馬維娜　　孟擁軍

上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上?！?01800

吉西他濱、順鉑及香菇多糖對Lew is肺癌細(xì)胞株抑制作用的實驗研究

馬維娜孟擁軍

上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海201800

目的 研究吉西他濱、順鉑、香菇多糖三種藥物單獨使用及聯(lián)合使用對Lewis肺癌細(xì)胞株的增殖抑制作用。方法 分別使用不同濃度的吉西他濱（0.5、1、2、5、8、10、12μg/mL）、順鉑（1、2、4、8、10、16、20μg/mL）、香菇多糖（50、100、150、200、250、300、400μg/mL）單獨及聯(lián)合處理Lewis肺癌細(xì)胞株，24 h后MTT法測定細(xì)胞生長抑制作用，應(yīng)用金氏公式進(jìn)行聯(lián)合用藥分析。結(jié)果 吉西他濱、順鉑、香菇多糖對Lewis肺癌細(xì)胞均有不同程度的增殖抑制作用，兩種或三種藥物聯(lián)用后對Lewis肺癌細(xì)胞株的抑制率顯著增加，其中8μg/mL的吉西他濱與10μg/mL的順鉑和250μg/mL香菇多糖聯(lián)用時，其抑制率近似于10μg/mL的吉西他濱和16μg/mL的順鉑兩藥聯(lián)用；而當(dāng)香菇多糖的濃度增加至200μg/mL時，三藥聯(lián)用的抑制率明顯高于吉西他濱和順鉑兩組藥物聯(lián)用（P＜0.05）。結(jié)論 香菇多糖可增強吉西他濱和順鉑對Lewis肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，并且聯(lián)用后能夠減少常規(guī)化療藥物的用量。

吉西他濱；順鉑；香菇多糖；Lew is肺癌細(xì)胞株；MTT法

［Abstract］Objective To investigate the anti-proliferative effect of single use of Gemcitabine，Cisplatin，Lentinan and combination of them on Lewis lung cancer cell lines.Methods Lewis lung cancer lineswere treated with different concentrations of Gemcitabine（0.5，1，2，5，8，10，12μg/mL），Cisplatin（1，2，4，8，10，16，20μg/mL），Lentinan（50，100，150，200，250，300，400μg/mL）and combination of them separately.After 24 hours，the inhibitory effects weremeasured with MTT assay and Jin formula was applied to analyze the combination effect of the drugs.Results Gemcitabine，Cisplatin and Lentinan all showed the anti-proliferative effects on Lewis cancer cell lines in varying degree.The inhibitory rates of any two or three drugs of them were significantly higher，among which，the inhibitory rate of combination use of 8μg/mL Gemcitabine，10μg/mL Cisplatin and 250μg/mL Lentinan was close to that of 10μg/mL Gemcitabine and 16μg/mL Cisplatin.When the concentration of Lentinan increased to 200μg/mL，the suppression rate of the tumor in three-drug regimen group was higher than that in the Gemcitabine combined with Cisplatin group（P＜0.05）.Conclusion Gemcitabine，Cisplatin shows the anti-proliferative effect on Lewis lung cancer cell lines distinctly，and the drugs have better cooperative effect combined with Lentinan，furthermore，the combined use can reduce conventional chemotherapy doses.

［Key words］Gemcitabine；Cisplatin；Lentinan；Lewis lung cancer cell line；MTT assay

肺癌是導(dǎo)致人類癌性死亡的首位疾病，全球每年因肺癌死亡的人數(shù)超過100萬人，其中80%～90%的患者為非小細(xì)胞肺癌［1］。在腫瘤化療過程中，化療所產(chǎn)生的不良反應(yīng)以及腫瘤細(xì)胞的耐藥性經(jīng)常限制其療效和應(yīng)用，采用聯(lián)合用藥的方式可以使藥物對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮最大限度的殺傷，近年來常采用中西藥聯(lián)用的方法［2］。吉西他濱+順鉑（GP療法）治療非小細(xì)胞肺癌是目前臨床上常見的一種化療方案［3］。吉西他濱是阿糖胞苷類抗代謝抗癌藥，主要作用于DNA合成期和晚G1期，并可阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期［4］，體外實驗中發(fā)現(xiàn)其對多種鼠及人的腫瘤細(xì)胞有療效，并且具有較強的酶親和力和細(xì)胞膜穿透性，此外由于其特殊的藥代動力學(xué)特征，致使藥物在體內(nèi)的作用時間延長，從而增加療效［5］。順鉑屬細(xì)胞周期非特異性藥物，進(jìn)入體內(nèi)后，可與DNA鏈上的堿基形成交叉聯(lián)結(jié)，從而破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，具有抗瘤譜廣等特點，對肺癌、睪丸癌、前列腺癌、膀胱癌、宮頸癌、黑色素瘤、淋巴肉瘤等具有較好的療效［6］。香菇多糖是從優(yōu)質(zhì)香菇的子實體中提取而得，是香菇的主要組成部分。香菇多糖注射液具有抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能和刺激干擾素形成等功能［7］，是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的抗腫瘤中藥注射劑，能夠通過作用于各種免疫細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞、樹狀突細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）刺激免疫系統(tǒng)來增強免疫反應(yīng)［8］，目前在臨床抗腫瘤方面的應(yīng)用較為廣泛，研究顯示香菇多糖能增強放療、化療作用［9］。本研究采用吉西他濱、順鉑及香菇多糖單獨用藥，吉西他濱和順鉑兩藥聯(lián)用，以及香菇多糖聯(lián)合吉西他濱和順鉑三藥聯(lián)用后，分別檢測其對Lewis肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，以期尋找治療非小細(xì)胞肺癌更加有效的組合方案，為進(jìn)一步研究三種藥物的相互作用機(jī)制提供基礎(chǔ)，并為臨床應(yīng)用提供可行性依據(jù)。

1　材料與方法

1.1藥物與主要試劑

吉西他濱為江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號為140310；順鉑為江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號為150402；香菇多糖為江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號為150807；Lewis肺癌細(xì)胞購于中國科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫；胎牛血清為杭州四季青生物工程研究所產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)液購自上海一飛生物技術(shù)有限公司；0.25%胰酶為Hyclone公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（DMSO）和噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞系及培養(yǎng)

在37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中，用含1%雙抗（青霉素100 kU/L、鏈霉素100 kU/L），10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞株，2～3 d換液1次，倒置顯微鏡觀察生長情況，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時用0.25%胰酶消化，以1∶3比例傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3細(xì)胞增殖檢測（MTT法）

取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞調(diào)整濃度至5× 104個細(xì)胞/mL，接種于96孔板，每孔180μL，置于37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，分為空白對照組（僅含培養(yǎng)基）、對照組（細(xì)胞+培養(yǎng)基）和各種不同濃度藥物的實驗組。實驗組分單藥組：將三種單藥的7個不同濃度分別加在96孔板內(nèi)，每孔加藥量20μL，使吉西他濱的終濃度為0.5、1、2、5、8、10、12μg/mL，順鉑的終濃度為1、2、4、8、10、16、20μg/mL，香菇多糖的終濃度為50、100、150、200、250、300、400μg/mL；聯(lián)合用藥組分為吉西他濱+順鉑組、吉西他濱+順鉑+香菇多糖組，聯(lián)合用藥組中吉西他濱、順鉑和香菇多糖的終濃度與單用藥組相同，按濃度梯度依次加藥，每組設(shè)5個復(fù)孔，在CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后吸去上清液，用PBS溶液漂洗3遍，加入200μL DMEM培養(yǎng)基，每孔中加0.5%MTT 20μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將96孔板置于離心機(jī)中，1000 r/min離心5min，小心吸取并棄上清液，加入180μL二甲基亞砜溶液充分溶解結(jié)晶，于自動酶標(biāo)讀數(shù)儀490 nm處測定各孔吸光度（A），并計抑制率及IC50［10］。實驗重復(fù)3次，取平均值。

腫瘤細(xì)胞抑制率（IR）=［1-（給藥組A值-空白組對照組A值）/（陰性對照組A值-空白對照組A值）］。聯(lián)合用藥對細(xì)胞增殖抑制率參照金氏公式判斷［11］：Q= E（a+b）/（Ea+Eb-Ea×Eb），其中E（a+b）為兩藥合用的抑制率，Ea為A藥單用的抑制率，Eb為B藥單用的抑制率。0.85≤Q＜1.15為兩藥相加作用（+），Q≥1.15為兩藥協(xié)同作用（++），0.55≤Q＜0.85為兩藥拮抗作用（-），Q＜0.55為明顯拮抗作用（--）。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

用SAS9.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三種藥物單用對Lew is肺癌細(xì)胞株的抑制作用

實驗結(jié)果表明吉西他濱、順鉑、香菇多糖三種藥物單獨使用對Lewis肺癌細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，抑制率的大小呈劑量依賴性。其中吉西他濱和順鉑的作用較強，5μg/mL吉西他濱和10μg/mL順鉑對Lewis肺癌細(xì)胞24 h抑制率分別為（47.33±4.94）%和（45.31±2.06）%，而香菇多糖的作用相對較弱，需要較高的濃度才能產(chǎn)生明顯的抑制率。吉西他濱、順鉑和香菇多糖作用24 h后對Lewis肺癌細(xì)胞株的IC50分別為4.40、10.97μg/mL和334.09μg/mL。見表1及圖1～3。

2.2兩種及三種藥物聯(lián)用對Lew is肺癌細(xì)胞株的抑制作用

吉西他濱和順鉑兩藥聯(lián)用組作用24 h后對Lewis肺癌細(xì)胞株的抑制率明顯高于單獨用藥組（P＜0.05），通過計算Q值，低濃度的兩組藥物聯(lián)用（吉西他濱濃度為0.5、1、2μg/mL，順鉑濃度為1、2、8μg/mL）表現(xiàn)為協(xié)同作用，當(dāng)濃度增加后兩組藥物聯(lián)用（吉西他濱濃度為5、8、10、12μg/mL，順鉑濃度為8、10、16、20μg/mL）表現(xiàn)為相加作用，見表2及圖4。吉西他濱順鉑香菇多糖三藥聯(lián)用組中吉西他濱和順鉑的濃度與兩藥聯(lián)用組一致，當(dāng)香菇多糖的加藥濃度為50、250、300、400μg/mL時，三藥聯(lián)用組的抑制率明顯大于兩藥聯(lián)用組（P＜0.05），見表3及圖4。

表1　吉西他濱、順鉑、香菇多糖對Lew is肺癌細(xì)胞株的抑制作用（%，±s）

表1　吉西他濱、順鉑、香菇多糖對Lew is肺癌細(xì)胞株的抑制作用（%，±s）

組別　　抑制率　IC50（μg/mL）吉西他濱組（μg/mL）0.5 4.40 12581 0 12順鉑組（μg/mL）28.24±3.32 30.01±4.24 32.67±3.38 47.33±4.94 68.12±3.01 70.50±1.98 71.58±2.05 10.97 12481 0 16 20香菇多糖組（μg/mL）50 100 150 200 250 300 400 4.26±2.65 10.74±2.58 21.67±3.27 32.93±3.58 45.31±2.06 61.17±4.01 73.87±3.84 334.09 11.8±3.25 17.45±4.01 23.47±3.58 27.94±2.34 35.69±4.37 51.67±5.24 64.32±2.11

圖1　吉西他濱對Lewis肺癌細(xì)胞株濃度與抑制率的關(guān)系

圖2　順鉑對Lewis肺癌細(xì)胞株濃度與抑制率的關(guān)系

圖3　香菇多糖對Lew is肺癌細(xì)胞株濃度與抑制率的關(guān)系

表2　兩種藥物聯(lián)用對Lewis肺癌細(xì)胞株的抑制作用（%，x±s）

3　討論

肺癌是我國常見惡性腫瘤，目前臨床常用吉西他濱加順鉑（GP方案）治療非小細(xì)胞肺癌，并取得較好療效［12-13］。但化療引起的不良反應(yīng)較多，增加患者痛苦，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，因此提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，減少化療藥物的不良反應(yīng)有重要臨床價值［14］。近年來，有研究人員將香菇多糖與吉西他濱和順鉑聯(lián)用，用于對非小細(xì)胞肺癌的治療，結(jié)果顯示與GP方案比較，聯(lián)用藥物后有更好的療效，能夠明顯改善患者生活質(zhì)量，提高生存期，并可耐受其毒副作用［15-16］。

香菇多糖是從真菌香菇的子實體中分離到的β-1，3-葡聚糖，是一種具有抑制腫瘤和提高免疫功能的多糖類生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，通過非特異性激發(fā)激活宿主產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答，以達(dá)到控制和殺滅腫瘤細(xì)胞的目的［17］。體外實驗和臨床報道顯示其具有抗腫瘤和增強免疫功能的作用，目前臨床應(yīng)用已顯示出了較好的療效［18］。有體內(nèi)實驗采用MTT法考察香菇多糖對多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，研究結(jié)果表明香菇多糖對K-562、PC-3、HepG2和A-549腫瘤細(xì)胞都具有一定的細(xì)胞毒性作用［19］，因此可以認(rèn)為香菇多糖以其對腫瘤細(xì)胞的毒性作用，殺傷抑制腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療部分腫瘤的目的。本研究也得到了以上結(jié)論，實驗結(jié)果提示吉西他濱、順鉑和香菇多糖對Lewis肺癌細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用，兩種或三種藥物聯(lián)用后對Lewis肺癌細(xì)胞株的抑制率顯著增加。本研究還發(fā)現(xiàn)三藥聯(lián)用時，較低濃度的香菇多糖（100、150μg/mL）與吉西他濱和順鉑聯(lián)用，對Lewis肺癌細(xì)胞的抑制作用沒有顯著性差異，而當(dāng)香菇多糖的濃度增加至200μg/mL時，三藥聯(lián)用的抑制率明顯高于吉西他濱和順鉑兩組藥物聯(lián)用（P＜0.05），且與250μg/mL香菇多糖聯(lián)用后8μg/mL的吉西他濱和10μg/mL的順鉑能夠達(dá)到10μg/mL的吉西他濱和16μg/mL的順鉑兩藥聯(lián)用的效果，由此本研究認(rèn)為香菇多糖抗腫瘤作用具有最佳量效關(guān)系，當(dāng)與化療藥物聯(lián)用時能夠明顯提高對腫瘤細(xì)胞的抑制率，且香菇多糖作為一種生物調(diào)節(jié)劑，可以通過免疫系統(tǒng)直接或間接增強機(jī)體的抗腫瘤效應(yīng)［20］。

圖4　藥物聯(lián)用對Lewis肺癌細(xì)胞株的抑制作用

表3　三種藥物聯(lián)用對Lew is肺癌細(xì)胞株的抑制作用（x±s）

綜上所述，三藥聯(lián)用具有明顯的協(xié)同作用，可能與它們不同的抗腫瘤機(jī)制有關(guān)，三者聯(lián)合應(yīng)用可以通過互補而增強抗腫瘤效果。但由于香菇多糖屬于中成藥，含有多種成分且作用機(jī)制較為復(fù)雜，其機(jī)制在分子生物學(xué)方面尚未得到完全闡明，與常規(guī)化療藥物聯(lián)用時的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

［1］Mitra AP，Castelao JE，Hawes D，et al.Cancer statistics，2012［J］.CA Cancer JClin，2012，62（1）：10-29.

［2］馬維娜，王蓉，吳巖，等.紫杉醇、順鉑及康萊特對Lewis肺癌細(xì)胞株抑制作用的實驗研究［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2012，14（5）：863-865.

［3］陳毅鵬，陳小霞.PP方案和GP方案治療晚期非小細(xì)胞肺癌的Meta分析［J］.實用癌癥雜志，2015，30（11）：1633-1638.

［4］張帆，謝賢和.吉西他濱抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)凋亡的研究［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2015，31（7）：508-510.

［5］WeiMY，Zhuang YF，WangWM.Gemcitabine for the treatment of patientswith osteosarcoma［J］.Asian Pac JCancer Prev，2014，15（17）：7159-7162.

［6］Li CH，Liu MY，Liu W，et al.Randomized control study of nedaplatin or cisplatin concomitantwith other chemotherapy in the treatment of advanced non-small cell lung cancer［J］.Asian Pac JCancer Prev，2014，15（2）：731-736.

［7］Xu H，Zou S，Xu X，et al.Anti-tumor effect ofβ-glucan from Lentinus edodes and the underlying mechanism［J］. Sci Rep，2016，6：28802.

［8］Nishitani Y，Zhang L，Yoshida M，et al.Anti-inflammatory activity of Lentinan：influence on IL-8 and TNFR1 expression in intestinal epithelial cells［J］.PLoS One，2013，8（4）：e62441.

［9］Sun M，ZhaoW，Xie Q，et al.Lentinan reduces tumor progression byenhancinggemcitabine chemotherapy in urothelial bladder cancer［J］.Surg Oncol，2015，24（1）：28-34.

［10］趙斌，葛金芳，朱娟娟，等.小議在MTT法測細(xì)胞增殖抑制率中IC50的計算方法［J］.安徽醫(yī)藥，2007，11（9）：834-836.

［11］薛飛，唐波，鄔春久，等.金氏公式評價曲克蘆丁與燈盞花素合用抗沙土鼠全腦缺血作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2008，24（2）：20-21.

［12］王靜，李峻嶺，石遠(yuǎn)凱，等.吉西他濱聯(lián)合順鉑在非小細(xì)胞肺癌輔助化療中的應(yīng)用［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2012，15（3）：987-989.

［13］Yuan ZJ，Zhou WW，Liu W，et al.Association of GSTP1 and RRM1 polymorphismswith the response and toxicity of Gemcitabine-cisplatin combination chemotherapy in Chinese patients with non-small cell lung cancer［J］. Asian Pac JCancer Prev，2015，16（10）：4347-4351.

［14］張康樂，司文濤，邵宏敏.中醫(yī)藥治療在腫瘤化療不良反應(yīng)中的應(yīng)用［J］.中國中醫(yī)急癥，2015，24（7）：1212-1214.

［15］趙文英，陳冬云，陳景華.香菇多糖聯(lián)合吉西他濱+順鉑方案一線治療晚期非小細(xì)胞肺癌近期療效與不良反應(yīng)觀察［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2013，18（1）：71-77.

［16］代東.香菇多糖聯(lián)合GP方案治療非小細(xì)胞肺癌的近遠(yuǎn)期療效及毒副反應(yīng)［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，23（15）：1627-1630.

［17］Tanaka K，Tanaka Y，Suzuki T，etal.Protective effectof-（1，3-1，6）-D-glucan against irritant-induced gastric lesions［J］.Br JNutr，2011，106（4）：475-485.

［18］馬金華.香菇多糖聯(lián)合NP方案對中晚期非小細(xì)胞肺癌患者的療效及免疫功能的影響［J］.中國生化藥物雜志，2014，34（8）：154-156.

［19］胡靜娜.噻唑藍(lán)法測定香菇多糖體外對癌細(xì)胞毒作用［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32（4）：464-466.

［20］Sun M，ZhaoW，Xie Q，etal.Lentinan reduces tumor progressionbyenhancinggemcitabinechemotherapyinurothelial bladder cancer［J］.Surg Oncol，2015，24（1）：28-34.

Experimental study on the inhibitory effect of Gemcitabine，Cisplatin and Lentinan on Lewis lung cancer cell line

MAWeina MENG Yongjun
Department of Pharmacy，Jiading Central Hospital of Shanghai City，Shanghai201800，China

R734.2

A

1673-7210（2016）09（b）-0018-04

2016-05-03本文編輯：張瑜杰）

上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院院級課題 （2014-12-01）。

馬維娜（1983.5-），女，碩士；研究方向：藥理學(xué)。

孟擁軍（1971.7-），男，副主任藥師；研究方向：藥理學(xué)。