賴　文，張全林，任紅宇

（閬中市農(nóng)牧業(yè)局，四川 閬中 637400）

產(chǎn)細(xì)菌素戊糖乳桿菌B8發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立

賴文，張全林，任紅宇

（閬中市農(nóng)牧業(yè)局，四川 閬中 637400）

從四川香腸中選育出一株具有產(chǎn)細(xì)菌素能力的戊糖乳桿菌B8，在10 L發(fā)酵罐內(nèi)對(duì)其進(jìn)行分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，建立菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成、底物消耗及pH隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)模型，確定模型參數(shù)，得到其菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型）、細(xì)菌素生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)模型葡萄糖消耗動(dòng)力學(xué)模型pH值變化的數(shù)學(xué)模型y=結(jié)果表明，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值吻合較好，為工業(yè)放大生產(chǎn)細(xì)菌素提供了理論依據(jù)和方法。

戊糖乳桿菌；細(xì)菌素；動(dòng)力學(xué)模型

乳酸菌細(xì)菌素是在乳酸菌代謝過(guò)程中由核糖體合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽［1-2］，已在水產(chǎn)養(yǎng)殖、蠶業(yè)、動(dòng)物生產(chǎn)［3-7］等方面有重要應(yīng)用。生物培養(yǎng)的生物化學(xué)過(guò)程非常復(fù)雜，包括了各種反應(yīng)與物質(zhì)交換，因此，建立動(dòng)力學(xué)模型是為了盡可能簡(jiǎn)單的描述最基本的反應(yīng)特征［8-10］。本試驗(yàn)對(duì)篩選于四川發(fā)酵香腸中具有產(chǎn)生細(xì)菌素能力的戊糖乳桿菌B8進(jìn)行分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型研究，旨在為進(jìn)一步放大試驗(yàn)和工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）B8：分離于四川香腸；指示菌：藤黃微球菌（Micrococcus luteus）10209、銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 27853。

1.1.2試劑

Nisin（106IU/g）：浙江銀象生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、蒽酮、硫酸銨、濃硫酸等（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用MRS液體培養(yǎng)基。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5 g、檸檬酸二胺2 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉2 g、硫酸錳0.25 g、硫酸鎂0.58 g、水1 000 mL，pH 6.2～6.4，121℃滅菌15 min。

1.2儀器與設(shè)備

RZ-10 L發(fā)酵罐：南京潤(rùn)澤生物工程設(shè)備有限公司；SW-CJ-D潔凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；YX-280B滅菌鍋：武漢金志飛凈化設(shè)備有限公司；PHS-3C pH計(jì)：上海精科儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1發(fā)酵方法

將戊糖乳桿菌B8活化，接入種子培養(yǎng)基，逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，以3%的接種量接種于裝有7 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為30℃、起始pH 6.0、100 r/min攪拌。分別于0、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h、28 h、32 h、36 h 9個(gè)點(diǎn)取樣，每次取樣50 mL，置于4℃冰箱中保存，用于分批發(fā)酵各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2分析方法

生物量測(cè)定：取發(fā)酵液40 mL，于4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液。沉淀用10 mL無(wú)菌水洗滌2次，收集菌體于80～90℃干燥至恒質(zhì)量，稱量。

葡萄糖測(cè)定：蒽酮-硫酸比色法［11-12］。

pH的測(cè)定：pH計(jì)測(cè)定。

細(xì)菌素產(chǎn)量的測(cè)定：發(fā)酵上清液用硫酸銨（70%飽和度）沉淀，緩慢攪拌1 h，4℃放置12 h，10 000 r/min離心30 min，收集沉淀。加入0.02 mol/L鹽酸0.5 mL使之溶解，得到粗提液。采用牛津杯雙層瓊脂法，向含指示菌平板（107CFU/mL）瓊脂孔中加入100 μL粗提液和對(duì)照液。4℃擴(kuò)散1 h，37℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

0.02mol/LHCl配制效價(jià)100～2000IU/mL（以500 IU/mL遞增）的Nisin溶液，以藤黃微球菌為指示菌，檢測(cè)活性。以效價(jià)對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X）、抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)（Y），繪制Nisin效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=4.432 6X+ 3.980 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8。取樣品液100 μL加入銅綠假單桿菌檢測(cè)平板中，3次重復(fù)，樣品抑菌圈直徑平均值計(jì)算樣品效價(jià)。

1.3.3數(shù)據(jù)處理方法用Origin8.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和模型，擬合模型參數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1戊糖乳桿菌B8的分批發(fā)酵過(guò)程

圖1　分批發(fā)酵曲線Fig.1 Batch fementation curve

戊糖乳桿菌B8在發(fā)酵過(guò)程中生物量（X），細(xì)菌素產(chǎn)量（P）、底物消耗（S）和pH值（y）隨發(fā)酵時(shí)間（t）變化情況見圖1。發(fā)酵過(guò)程中，戊糖乳桿菌B8適應(yīng)期較短，可忽略。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，菌體快速生長(zhǎng)伴隨著葡萄糖快速消耗、細(xì)菌素生成和pH的快速下降。生物量在發(fā)酵24 h后變化減緩，葡萄糖消耗亦減慢。從發(fā)酵過(guò)程看，戊糖乳桿菌B8發(fā)酵產(chǎn)生細(xì)菌素的過(guò)程符合微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成規(guī)律。

2.2發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立

2.2.1菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

Logistic方程是一個(gè)典型的S型曲線，能反映分批發(fā)酵過(guò)程中菌體濃度增加對(duì)自身生長(zhǎng)的抑制作用，較好地?cái)M合發(fā)酵過(guò)程的菌體生長(zhǎng)規(guī)律。采用此方程作為戊糖乳桿菌B8菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型。

式中：X為發(fā)酵過(guò)程中菌體含量，g/L；μm為最大比生長(zhǎng)速率，h；Xm為發(fā)酵過(guò)程中最大菌體質(zhì)量濃度，g/L；t為發(fā)酵時(shí)間，h。

2.2.2產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型

產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型發(fā)酵產(chǎn)物形成非常復(fù)雜，GADEN E L Jr.［13］根據(jù)分批發(fā)酵產(chǎn)物生成和細(xì)胞生長(zhǎng)之間關(guān)系將產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型分為3種類型：Ⅰ產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)相耦聯(lián)；Ⅱ產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)部分耦聯(lián)；Ⅲ產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有聯(lián)系。Luedeking—Piret方程如下［14］：

式中：P為細(xì)菌素效價(jià)（IU/mL）；α為與菌體生長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)產(chǎn)物生成常數(shù)；β為與菌體量相關(guān)聯(lián)產(chǎn)物生成常數(shù)。當(dāng)α≠0、β=0時(shí)，表示I類發(fā)酵；α≠0、β≠0時(shí)，表示Ⅱ類發(fā)酵；α=0、β≠0時(shí)，表示Ⅲ類發(fā)酵。

2.2.3基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型

發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)（葡萄糖）消耗主要用于細(xì)胞生長(zhǎng)，代謝產(chǎn)物積累和細(xì)胞維持。底物消耗動(dòng)力學(xué)模型底物消耗模型有基于物料衡算的理論模型：

式中：S為葡萄糖質(zhì)量濃度，g/L；ms為維持系數(shù)，g/（g·h）；Yx/s為菌體得率系數(shù)，g/g；Yp/s為對(duì)底物的產(chǎn)物得率系數(shù)，g/g。

2.2.4pH值變化數(shù)學(xué)模型

戊糖乳桿菌B8發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液pH值隨時(shí)間改變，主要因?yàn)榘l(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸。在乳酸發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型中，將乳酸產(chǎn)量用產(chǎn)物形成模型來(lái)分析［15］，但乳酸含量增加不是影響發(fā)酵液pH改變的唯一因素。戊糖乳桿菌B8發(fā)酵過(guò)程中pH值變化成典型反S型趨勢(shì)，選用非線性擬合中的“Growth/Sigmoidal”中的函數(shù)進(jìn)行擬合分析，并做模型比較，確定最優(yōu)模型。

2.3動(dòng)力學(xué)模型求解擬合

2.3.1菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的求解

對(duì)式（1）進(jìn)行積分可得

用Origin 8.0按式（4）非線性曲線擬合，得到菌體濃度X隨時(shí)間變化的函數(shù)為：

根據(jù)式（5）計(jì)算出最大菌體含量Xm=1.908 g/L，菌體初始含量X0=0.063 74 g/L，最大比生長(zhǎng)速率μm=0.566 9 h-1。戊糖乳桿菌B8菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型見式（6），曲線擬合度為0.995 2：

該方程與實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)能較好的擬合，結(jié)果如圖2所示，該菌體生長(zhǎng)模型能較好地描述發(fā)酵過(guò)程中的菌體生長(zhǎng)情況。

圖2　菌體濃度隨時(shí)間變化曲線Fig.2 Changes of bacteria concentration with time

2.3.2產(chǎn)物生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)模型求解

將式（1）代入式（2）并積分：

將μm=0.566 9，X0=0.063 74 g/L，Xm=1.908 g/L，代入產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型，整理成：

用Origin 8.0對(duì)發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌素合成數(shù)據(jù)處理，可得α=75.25，β=122.94，因此細(xì)菌素生成動(dòng)力學(xué)表達(dá)式為式（9）：

該方程與實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)能較好的擬合（如圖3），曲線擬合度為0.991 4，該產(chǎn)物形成模型能較好地描述發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌素的形成情況，預(yù)測(cè)生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)菌素產(chǎn)量。

圖3　細(xì)菌素產(chǎn)量隨時(shí)間變化曲線Fig.3 Changes of bacteriocin accumulation with time

2.3.3底物消耗動(dòng)力學(xué)模型的求解

為簡(jiǎn)化模型，菌體呼吸等維持代謝消耗歸結(jié)在長(zhǎng)菌消耗之內(nèi)，因此可以采用Luedeking—Piret—Like方程來(lái)描述底物的消耗情況：

式中：S為葡萄糖的質(zhì)量濃度，g/L；k1為與菌體生長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)的底物消耗常數(shù)；k2為與菌體量相關(guān)聯(lián)的底物消耗常數(shù)。

將式（1）和式（2）代入式（10）積分得：

S0為葡萄糖的初始質(zhì)量濃度（g/L），用Origin8.0軟件按式（11）進(jìn)行非線性曲線擬合，可求得S0=18.79，k1=5.843，k2=0.799 8，獲得底物消耗動(dòng)力學(xué)方程為：

該方程與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能夠較好的擬合（圖4），曲線擬合度為0.998 7。該基質(zhì)消耗模型能很好地描述發(fā)酵過(guò)程中的基質(zhì)葡萄糖的消耗情況，可用于預(yù)測(cè)生產(chǎn)過(guò)程中葡萄糖的需求量。

圖4　葡萄糖消耗量隨時(shí)間變化曲線Fig.4 Changes of glucose consumption with time

2.3.4發(fā)酵pH值變化數(shù)學(xué)模型

由圖1可知，發(fā)酵過(guò)程中pH值變化成典型反S型趨勢(shì)，選用非線性擬合中的“Growth/Sigmoidal”中的函數(shù)進(jìn)行擬合分析，得出兩個(gè)擬合度較高的方程如下：

用Origin 8.0對(duì)Logistic方程及Hill1方程做比較，結(jié)果見圖5及表1。

圖5　pH值隨時(shí)間變化曲線Fig.5 Changes of pH value with time

表1　模型比較Table 1 Comparison of models

由此可知，Logistic方程AIC值低于Hill1方程，準(zhǔn)確性為Hill1方程的1.065 89倍，即以Logistic方程建立的pH變化模型較優(yōu)。最終獲得pH隨時(shí)間變化的方程為：

3　結(jié)論

采用Logistic方程、Luedeking-Piret方程，結(jié)合戊糖乳酸桿菌B8發(fā)酵特征分析，建立了戊糖乳桿菌發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成、基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型及pH值變化的數(shù)學(xué)模型。三個(gè)動(dòng)力學(xué)模型的擬合度都較高，因此可以用來(lái)描述戊糖乳桿菌B8在發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵過(guò)程。pH值變化的數(shù)學(xué)模型擬合度高，可用作了解發(fā)酵液pH值變化，并在進(jìn)一步的試驗(yàn)中了解該模型適用性和建立參數(shù)與發(fā)酵過(guò)程的關(guān)系。對(duì)于優(yōu)化發(fā)酵工藝，進(jìn)一步放大具有重要指導(dǎo)作用。

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Establishment of fermentation kinetic models for bacteriocin-producingLactobacillus pentosusB8

LAI Wen，ZHANG Quanlin，REN Hongyu
（Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Langzhong，Langzhong 637400，China）

Lactobacillus pentosusB8 with bacteriocin production was screened from Sichuan sausage，and batch fermentation kinetic study was investigated in 10 L fermentor.The kinetic models of cell growth，bacteriocin production，substrate consumption and pH with time were established， model parameters were determined.The cell growth model was），the bacteriocin production model was 122.94X，the substrate consumption model was，and pH model wasy=+5.992 8.The results obtained from model were in agreement with experiments data，indicating that the models had good applicability.

Lactobacillus pentosus；bacteriocin；kinetic model

Q936

0254-5071（2016）09-0086-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.020

2016-04-25

賴文（1985-），女，農(nóng)藝師，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。