張斌

遼寧省錦州市中心醫(yī)院麻醉科，遼寧錦州　121001

異氟烷對新生小鼠神經(jīng)元細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化水平的影響

張斌

遼寧省錦州市中心醫(yī)院麻醉科，遼寧錦州121001

目的觀察異氟烷對小鼠神經(jīng)元細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶和環(huán)磷酸腺苷（cAMP）反應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化水平的影響，探究異氟烷誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷和學(xué)習(xí)記憶障礙的可能機(jī)制。方法原代培養(yǎng)小鼠神經(jīng)元，分為對照組、0.96mmol/L異氟烷處理12 h及24 h組。采用MTS方法檢測各組細(xì)胞活力；Western blot方法檢測p-ERK1/2和p-CREB表達(dá)情況；逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）方法檢測ERK和CREBmRNA表達(dá)。 結(jié)果 與對照組比較，0.96 mmol/L異氟烷處理12 h及24 h后神經(jīng)元活力明顯下降（P＜0.05）；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對照組比較，異氟烷處理組小鼠神經(jīng)元中p-ERK1/2和p-CREB表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）；隨著異氟烷處理時(shí)間的增加，p-ERK1/2和p-CREB表達(dá)逐漸降低，處理12 h與24 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示：與對照組比較，異氟烷處理組小鼠神經(jīng)元中ERK和CREBmRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)論一定濃度的異氟烷可以降低原代培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)元活力和ERK1/2、CREB的磷酸化水平。

異氟烷；神經(jīng)元；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶；cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白

［Abstract］Objective To investigate Isoflurane-induced neuronal damage and possiblemechanisms involved in learning and memory impairments.M ethods Cerebral neurons separated from fetal mice were cultured and divided into three groups，one control group，two experimental groups were treated with 0.96 mmol/L Isoflurane for 12 h and 24 h，respectively.MTSmethod was used to determine the cell viability；Western blotmethod was used to detect p-ERK1/2 and p-CREB expressions；the reverse transcription qPCR（RT-qPCR）method was used to detectmRNA expressions of ERK and CREB.Results Compared with the control group，the viability of neuronal cells decreased significantly（P＜0.05）；the phosphorylation of ERK1/2 and CREB also significantly decreased（P＜0.05），and with the prolonging of Isoflurane treatment duration，the expression of p-ERK1/2 and p-CREB decreased gradually，and the difference between 12 and 24 h after treatmentwas statistically significant（P＜0.05）；there were no statistically significant difference inmRNA expressions of the ERK and CREB（P＞0.05）.Conclusion A certain concentration of Isofluranemay directly inhibitneuronal cell viability and also inhibits the activities of ERK1/2 and CREB.

［Key words］Isoflurane；Neuron；ERKs；CREB

全麻藥異氟烷因其價(jià)格便宜、毒副作用小、誘導(dǎo)快，是臨床中應(yīng)用廣泛的吸入麻醉藥之一。近年來研究表明，異氟烷急性暴露可誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，引起新生大鼠長期學(xué)習(xí)記憶能力下降［1-2］；異氟烷還可以引發(fā)圍術(shù)期成年患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙（Post-operative cognitive dysfunction，POCD）并對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、學(xué)習(xí)及記憶產(chǎn)生影響［3］。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellular signal regulated kinases，ERKs）是絲裂原活化蛋白激酶家族成員之一，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化及存活。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ERK可影響神經(jīng)細(xì)胞增殖分化、突觸可塑性、軸突生長等，與腦內(nèi)長時(shí)程增強(qiáng)（Long-term potentiation，LTP）的形成以及學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)［4-5］。研究證明，許多形式的突觸可塑性都需要ERK參與，同時(shí)動物實(shí)驗(yàn)證明，抑制神經(jīng)細(xì)胞中ERK活性可導(dǎo)致動物學(xué)習(xí)功能的降低［6］。

環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）在突觸可塑性中具有重要的作用，激活CREB可促進(jìn)多種與突觸可塑性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄［7］，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生一些與學(xué)習(xí)記憶十分相關(guān)的蛋白分子。

本實(shí)驗(yàn)采用神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，從細(xì)胞水平觀察異氟烷對神經(jīng)元ERK和CREB的影響，探討異氟烷的神經(jīng)毒性以及影響學(xué)習(xí)記憶能力的潛在機(jī)制。

1　對象與方法

1.1主要材料

取24 h內(nèi)新生的SPF級小鼠30只，雌雄不限，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供［動物許可證號：SYXK（遼）2009-0004］。DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone）、胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司）、神經(jīng)元基本培養(yǎng)基（美國Introvigen）、p-CREB抗體（Cell Signal公司）、p-ERK1/2抗體 （美國SANTACruz公司）、β肌動蛋白抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、ECL發(fā)光試劑（美國Sigma公司）、Cell Titer-BlueTM Cell Viabiliy Assay試劑盒（美國Promega公司）。

1.2小鼠大腦皮層神經(jīng)元分離、培養(yǎng)及細(xì)胞分組

設(shè)定路徑 S1={5，4，10，6，9，16，26，20，19}，路徑 S2={5，7，8，10，12，14，16，23，20，19}，為被選中父體實(shí)施雜交，S1，S2括號里的數(shù)字為路徑的節(jié)點(diǎn)。如去除首末節(jié)點(diǎn)后，相同節(jié)點(diǎn)有2個(gè)以上時(shí)，則將頭2個(gè)相同節(jié)點(diǎn)來雜交，雜交點(diǎn)間的節(jié)點(diǎn)交換，生成雜交段。從S1，S2路徑可以看出，除起始節(jié)點(diǎn)和結(jié)束節(jié)點(diǎn)相同外，相同節(jié)點(diǎn)為10、16和20，再選擇起始于終點(diǎn)實(shí)施雜交，最終得到交換后的路徑表達(dá)如下所示。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［8］，選用出生24 h內(nèi)的昆明小鼠，無菌條件下，斷頭處死小鼠取腦，于預(yù)冷的D-Hanks液中，分離大腦皮層后，顯微鏡下去除腦膜和血管；D-Hanks液洗2～3次，剪成小塊。37℃下0.25%胰蛋白酶消化20 min后取出吹打，用含10%胎牛血清的DMEM終止反應(yīng)。4℃下1000 r/min離心5min，2次，棄上清液。DMEM調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度為5×105/mL，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃恒溫的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。半量換液，1次/2～3 d。細(xì)胞培養(yǎng)7 d，經(jīng)神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neuron specific enolase，NSE）免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定，神經(jīng)細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)的90%以上，取培養(yǎng)7 d的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

培養(yǎng)細(xì)胞分為，對照組：常規(guī)培養(yǎng)；異氟烷暴露組：采用終濃度為0.96mmol/L異氟烷的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，分別培養(yǎng)12 h及24 h，共三組。每組分別取10只動物，細(xì)胞培養(yǎng)每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。

1.3異氟烷溶液的配制

根據(jù)文獻(xiàn)［8］的方法，將130μL液體異氟烷加入103mL平衡鹽溶液（Balanced salt solution，BSS）中，密封后搖床上搖勻24 h，充分溶解異氟烷，配制10mmol/L儲備液。使用前迅速將30 mL溶液倒入50 mL聚丙烯離心管中，震蕩5～10 s，加入培養(yǎng)基（終濃度為0.96mmol/L）后用于細(xì)胞處理。

1.4MTS方法測定細(xì)胞活力

將細(xì)胞懸液稀釋至1×105/mL，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μL。將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)過夜后，更換含有異氟烷的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)說明書，每孔加入20μLMTS試劑，37℃下孵育4 h，592 nm處測定各組細(xì)胞吸光度值A(chǔ)。根據(jù)公式計(jì)算生存率，細(xì)胞生存率=（A各組-A空白孔）/（A對照組-A空白孔）×100%。

1.5免疫印跡檢測神經(jīng)元ERK和CREB蛋白表達(dá)

1.6 RT-qPCR檢測神經(jīng)元ERK和CREB mRNA表達(dá)

Trizol法提取總RNA。SYBR GreenⅡ進(jìn)行檢測，熱循環(huán)條件：95℃3 min，94℃ 15 s，60℃ 60 s，40循環(huán)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積10μL：RNase Free dH2O23μL，SYBRRPrimeScriptTM（2×）5μL，ERK、CREB、18Sr-RNA上下游引物 （10μmol/L）1μL，DNA模板1μL，每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔。采用比較Ct值（2-ΔΔCt法）相對定量法，改變的倍數(shù)（fold change）=2-ΔΔCt；ΔCt=Ct靶基因-Ct內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt未處理組。以18SrRNA為內(nèi)對照。以2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)。PCR引物序列見表1。

表1　ERK、CREB、18SrRNA引物序列

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1異氟烷對小鼠神經(jīng)元生存率的影響

與對照組比較，12 h和24 h異氟烷處理組的生存率降低，生存率從對照組的100%分別降至（86.58±8.96）%和（78.63±8.23）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1　異氟烷處理不同時(shí)間后細(xì)胞生存率變化（n=10）

2.2異氟烷對小鼠神經(jīng)元ERK1/2和CREB活性的影響

Western blot方法檢測小鼠神經(jīng)元 ERK1/2和CREB活性，結(jié)果顯示，與對照組比較，異氟烷處理組小鼠神經(jīng)元中p-ERK1/2和p-CREB表達(dá)水平均明顯降低 （P＜0.05）；隨著異氟烷處理時(shí)間的增加，p-ERK1/2和p-CREB表達(dá)逐漸降低，處理12 h與24 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2　異氟烷對小鼠神經(jīng)元ERK1/2和CREB活性的影響（n=10）

2.3異氟烷對小鼠神經(jīng)元ERK1/2和CREB mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR方法檢測了小鼠神經(jīng)元ERK和CREB的mRNA表達(dá)。與對照組比較，異氟烷處理組小鼠神經(jīng)元中ERK和CREB表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3　異氟烷對小鼠神經(jīng)元ERK1/2和CREBm RNA表達(dá)的影響（n=10）

3　討論

全身麻醉藥目前已廣泛應(yīng)用于臨床麻醉中，而其對學(xué)習(xí)記憶功能的影響也受到重視，有研究證實(shí)，吸入性麻醉藥異氟烷可以誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，造成大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元凋亡［9-10］，引起未成年小鼠大量腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生術(shù)后認(rèn)知功能或持續(xù)性學(xué)習(xí)功能障礙［11］。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平探討了異氟烷的神經(jīng)毒性以及影響學(xué)習(xí)記憶能力的潛在機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，0.96 mmol/L異氟烷處理后小鼠神經(jīng)元活力明顯下降（P＜0.05）；磷酸化ERK1/2和CREB顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果提示，一定濃度的異氟烷可以降低原代培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)元活力和ERK1/2、CREB的磷酸化水平，可能與異氟烷誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶損傷及術(shù)后POCD相關(guān)。

ERK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，在神經(jīng)系統(tǒng)中，ERK分布廣泛，參與突觸可塑性長時(shí)程增強(qiáng)電位誘導(dǎo)過程［12］，也參與神經(jīng)元的凋亡，在記憶過程中發(fā)揮重要作用。研究證明，將ERK通路阻斷后，可抑制LTP的形成［13］，而影響學(xué)習(xí)記憶功能。Mawh inney等［14］發(fā)現(xiàn)，異氟烷可降低海馬和皮質(zhì)的磷酸化ERK1/2，導(dǎo)致空間認(rèn)知功能障礙。Liu等［15］發(fā)現(xiàn)，低濃度及短時(shí)間應(yīng)用異氟烷可以提高pERK1/2水平，可能改善認(rèn)知功能，而高濃度應(yīng)用異氟烷超過4 h則會降低pERK1/2水平，而損害認(rèn)知功能。本研究也發(fā)現(xiàn)，0.96 mmol/L的異氟烷溶液作用能對小鼠神經(jīng)元產(chǎn)生明顯的毒性作用，且隨處理時(shí)間延長，p-ERK1/2的表達(dá)逐漸降低（P＜0.05）。

CREB是一種分子量為43 kD的核轉(zhuǎn)錄因子蛋白，參與了神經(jīng)干細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、學(xué)習(xí)記憶等正常生理活動［16］。CREB上Ser-133的磷酸化位點(diǎn)是許多蛋白激酶的作用靶點(diǎn)，一旦被磷酸化，CREB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動并激發(fā)長時(shí)程增強(qiáng)電位相關(guān)蛋白的合成，對于神經(jīng)突觸可塑性長時(shí)間改變有重要作用［17］。有結(jié)果表明在脊椎動物CREB基因被破壞后，其長時(shí)記憶形成受到影響。施小嬌等［18］發(fā)現(xiàn)：高濃度七氟烷可以引起大鼠麻醉后早期認(rèn)知功能障礙，并呈劑量依賴性，CREB蛋白磷酸化的抑制以及記憶相關(guān)蛋白合成的減少可能是機(jī)制之一。本研究中異氟烷處理組小鼠神經(jīng)元中 p-CREB表達(dá)水平均明顯降低 （P＜0.05）；并隨處理時(shí)間延長而逐漸降低（P＜0.05）。

依文獻(xiàn)報(bào)道［19］，0.28mmol/L異氟烷相當(dāng)于臨床上1個(gè)最小肺泡濃度（Minimal alveolar concentration，MAC）的血藥濃度，一般臨床常用1.3 MAC。本研究將神經(jīng)元暴露于0.96mmol/L的異氟烷濃度中，明顯高于臨床常用量，隨著處理時(shí)間的延長，神經(jīng)元活力逐漸下降，與學(xué)習(xí)與記憶有關(guān)的蛋白表達(dá)受到抑制。結(jié)果提示臨床中降低用藥濃度，減少使用時(shí)間將有助于減少認(rèn)知障礙及學(xué)習(xí)記憶能力下降的發(fā)生。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，異氟烷的神經(jīng)毒性可能是由于異氟烷直接造成了神經(jīng)細(xì)胞活力的下降，同時(shí)也顯著抑制了神經(jīng)元內(nèi)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的重要蛋白ERK和CREB的活性。這些現(xiàn)象可能與異氟烷引發(fā)圍術(shù)期成年患者術(shù)后POCD相關(guān)。可能機(jī)制包括線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、抑制海馬神經(jīng)元腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體的水解，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡等［20］。還需要更多的工作來深入研究異氟烷與ERK/CREB通路間復(fù)雜的相互作用，以明確異氟烷在神經(jīng)損傷中的確切作用。

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Effect of Isoflurane exposure on expressions of ERKs and CREB in neuron of newborn mice

ZHANG Bin
Department of Anesthesiology，Jinzhou Central Hospital，Liaoning Province，Jinzhou121001，China

R614.2

A

1673-7210（2016）09（b）-0022-04

2016-06-10本文編輯：任念）

張斌（1977.10-），男，副主任醫(yī)師；研究方向：神經(jīng)阻滯、體外循環(huán)。