Xiangyi2，ZHANG Shuihan2，LIU Fang3，WANG Yuhong3，CAIGuangxian3*
（1.Management and Information Engineering School，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.Hunan Acadmy of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410006，China；3.Powder of Chinese Traditional and Innovative Medicine State Key Laboratory of Ministry of Hunan University of Chinese Medicine，Powder of Chinese Traditional
Key Technologies and Equipment of Local Joint National Engineering Laboratory，Changsha，Hunan 410208，China）

R285

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.09.003

2016-06-17

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）課題（2012CB723503）；湖南省教育廳科技項目（13C683，13C672）；湖南省教育廳（KC2011B027）；湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地開放基金（2013年）；中醫(yī)藥數(shù)字化技術(shù)基礎(chǔ)研究平臺。

劉青萍，女，博士，研究方向為中醫(yī)藥信息學(xué)。

〔通迅作者〕*蔡光先，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：366620183@qq.com。