周瑾潔，王旭東，孫亞琴，修志龍

（大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連116024）

特約評述

生物基化學品的微生物電合成研究進展

周瑾潔，王旭東，孫亞琴，修志龍

（大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連116024）

微生物電合成是結(jié)合微生物學與電化學的新興研究方向。電化學活性菌株以直接或間接的方式吸收人工提供的外源電子，打破胞內(nèi)代謝原有的氧化還原平衡，定向催化底物合成還原性目的產(chǎn)物。近年來，基于生物基化學品的微生物電合成取得廣泛關注。本文綜述了生物基化學品微生物電合成的基本原理及最新研究進展，并討論了電化學活性菌株的種類、電子傳遞機制以及典型的菌株培養(yǎng)方式，同時結(jié)合菌株代謝途徑，討論了微生物電合成促進乙酸、1，3-丙二醇、丁醇、琥珀酸等生物基化學品的作用機理及研究現(xiàn)狀。最后指出了電子傳遞機制、電子傳遞效率及成本是限制該技術發(fā)展的關鍵問題及未來的發(fā)展趨勢，旨在推動該技術應用于生物基化學品的發(fā)酵工業(yè)中。

微生物電合成；發(fā)酵；生物基化學品；電子傳遞機制；電化學活性菌株

微生物發(fā)酵工業(yè)主要利用純種菌株轉(zhuǎn)化底物為高附加值目標產(chǎn)物，如乙醇、1，3-丙二醇、丁醇等大宗化學品及氨基酸、抗生素等精細化學品。微生物胞內(nèi)代謝是一個復雜的氧化還原反應網(wǎng)絡，這些氧化還原反應由特異性酶高效催化，各個反應之間彼此聯(lián)系、互相交錯形成一個高效、節(jié)能的細胞工廠［1］。在氧化代謝支路中，微生物細胞通過利用碳源、氮源及其他成分組成細胞結(jié)構(gòu)，并合成三磷酸腺苷（ATP）以提供能量，生成氧化產(chǎn)物，氧化反應失去的電子被特定的氧化型輔酶捕獲，生成對應的還原型輔酶；在還原代謝支路中，微生物以氧氣、底物或特定代謝中間產(chǎn)物為電子受體，生成各類還原產(chǎn)物，并伴隨氧化型輔酶的再生。在復雜的微生物代謝過程中，目的產(chǎn)物的形成必然伴隨著各類副產(chǎn)物的產(chǎn)生，導致目的產(chǎn)物產(chǎn)率降低、后期分離純化成本高等系列問題。如何打破微生物細胞內(nèi)原有的代謝平衡、提高目的產(chǎn)物的得率，是微生物發(fā)酵行業(yè)面臨的一大挑戰(zhàn)［2］。改造微生物胞內(nèi)代謝的方式主要有菌種誘變、基因定向改造、發(fā)酵過程調(diào)控等，分別從內(nèi)部基因與外部環(huán)境兩方面入手優(yōu)化代謝途徑，已取得了長足的進展。

微生物電合成（microbial electrosynthesis，MES）也稱微生物電解池（microbial electrolysis cells，MEC），是近年來新興的微生物學與電化學相結(jié)合的交叉技術，由RABAEY教授于2010年在Nature雜志中進行了系統(tǒng)闡述［3］，在一定程度上相當于微生物燃料電池（microbial fuel cells，MFC）的逆過程。微生物作為一種特殊的生物催化劑，以直接或間接的方式吸收外界提供的電子，打破胞內(nèi)代謝原有的氧化還原平衡，定向催化底物合成還原性目的產(chǎn)物，抑制氧化副產(chǎn)物的生成。MES主要在生物電化學系統(tǒng)（bioelectrochemical systems，BES）中實現(xiàn)，如圖1所示，該系統(tǒng)由陽極室、陰極室構(gòu)成，兩室各插入電極，由離子交換膜或鹽橋相隔，通過恒電位儀向兩電極間施加電勢或電流，結(jié)合菌體自身代謝實現(xiàn)電子回路［4］。

MES研究發(fā)展大致分為3個時期：首先在二十世紀八十年代時期，HONGO等［5］學者首先將MES應用于L-谷氨酸發(fā)酵，通過施加1.5V電壓將L-谷氨酸產(chǎn)量提高10%。各學者相繼發(fā)現(xiàn)外源電子的引入可促進乳酸［6］、丙酸［7］及丁酸［8］產(chǎn)量的提高；其次在2000年后，該熱潮起源于1999年將循環(huán)伏安法應用于電子傳遞機理的探究，證實了外源電子傳遞介質(zhì)中性紅可將電子由電極運送至細胞膜延胡索酸還原酶中，促進延胡索酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸［9］。自此人們開始利用電化學手段表征電子傳遞機制，探究外源電子影響細胞代謝的作用機理［10］；第三次研究熱潮出現(xiàn)在二十一世紀一零年代，MES被應用于固定CO2，微生物可將外源電子作為電子供體，驅(qū)動 CO2生成為乙酸、甲烷等化學品［11］。在此期間MFC應用于有機污染物處理的研究也異?；钴S［12］，而一些從事 MFC研究的學者反過來開始研究MES，進一步推動了這一領域的迅速發(fā)展。人們普遍認為利用 MES可改變胞內(nèi)氧化還原輔酶［NAD（P）/NAD（P）H2］比例，為細胞提供還原力。PANDIT等［13］學者利用計算機模擬手段證明了利用微生物電合成手段產(chǎn)生的還原當量可以顯著提高大腸桿菌胞內(nèi)ATP產(chǎn)率及細胞生長速率。因此，MES可以理解為外源電子對微生物的刺激效應［14］，通過這種特殊的刺激手段，微生物可表現(xiàn)出獨特的生理與代謝應答，完成自然條件難以實現(xiàn)的“非平衡”代謝。由于此過程無需對菌體本身進行基因改造，這無疑成為代謝工程新的發(fā)展方向，也將促進生物基化學品的研究及應用開發(fā)。

圖1 微生物電合成裝置及電子傳遞機制示意圖

1 電化學活性菌株及電子傳遞機制

電化學活性菌株（electroactive bacteria，EAB）是指具有與環(huán)境交換電子能力的菌株，這種交換能力可包含兩種相反方向的電子傳遞：①電子由微生物胞內(nèi)向胞外傳遞，以環(huán)境中固體電極為最終受體，主要應用于MFC中，將底物化學能轉(zhuǎn)化為電能；②微生物細胞攝入外界環(huán)境（固體電極等）提供的外源電子，將其由胞外轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)［15］。EAB大部分屬于嚴格厭氧菌或兼性厭氧菌。在菌株長期進化過程中，由于缺乏充足的最終電子受體（O2、CO2，NO3-，SO42-等可溶性底物），某些菌株可利用環(huán)境存在的不溶性高價金屬離子（Mn4+，F(xiàn)e3+，Cu2+）作為最終電子受體，將胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移至外部環(huán)境中［16-17］，而這種能力成為 MFC的基礎。EAB的電子傳遞并不是簡單的一步氧化還原反應，細胞在細胞質(zhì)膜內(nèi)存在相當復雜的系列氧化還原電子對，通過形成電子傳遞鏈完成電子交換，胞外電子傳遞（extracellular electron transfer，EET）也是近年來國內(nèi)外學者研究的熱點［18-19］。并不是所有的EAB兼有這兩種相反方向的電子交換能力，看似可逆的電子交換在細胞中并不完全經(jīng)歷同一傳遞途徑［20］。該研究領域至今尚未解析清楚，仍存在諸多爭議。本文著重介紹電子由固體電極傳遞至胞內(nèi)，即EAB應用于MES中的機制?，F(xiàn)有研究表明EAB存在的EET主要包含兩種方式：①直接傳遞（direct electron transfer，DET），即EAB直接吸附于固體電極上，依賴細胞質(zhì)膜細胞色素c［21］、菌毛（納米導線）［22］傳遞電子；②間接傳遞（mediated electron transfer，MET），即EAB與電極依賴于某些小分子介質(zhì)傳遞電子。這些小分子介質(zhì)可以是微生物的某些中間代謝產(chǎn)物（H2［23］，HCOOH），也可以是自身合成（黃素［24］、吩嗪類［25］、醌類［26］等）或人工添加的外源電子載體（甲基紫精［27］、中性紅［28］、蒽醌-2，6-二磺酸鈉［29］）。不同種屬的EAB存在不同電子傳遞方式，同一EAB也可存在幾種不同的電子傳遞機制。EAB種類及電子傳遞機制的深入研究將為MES應用提供理論基礎。

當外源電子由不同 EET導入微生物細胞外膜后，電子最終去向與細胞種類有關，不同細胞可通過不同電子傳遞途徑分配給不同電子受體。由于現(xiàn)有技術的限制，這些電子傳遞途徑及電子受體仍存在諸多爭議。ROSENBAUM等［30］學者認為細胞色素c與氫化酶在胞內(nèi)電子傳遞中起到關鍵作用。這兩種蛋白或單獨作用，或相互合作將外源電子由細胞外膜運送至內(nèi)膜，最終傳遞給細胞質(zhì)內(nèi)電子受體（SO42-、CO2等）。許多證據(jù)表明，外源電子的引入會提高胞內(nèi) NADH2濃度以及代謝途徑中還原產(chǎn)物產(chǎn)量［9，31-32］。因此，這些電子的最終受體很可能與胞內(nèi)氧化還原反應關系密切的輔酶NAD有關，外源電子的引入導致還原力 NADH2溢出進而還原產(chǎn)物濃度顯著增加、氧化產(chǎn)物濃度隨之減少是這一現(xiàn)象的最優(yōu)解釋。然而這一猜想也存在爭議，不同微生物對外源電子的應答并不相同，某些微生物反而導致其氧化產(chǎn)物的增加［33］。同時新的電子受體（甲基萘醌）的發(fā)現(xiàn)，也引發(fā)學者對這一猜想的懷疑與探討［34］。但毋庸置疑，外源電子的引入會干預細胞原有的代謝途徑，提高或降低某些特定代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。更多胞內(nèi)電子傳遞途徑還有待進一步研究。

外源電子進入細胞質(zhì)后會影響胞內(nèi)帶電狀態(tài)。微生物為使其處于穩(wěn)定電中性，質(zhì)子也將跟隨移動至胞內(nèi)中和掉這部分電子，使得胞內(nèi)質(zhì)子濃度上升。而細胞能量直接來源ATP的生成需要消耗質(zhì)子，每生成1mol ATP需消耗4mol質(zhì)子。因此，MES理論上會促進ATP的生成，使ATP合酶由ATP消耗態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP生成態(tài)，為細胞生長代謝提供能量［13］。HE 等［31］學者發(fā)現(xiàn)，拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）在-0.7V vs Ag/AgCl電勢作用下胞內(nèi)ATP含量由6.98提高至12.93nmol/g，也印證了該推論的正確性。

綜上，由BES提供的電子由外界環(huán)境進入細胞外膜，再由細胞外膜運送至細胞質(zhì)，最終由胞內(nèi)某些酶、輔酶、小分子物質(zhì)等電子受體捕捉后為己所用，同時耦合的其他電子及質(zhì)子移動，導致細胞內(nèi)能量及代謝變化。這一過程經(jīng)歷了從宏觀電子供給到微觀細胞吸收再到宏觀產(chǎn)物生成，各種氧化還原反應互相交錯、繁瑣復雜，研究難度大，需要國內(nèi)外學者共同努力。

2 微生物電合成的菌株培養(yǎng)方式

由于天然 EAB分布的局限性及微生物電子傳遞機制的多樣性，為實現(xiàn)細胞與外源電子進行電子傳遞，改變胞內(nèi)代謝平衡所采取的菌株培養(yǎng)方式及菌群結(jié)構(gòu)各有不同。典型的 MES所利用的菌株培養(yǎng)方式有純種培養(yǎng)及混菌培養(yǎng)。

2.1 純種培養(yǎng)

典型的EAB包括S. oneidensis及G. sulfurreducens。對于典型EAB菌株早期研究主要關注其利用Fe3+、Mn4+等高價金屬離子作為直接電子受體的能力，這為其在BES的應用奠定了良好的理論基礎。研究表明典型EAB依賴細胞膜蛋白（細胞色素c）、納米導線及自身分泌黃素等多種電子傳遞機制，高效的電子傳遞速率及較為清晰的電子傳遞機制使其在MEC及MFC中均有廣泛的應用。

隨著研究的深入，更多類型的EAB被發(fā)現(xiàn)，尤其是工業(yè)上利用廣泛的發(fā)酵菌株，極大推動了MES的發(fā)展。雖然其電子傳遞機制不同，但外源電子的引入無一例外會顯著影響胞內(nèi)代謝。然而由于外源電子進入細胞后對應電子受體不同，微生物對其應答并不是簡單地提高還原支路的產(chǎn)物，而是與電子傳遞鏈密切相關。現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的具有工業(yè)應用前景的天然EAB主要為桿菌屬及梭菌屬，其中包含克雷伯氏桿菌（Klebsiella. pneumoniae）［26，35］、巴斯德梭菌（Clostridium pasteurianum）［36］、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）［31］等發(fā)酵生產(chǎn)菌株。

由于EAB種類的限制，自然界現(xiàn)有EAB往往發(fā)酵能力有限?；诨蚋脑斓?MES已逐漸成為微生物突破自身 EET及代謝通路限制的最佳手段［15］。目前研究主要分為兩個方向：一方面是基于EAB自身的基因工程研究，探求外源電子由胞外進入胞內(nèi)具體路線以及各菌株進行基因改造的可操作性。 S. oneidensis MR-1［37］與 G. sulfurreducens PCA［38］作為各自的模式菌株已被全基因組測序，從分子生物學角度完成對EET的認知，也為改造菌株代謝途徑提供了堅實可靠的分子基礎。同時另一EAB嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）經(jīng)基因測序也逐漸被人們熟知［39］。國內(nèi)外學者也對這三類菌株進行各種基因操作（接合、電穿孔、基因敲除、質(zhì)粒表達等），為后續(xù)MES的基因工程改造奠定了堅實基礎［15］。除此之外，用于固定 CO2的 EAB 永達爾梭菌（Clostridium ljungdahlii）的基因敲除策略［40］以及新代謝路徑的建立［41］也逐步拓寬了該技術在MES的應用范圍。隨著基因工程技術的發(fā)展，將會有更多遺傳背景清晰、生產(chǎn)能力強大的EAB應用于MES中，高效完成其被賦予的使命。另一方面是結(jié)合以大腸桿菌（E coli）為代表的基因工程菌的MES。E. coli由于其明確的遺傳背景與代謝途徑，廣泛應用于多種生物基化工產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)［42-44］。一般認為大腸桿菌自身缺乏有效的電子傳遞機制，利用基因工程手段結(jié)合 E. coli的遺傳背景及典型EAB的電子傳遞機制成為最近研究的一大熱點［45］。二者結(jié)合方式主要集中于兩方面：將EAB內(nèi)部編碼EET的關鍵基因?qū)隕. coli中構(gòu)建E.coli新型電子傳遞機制［46-47］，或?qū). coli中高效底物代謝途徑的關鍵基因?qū)氲湫?EAB中［48］。以上基因改造均可提高電子由胞內(nèi)向胞外轉(zhuǎn)移速率，促進氧化途徑產(chǎn)物的生成。由于微生物吸收外源電子機制尚不明確，利用基因工程手段提高細胞吸收外源電子速率，進而促進還原產(chǎn)物的生成還有待進一步研究。

2.2 混菌培養(yǎng)

由于EAB分布的局限性及EET的復雜性，純種培養(yǎng)往往不能實現(xiàn)高效的電子傳遞，研究發(fā)現(xiàn)不同種屬間也存在電子交換能力［49］，因此無需外源電子介體介導的混菌培養(yǎng)在 MES中，尤其是環(huán)境生物學領域占有舉足輕重的地位［50］?；炀囵B(yǎng)分為已知菌種的人工混合菌群（coculture）及在自然界中通過篩選馴化的自然混合菌群（mixed culture）［51］，二者在MES中均有成功的應用。

人工混合菌群由已知代謝條件的特定菌株構(gòu)成，通過形成魯棒性關系構(gòu)建出單一菌株不存在或產(chǎn)物產(chǎn)率較低的代謝途徑。不同菌株分別承擔不同功能，共同完成發(fā)酵任務，具有方向性強、效率高等優(yōu)勢。由于 EAB種類有限，將發(fā)酵能力較弱的EAB與缺乏電化學活性但發(fā)酵能力強的菌株人工混合培養(yǎng)顯示出巨大應用潛力。ALLISON等［52］學者將產(chǎn)電菌株 G. sulfurreducens與發(fā)酵菌株產(chǎn)纖維二糖梭菌（Clostridium cellobioparum）在BES陽極中混合培養(yǎng)，前者可利用后者發(fā)酵過程中生成有機酸及氫氣作為電子供體，顯著提高產(chǎn)物乙醇的轉(zhuǎn)化率。與此同時，有研究表明發(fā)酵菌株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物 2，3-丁二醇可促進電化學活性菌株自身分泌電子傳遞介體，進而大幅提高產(chǎn)電能力［53］。利用產(chǎn)電菌株與發(fā)酵菌株人工混合也可定向降解纖維素同時高效產(chǎn)電，將纖維素化學能轉(zhuǎn)化為電能，完成純培養(yǎng)無法完成的任務［54］。但由于微生物吸收外源電子機制尚不明確，BES的陰極尚未報道利用人工混合菌株完成MES促進發(fā)酵產(chǎn)品的研究。

相比于人工混合菌群，自然混合菌群在微生物電化學領域應用更為廣泛。從自然界通過一定手段富集馴化得到的自然混合菌群具有人工混菌欠缺的菌種穩(wěn)定性、底物廣譜性、環(huán)境抗逆性以及無需外加人工電子載體的高效電子傳遞效率等多種優(yōu)勢。但由于菌種構(gòu)成多樣，其內(nèi)部代謝網(wǎng)絡、電子傳遞機制復雜，研究難度較大。自然混合菌群大多來源于活性污泥、泥土、廢水、沉積污染物等富含各種有機質(zhì)、微生物種類數(shù)量繁多的樣本［50］。在MFC中，利用自然混合菌群將環(huán)境污染物內(nèi)部儲存的化學能轉(zhuǎn)化為電能，伴隨高附加值產(chǎn)物的生成，已得到廣泛研究與應用［55］；在MES中利用自然混合菌群將廢水中有機質(zhì)轉(zhuǎn)化為氫氣也具有顯著效果［56-57］；而在驅(qū)動發(fā)酵產(chǎn)品生成方面，有研究表明利用自然混合菌群的 MES可顯著提高 1，3-丙二醇產(chǎn)量［58-59］。

3 生物基化學品的微生物電合成

近年來，MES偶聯(lián)生物基化學品的發(fā)酵受到國內(nèi)外學者越來越多的關注，表 1歸納了近期 MES結(jié)合微生物發(fā)酵取得的初步成果。由于MES偶聯(lián)發(fā)酵尚在起步階段，國內(nèi)外學者對 MES偶聯(lián)微生物發(fā)酵的研究所利用底物及合成產(chǎn)物較為單一，底物分為無機碳源（CO2）及有機碳源（乙酸、葡萄糖、甘油、纖維素等），產(chǎn)物包括1，3-丙二醇、丁醇、琥珀酸、乙醇、乙酸及乳酸等。

表1 微生物電合成促進生物基化學品發(fā)酵的典型應用

3.1 以CO2為底物的微生物電合成

隨著全球工業(yè)的發(fā)展，CO2的過度排放引發(fā)了全球變暖等系列環(huán)境問題。CO2作為一種溫室氣體，可作為碳源被某些細菌及古生菌利用，合成乙酸等并生物基化學品維持自身代謝。而自然界微生物吸收CO2能力有限，利用MES將外源電子導入微生物，還原CO2為有機碳化合物是近年來國內(nèi)外學者關注的重點［66］。該技術不僅可實現(xiàn)CO2的回收再利用，而且具有巨大的環(huán)境生態(tài)效益。

以CO2為底物的MES所用菌種主要有4類：產(chǎn)乙酸菌、Fe（Ⅱ）氧化菌、產(chǎn)甲烷菌及典型EAB，幾乎所有菌株均可自主吸收外源電子，無需添加電子載體。不同菌株利用CO2的途徑不盡相同。

（1）產(chǎn)乙酸菌 以梭菌屬、鼠孢菌屬等種屬為主［67］。產(chǎn)乙酸菌通過 Wood-Ljungdahl途徑將CO2轉(zhuǎn)化為乙酸等有機碳并釋放到環(huán)境中，由于CO2為產(chǎn)乙酸菌唯一電子受體，該途徑是繼光合作用最有效的 CO2固定方式。自然條件下此過程需H2或CO作為電子供體，無疑限制了CO2的固定效率，提高了固定成本［68］。研究表明某些產(chǎn)乙酸菌可直接吸收外源電子為電子供體，通過在陰極表面形成生物膜，將CO2還原為乙酸等產(chǎn)物［69］。與此同時，該過程的重要中間產(chǎn)物乙酰-CoA可作為合成其他多元醇、脂肪酸的基礎元件，通過基因改造將 CO2轉(zhuǎn)化為丁醇等生物基化學品已被證明其可行性［41］。以CO2為底物的MES不僅在環(huán)境學中有巨大研究價值，并可實現(xiàn) CO2定向轉(zhuǎn)化為生物燃料的合成生物學新途徑［41］。雖然該方法乙酸合成速率最高僅為 282mmol/（L·d·m2）［61］，但這種以菌株為媒介，以電能為唯一能量來源，將CO2還原為多碳化合物的理念為綠色工業(yè)發(fā)展提供了新的思路。

（2）嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans） A. ferrooxidans因其獨特的代謝途徑及細菌浸出作用逐漸引起國內(nèi)外學者的關注［70］。自然條件下該菌以CO2為碳源，通過氧化Fe（Ⅱ）獲得能量，并以O2、硫酸鹽等為電子最終受體。但環(huán)境中Fe（Ⅱ）濃度較低且氧化產(chǎn)物Fe（Ⅲ）毒性較強導致菌體豐度偏低、CO2固定能力較弱。利用MES可顯著增強其固定CO2能力。外源電子并不直接作用于微生物細胞，而首先將電解質(zhì)中的 Fe（Ⅲ）還原為Fe（Ⅱ），微生物將Fe（Ⅱ）氧化為Fe（Ⅲ），完成Fe元素循環(huán)利用，顯著提高A. ferrooxidans豐度，提高CO2利用率［71］。

（3）產(chǎn)甲烷菌 通過在陰極形成生物膜吸收外源電子將CO2轉(zhuǎn)化為CH4。相比于前兩種方式，產(chǎn)甲烷菌固定 CO2所需電勢較低（＜-0.7V vs Ag/AgCl），能耗較大，在陰極電勢為-1V vs Ag/AgCl時CH4產(chǎn)率可至200mmol/（L·d·m2）［72］。

（4）典型 EAB LAURENCE等［73］學者發(fā)現(xiàn)G. sulfurreducens在-0.4V vs. Ag/AgCl作用下在消耗CO2同時可將琥珀酸轉(zhuǎn)化為甘油。但現(xiàn)有研究未證明G. Sulfurreducens能夠以CO2為唯一電子受體、BES所提供的外源電子為唯一電子供體下生長，因此CO2吸附能力較局限。與此同時，LI等［62］學者利用MES將CO2還原為甲酸，甲酸在基因工程菌羅爾斯通氏菌（Ralstoniaeutropha）LH74D胞內(nèi)作為能源，經(jīng)代謝生成CO2及NADH2后進入合成途徑生成燃料，產(chǎn)物異丁醇及 3-甲基-1-丁醇總量達140mg/L，也間接驗證了MES驅(qū)動CO2合成生物燃料的可行性。

毋庸置疑，以 CO2為底物的 MES存在菌種限制、產(chǎn)物濃度及生產(chǎn)強度較低等亟待解決的問題，但該方法可將大氣中CO2固定為易儲存的生物基化學品，在環(huán)境生物學、合成生物學等學科領域前景巨大，值得學者廣泛重視及深入研究。

3.2 以有機碳源為底物的微生物電合成

雖然以CO2為底物的MES具有環(huán)境友好、資源回收等諸多優(yōu)勢，該技術電子轉(zhuǎn)移效率低、產(chǎn)物濃度低及生產(chǎn)強度弱等局限，在生物基化學品工業(yè)生產(chǎn)中存在諸多問題。廉價有機碳源（葡萄糖、甘油、纖維質(zhì)等）耦合 MES以其基于高濃度發(fā)酵并顯著提高產(chǎn)品產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率的優(yōu)勢，已取得廣泛關注。本文以MES產(chǎn)物1，3-丙二醇、丁醇及琥珀酸為例，闡述 MES偶聯(lián)利用廉價有機碳源發(fā)酵生產(chǎn)生物基化學品的實例及應用前景。

3.2.1 1，3-丙二醇

1，3-丙二醇（1，3-PD）是一種重要的化工原料，具有多種重要用途，廣泛應用于醫(yī)藥、化工、食品及化妝品等行業(yè)。同時，1，3-PD是合成聚對苯二甲酸丙二酯（PTT）的重要單體。PTT是一種具有廣泛應用前景的新型聚酯材料，因其在紡織業(yè)廣泛應用得到人們關注。自然界1，3-PD的微生物發(fā)酵生產(chǎn)菌包含丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、巴斯德梭菌（Clostridium pasteurianum）、克雷伯氏桿菌（Klesbiella pneumoniae）及弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）等。幾乎所有自然界發(fā)酵生產(chǎn)1，3-PD的菌株均以甘油為底物。典型的甘油代謝生產(chǎn)1，3-PD過程如圖2（以C. butyricum為例）［74］，甘油代謝屬于歧化反應：在氧化途徑中生成丁酸、乙酸等副產(chǎn)物，伴隨生物質(zhì)、生物能ATP及還原當量NADH2的生成。在還原途徑中合成1，3-PD，并消耗過量的 NADH2。胞內(nèi)氧化還原水平是限制1，3-PD產(chǎn)量的關鍵因素［75］，而MES可打破胞內(nèi)氧化還原平衡，促進還原力 NADH2再生，進而提高1，3-PD產(chǎn)量，降低氧化支路中副產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，MES偶聯(lián)1，3-PD發(fā)酵一直以來被認為是該領域最具潛力的應用實例［76］。

利用MES生產(chǎn)1，3-PD首先被應用于生物柴油廢水的處理，國內(nèi)外學者已成功利用自然混合菌群將生物柴油廢水中低濃度甘油合成1，3-PD［59，77］。由于底物濃度限制，1，3-PD含量有限，但其可行性已得到初步驗證。例如，以甘油為底物，電化學驅(qū)動C. pasteurianum 代謝流流向還原支路，提高NADH2/NAD比例，進而1，3-PD產(chǎn)量由60mmol/L提高至92mmol/L［36］。利用混合菌群結(jié)合MES條件下 1，3-PD濃度可增至 42g/L，已接近傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)量［58］。但也有研究顯示，外源電子的引入并未導致K. pneumoniae顯著提高1，3-PD產(chǎn)量，推測當外源電子進入細胞后，最終電子受體并非NAD，外源電子引入對1，3-PD的產(chǎn)量影響不大，反而提高了氧化支路中乳酸及乙醇的產(chǎn)量［33］。因此對于外源電子引入后電子流向及具體機制還需要深入研究，但MES耦合1，3-PD發(fā)酵仍具有巨大研究價值。

圖2 C. butyricum甘油代謝途徑［74］

3.2.2 丁醇

丁醇是作為另一種大宗生物基化學品，廣泛應用于各種塑料和橡膠制品中。同時，丁醇是繼燃料乙醇后的一種極具發(fā)展前景的新一代液體燃料，與乙醇相比具有高熱值、低揮發(fā)性、低吸濕性及低腐蝕性等優(yōu)點，是理想的石油替代品［78］。微生物法生產(chǎn)丁醇所用菌株為產(chǎn)溶劑梭狀芽胞桿菌（Clostridium acetobutylicum）。利用葡萄糖生產(chǎn)丁醇的微生物胞內(nèi)代謝如圖 3（以 C. acetobutylicum為例）［79］。C. acetobutylicum代謝的第一階段為產(chǎn)酸期，底物轉(zhuǎn)化為乙酸、丁酸等有機酸，伴隨溶液pH下降。在該階段中，NADH2不斷積累為后續(xù)丁醇生產(chǎn)提供了充足的還原力。為抵抗不利的生存環(huán)境，細胞可重新利用有機酸同時消耗糖類等底物，進入產(chǎn)溶劑期。此時微生物細胞消耗 NADH2，生成丁醇、乙醇、丙酮等產(chǎn)物。相比于 1，3-PD發(fā)酵，微生物生產(chǎn)丁醇所經(jīng)氧化還原代謝途徑更為復雜，丁醇并不是簡單的還原支路產(chǎn)物，而與其他副產(chǎn)物（丁酸、乙醇、丙酮等）擁有相同中間代謝途徑，共享中間代謝產(chǎn)物（丙酮酸、乙酰-CoA等）。但從整體網(wǎng)絡看，微生物生產(chǎn)1mol丁醇需消耗2mol還原當量NADH2。因此，對微生物代謝進行氧化還原平衡改造，再生胞內(nèi)還原當量 NADH2是提高丁醇產(chǎn)量的有效手段［79］。

圖3 C. acetobutylicum葡萄糖代謝途徑［79］

國內(nèi)外學者利用MES再生NADH2，進而提高丁醇產(chǎn)量已取得初步研究成果。1988年 KIM等［8］學者發(fā)現(xiàn)C. acetobutylicum可在甲基紫精為電子介體的-2.5V電壓下將丁醇產(chǎn)量提高26%，同時丙酮產(chǎn)量降低25%。類似的效果在巴斯德梭菌中也得到實現(xiàn)，該菌株在不加外源介體條件下可自主吸收外源電子，驅(qū)動菌株向消耗NADH2支路代謝，使丁醇產(chǎn)量由5.4mmol/L提高至13.5mmol/L，但細胞密度顯著降低［36］。HE等［31］學者發(fā)現(xiàn)C. beijerinckii可利用中性紅為電子傳遞介體，在-0.7V vs Ag/AgCl電勢下丁醇產(chǎn)量提高了17.4%，同時可將發(fā)酵時間縮短12h。GALLARDO等［80］學者利用計算機模擬手段也確定了C. acetobutylicum ATCC 824在外源電子介入后可提高丁醇比生成速率。幾乎所有研究將 MES促進丁醇發(fā)酵的原因歸結(jié)為外源電子的引入可促進還原當量 NADH2的再生，提高NADH2/NAD比例，進而提高丁醇產(chǎn)量。

3.2.3 琥珀酸

琥珀酸是一種重要的平臺化合物，是許多重要化合物如1，4-丁二醇、己二胺、己二酸、丁二酸二乙酯等的前體物質(zhì)。同時，微生物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸利用CO2作為輔助碳源，對溫室氣體CO2的再利用提供了新途徑［81］。典型的琥珀酸產(chǎn)生菌有琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes），產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens），同時E. coli經(jīng)基因改造也可達到工業(yè)化生產(chǎn)水平。利用葡萄糖為底物生產(chǎn)琥珀酸代謝途徑如圖4（以A. succinogenes為例）［81］。在A. succinogenes厭氧發(fā)酵途徑中，葡萄糖通過糖酵解途徑合成磷酸烯醇式丙酮酸，后進入C4途徑生成琥珀酸。C3途徑為細胞生長提供能量，提供還原力NADH2，并生成乳酸、乙酸、乙醇等副產(chǎn)物。每生成 1mol琥珀酸可固定1mol CO2，同時消耗2mol NADH2［82］。

圖4 A. succinogenes葡萄糖代謝途徑［81］

1999年PARK等［9］學者首先發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖作為底物，以中性紅為電子介體，施加2V的電壓可以使A. succinogenes的琥珀酸產(chǎn)量由51.27mmol/L提高至 82.88mmol/L，副產(chǎn)物甲酸與乙酸濃度明顯降低。并猜想細胞吸收外源電子可能的機制：被外源電勢還原的還原態(tài)中性紅可代替富馬酸還原酶復合體中的甲基萘醌的功能。當加入甲基萘醌抑制劑時，以H2為電子供體的對照組細胞富馬酸還原酶酶活被完全抑制，而在電化學系統(tǒng)下細胞酶活并未發(fā)生改變。被還原的中性紅可進入胞內(nèi)，可將 NAD還原為NADH2，因此外源電子可促進胞內(nèi)還原力再生。作者也發(fā)現(xiàn)基因突變菌株A. succinogenes FZ-6利用電還原的中性紅可代替H2作為唯一電子供體，將延胡索酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸，證明了細胞可以利用電合成的還原力進行生長及代謝［83］。ZHAO等［63］學者運用不同碳源（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、混合糖及玉米芯水解液）均發(fā)現(xiàn) MES可促進 A. succinogenes NJ113發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，同時胞內(nèi)還原力 NADH2含量較對照有顯著提高。此研究也成功將微生物電合成底物應用范圍擴展至廉價碳源，具有良好的應用潛力。

除此之外，MES在乙醇［64］、乳酸［6］等生物基產(chǎn)品的發(fā)酵中也有應用，MES促進生物基化學品發(fā)酵已取得廣泛關注。其原理主要基于BES對胞內(nèi)氧化還原平衡的影響，即外源電子引入可促進胞內(nèi)還原力 NADH2再生，以彌補細胞自身還原力的不足，進而提高產(chǎn)量。事實也證明了該方法是一種無需進行基因改造、快速有效的調(diào)控手段。

4 結(jié) 語

MES是一種新型的調(diào)節(jié)微生物生理代謝的手段。通過外源電子的提供，驅(qū)動細胞吸收電子，可實現(xiàn)定向改變微生物代謝流向，促進代謝網(wǎng)絡中特定還原產(chǎn)物的生成，降低其他氧化支路副產(chǎn)物的產(chǎn)量。與其他改變微生物代謝通路的方法相比，該方法無需對微生物進行遺傳改造，可通過持續(xù)為細胞提供外源電子完成對其持續(xù)刺激作用。MES促進生物基化學品的發(fā)酵主要面臨以下三方面挑戰(zhàn)：首先，微生物吸收外源電子的電子傳遞機制尚不明確，電子進入微生物細胞后的最終電子受體有待深入研究，電子對不同微生物代謝影響的機制也需進一步探究；其次，微生物吸收外源電子的效率是影響該技術在發(fā)酵產(chǎn)業(yè)應用的關鍵限制因素，如何提高微生物對外源電子的響應值、促進微生物高效吸收外源電子進而改變代謝流是今后工業(yè)化應用的重點研究方向；最后，生物基化學品的 MES尚處于實驗室研究階段，其產(chǎn)業(yè)化還需考慮成本因素，該技術產(chǎn)業(yè)應用所帶來的經(jīng)濟效益應高于設備改造及電勢能耗所投入的成本。同時探求將風能、太陽能等可再生能源轉(zhuǎn)化為電能，再由BES將電能轉(zhuǎn)化為生物基化學品的化學能，實現(xiàn)綠色環(huán)保、循環(huán)經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展理念。從長遠看，隨著機理研究不斷深入，應用領域不斷擴大，MES促進生物基化學品發(fā)酵將向更加理性、高效、綠色的方向發(fā)展。

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Progress on microbial electrosynthesis of bio-based chemicals

ZHOU Jinjie，WANG Xudong，SUN Yaqin，XIU Zhilong
（School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024，Liaoning，China）

Microbial electrosynthesisis is a new technology that combines microbiology and electrochemistry. The external electrons from an artificial power source are accepted by electroactive bacteria directly or indirectly，changing the intracellular redox balance，and promoting the formation of reductive products. Recently，microbial electrosynthesis based on bio-based chemicals has been attracting more and more attention. This review summarizes the basic principles and latest research progress in microbial electrosynthesis of bio-based chemicals. The electroactive bacterial selection，electron transfer mechanism，and typical cultivation methods are disclosed. Combined with microbial metabolism，the principle and research progress of microbial electrosynthesis on production of acetate，1，3-propanediol，butanol，and succinate are also discussed. The electron transfer mechanism，efficiency，and costs are thought to be the key factors restraining the development of microbial electrosynthesis. Finally，future trends on application which would contribute to the development of microbial electrosynthesis and application in fermentation of bio-based chemicals are prospected in this paper.

microbial electrosynthesis；fermentation；bio-based chemicals；electron transfer mechanism；electroactive bacteria

TQ 920

A

1000-6613（2016）11-3005-11

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.11.001

2016-01-29；修改稿日期：2016-03-09。

國家自然科學基金項目（21476042，21306021）。

周瑾潔（1991—），女，博士研究生。聯(lián)系人：修志龍，教授，主要從事生物基化學品發(fā)酵及分離研究。E-mail zhlxiu@dlut.edu.cn。