摘要：林木生長周期長，受環(huán)境影響大，遺傳雜合性高，增加了常規(guī)育種的盲目性。生物技術(shù)的發(fā)展為林木新品種的培育提供了新的途徑。本文概述了分子標(biāo)記、基因工程和細(xì)胞工程在林木遺傳育種中的應(yīng)用，以期為相關(guān)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：林木育種；生物技術(shù)；分子標(biāo)記；基因工程；細(xì)胞工程

中圖分類號： S722 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.12.047

森林是人類的資源寶庫，不僅能夠提供木材、油料、中草藥材等林產(chǎn)品，還帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，且具有防風(fēng)固沙、涵養(yǎng)水分、美化環(huán)境等生態(tài)效益。近年來，環(huán)境保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展越來越受到人們的重視，對生態(tài)環(huán)境保護(hù)的要求越來越高，而人們對木材的需求量也日漸增加，因此保護(hù)現(xiàn)有的森林資源，營造優(yōu)質(zhì)人工林顯得尤為重要。但林木常規(guī)育種周期長、受環(huán)境影響大，增加了育種的盲目性[1]，生物技術(shù)的運(yùn)用可對林木的基因進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)，讓林木生長的特性發(fā)生變化，打破種間雜交不親和的界限，加速林木新品種的培育，有效地提高林木資源的供應(yīng)[2， 3]。因此依靠生物技術(shù)手段與常規(guī)育種相結(jié)合，縮短育種周期，選育新品種，營造優(yōu)質(zhì)人工林，對緩解木材需求和生態(tài)環(huán)境保護(hù)的矛盾具有重要的意義[4]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇育種以及基因工程技術(shù)手段的應(yīng)用，為加速林木新品種的選育奠定了基礎(chǔ)[5]。

1 分子標(biāo)記技術(shù)

DNA分子標(biāo)記（DNA Molecular Marker）通過核苷酸序列的差異直接反映了DNA水平的遺傳多態(tài)性，作為新一代的遺傳標(biāo)記技術(shù)，其較傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記等遺傳標(biāo)記精度更高、穩(wěn)定性更好、信息量更大，具有更高的多態(tài)性而更能全面的反映遺傳多樣性[6]。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)也不斷發(fā)展更新，目前已廣泛應(yīng)用于同源性分析、基因定位、遺傳育種等多個(gè)方面[7]。

1.1 主要的DNA分子標(biāo)記技術(shù)

隨著各種生物技術(shù)的不斷發(fā)展，DAN分子標(biāo)記從最初基于酶切的RFLP標(biāo)記，到以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的RAPD技術(shù)，再到酶切和PCR結(jié)合的AFLP技術(shù)，直至目前基于基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、芯片技術(shù)的SNP等分子標(biāo)記。目前，在所有分子標(biāo)記中，RFLP、AFLP、SSR 和 RAPD 四種分子標(biāo)記使用較為普遍，被廣泛應(yīng)用于林業(yè)研究中。

基于DNA-DNA雜交的限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP）標(biāo)記是70年代末發(fā)展起來的第一代分子標(biāo)記，是最早用于遺傳多樣性分析的DNA分子標(biāo)記技術(shù)之一[8]，主要用于標(biāo)記目的基因的繪制?；赑CR擴(kuò)增的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）標(biāo)記可以由擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映基因組相應(yīng)區(qū)域的多態(tài)性，其操作簡單快速、靈敏度高、不受基因組結(jié)構(gòu)的限制且無物種特異性，具有較廣的適用范圍。繼RFLP 之后的第二代分子標(biāo)記——簡單序列重復(fù)（Simple Sequence Repeat，SSR）標(biāo)記，基于真核生物基因組中存在著的1～4個(gè)堿基對組成的簡單重復(fù)序列，其具有較豐富的多態(tài)性，在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等方面均使用廣泛，但尚未開發(fā)SSR分子標(biāo)記的物種開發(fā)時(shí)費(fèi)用較高。酶切與PCR技術(shù)相結(jié)合的AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）標(biāo)記擴(kuò)增效率高，多態(tài)性、重復(fù)性和穩(wěn)定性都較好，但其操作難度較大，不易實(shí)施。

1.2 DNA分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

由于DNA分子標(biāo)記技術(shù)具有簡便快捷、準(zhǔn)確和多態(tài)性高、不受組織類別和發(fā)育時(shí)期限制等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于林木群體遺傳研究[9， 10]。王佳媛等[11]通過SNP分子標(biāo)記技術(shù)初步研究了凹葉木蘭的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)四川南部麻咪澤和美姑大風(fēng)頂兩個(gè)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)不同居群的凹葉木蘭具有較高遺傳多樣性，為野生凹葉木蘭保護(hù)政策的制定提供了依據(jù)。歐陽磊等[12]基于杉木基因組分子標(biāo)記，利用52對SSR引物，對國家級杉木種質(zhì)資源庫保存的遺傳材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，為種質(zhì)資源的管理及提高育種效率提供了重要依據(jù)。

DNA分子標(biāo)記也常用于林木親緣關(guān)系研究和種質(zhì)資源鑒定[13]。萬愛華等[14]運(yùn)用RAPD技術(shù)，對湖北京山馬尾松無性系種子園123株優(yōu)樹針葉的分析表明各群體之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與緯度的相關(guān)性明顯，與地理距離的相關(guān)性較明顯，而與經(jīng)度的相關(guān)性不明顯，證明了以行政區(qū)劃即按省份采集優(yōu)樹建立馬尾松無性系種子園的方法是可取的。李衛(wèi)星等[15]采用ISSR分子標(biāo)記分析42個(gè)銀杏雄株的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)雄株的親緣關(guān)系與地區(qū)分布不完全相關(guān)，山東與江蘇的部分銀杏雄株試材親緣關(guān)系較近。在林木遺傳改良中，通過分子標(biāo)記技術(shù)對遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，在分子水平上闡明生物系統(tǒng)演化關(guān)系，有利于育種親本的選配和種質(zhì)資源的合理利用[16]。

分子標(biāo)記的發(fā)展促進(jìn)了林木分子遺傳圖譜的構(gòu)建。Nelson等首次利用 RAPD標(biāo)記構(gòu)建了包含68個(gè)濕地松部分連鎖群的遺傳連鎖圖[16]。目前已有桉樹、鵝掌楸、杜仲及多個(gè)松屬樹種構(gòu)建了遺傳圖譜[16-19]。林木遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建為控制林木重要經(jīng)濟(jì)性狀、抗蟲抗病、耐脅迫等基因的分子標(biāo)記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）定位奠定了基礎(chǔ)，使早期選擇成為可能。MAS在雜交親本的選配、雜種實(shí)生苗的早期鑒定選擇、遺傳轉(zhuǎn)化中目的基因的檢測、雌雄異株樹木幼苗的性別鑒定、多種抗病性狀同時(shí)篩選等方面均有應(yīng)用[20]。

2基因工程技術(shù)

基因工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心，為林木遺傳改良提供了一條新的途徑[4， 21]。將外源目的基因?qū)肽繕?biāo)植物基因組中，使其在新的遺傳背景中產(chǎn)生新的表型性狀?；蚬こ碳夹g(shù)可打破種間雜交不親和的界限，根據(jù)人們的意愿去改造林木品種的遺傳特性，創(chuàng)造出新的遺傳變異和育種資源[21]。該技術(shù)在大豆、玉米等農(nóng)作物育種中已經(jīng)得到了大量的成功應(yīng)用，但在林木中的應(yīng)用起步較晚，目前主要在楊樹、桉樹等樹種中研究較為深入，目的基因有抗蟲抗病基因、抗逆基因、材性相關(guān)基因、促進(jìn)開花的基因、生長性狀改良基因、抗環(huán)境污染基因等[4]。

2.1抗性相關(guān)基因工程

近年來，國內(nèi)外研究人員已為多種樹種進(jìn)行了抗蟲抗病、抗除草劑、抗旱、抗鹽和抗寒等方面的基因工程研究，分別獲得幾十個(gè)相關(guān)抗性的基因，并在楊屬、松屬等林木樹種中獲得了轉(zhuǎn)基因植株。如將來自水稻的半胱氨酸蛋白酶抑制因子OCI基因轉(zhuǎn)入楊樹雜種無性系NIRA353-38，提高了它們對節(jié)肢動(dòng)物及病原性害蟲的抗性[22]。歐洲櫟和歐美楊的脫水素基因QrDhn1、QrDhn2、QrDhn3、peudhn1均能夠響應(yīng)外部缺水條件，具有增強(qiáng)植物脫水耐性的功能[5]。白樺脂肪酸生物合成基因BpFAD3、BpFAD7和BpFAD8能提高白樺抗寒能力。

2.2 材質(zhì)相關(guān)基因工程

利用基因工程手段調(diào)控4CL、CAD、C3H、MYB、CCR、COMT、CCoAOMT等基因，進(jìn)而調(diào)控木質(zhì)素和纖維素的合成，降低紙漿材的木質(zhì)素含量，可提高紙漿得率，減少能耗，改善環(huán)境。MYB轉(zhuǎn)錄因子PtrMYB3、Ptr-MYB20及NAC轉(zhuǎn)錄因子PtrWND2B、PtrWND6B均被證實(shí)參與纖維素和木質(zhì)素的生物合成，參與調(diào)控木材形成[5]。

2.3生殖相關(guān)基因工程

林木生長周期長，限制了林木育種及遺傳改良進(jìn)程，通過基因工程手段可促進(jìn)林木提早開花縮短育種周期。如一般的野生型楊樹需8～20 年才能開花，而轉(zhuǎn)LFY基因的楊樹僅5個(gè)月就可開花[4]。利用基因工程手段還可以培育不育的轉(zhuǎn)基因林木新品種而有效減少轉(zhuǎn)基因花粉引起的基因逃逸，如王冬梅等對PtAP3基因正反義表達(dá)載體進(jìn)行研究，以期干擾開花使毛白楊等樹種花器官敗育而控制飛絮污染。

2.4生長性狀改良基因工程

通過基因工程技術(shù)可調(diào)節(jié)樹木內(nèi)源激素平衡、改良林木生長性狀。有研究表明，轉(zhuǎn)入rolA、B、C基因的植物，促進(jìn)根的形成和發(fā)育的同時(shí)可促進(jìn)植株地上部分的生長、發(fā)育，轉(zhuǎn)入 rolC 基因的雜種楊樹表現(xiàn)出頂端優(yōu)勢降低、節(jié)間縮短、植株矮化，這對林木種子園的管理具有重要意義。

3細(xì)胞工程技術(shù)

植物細(xì)胞具有全能性，在適宜條件下，一個(gè)植物細(xì)胞可形成一個(gè)完整的植株[23]。林木細(xì)胞工程基于全能性，對不同組織、細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞雜交等各種遺傳操作，改變細(xì)胞的遺傳基礎(chǔ)，加速個(gè)體繁殖，選育優(yōu)良品種或新品種。隨著對優(yōu)良造林苗木需求及瀕危植物保護(hù)任務(wù)的增加，細(xì)胞工程技術(shù)在林木快速繁殖、種植資源保護(hù)、新品種選育等方面也具有重要作用。目前在原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生、植株再生、人工種子、細(xì)胞雜交和體細(xì)胞突變體的篩選與利用等方面已取得了令人矚目的進(jìn)展[22]，已成功應(yīng)用于香椿、梨、蘋果等50多種經(jīng)濟(jì)林木。

3.1體細(xì)胞胚胎發(fā)生和人工種子

體細(xì)胞胚再生容易，繁殖效率高，同時(shí)后代具有較好的穩(wěn)定性，是人工種子和轉(zhuǎn)基因良好材料。馬尾松、楊樹等30多種木本植物已經(jīng)獲得了體胚。華山松、核桃、挪威云杉、杉木、雜交鵝掌楸等樹種已經(jīng)通過體胚發(fā)生獲得再生植株。近年來，南京林業(yè)大學(xué)施季森教授團(tuán)隊(duì)與多家單位合作，累計(jì)生產(chǎn)交鵝掌楸體胚苗900 多萬株，杉木優(yōu)良無性系組織培養(yǎng)和體胚培養(yǎng)苗木6000 多萬株。桑樹、云杉、桉樹等木本植物已成功利用體胚制成了人工種子。

3.2原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細(xì)胞雜交

原生質(zhì)體已成功用于體細(xì)胞雜交、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、外源基因?qū)氲?。目前，部分楊屬、松屬及北美鵝掌揪、桉樹等木本植物已利用原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得了再生植株。體細(xì)胞雜交通過細(xì)胞的融合產(chǎn)生雜種，不經(jīng)有性過程，克服了遠(yuǎn)源雜交不親和的問題，為新品種的培育提供了一個(gè)新的途徑。

4結(jié)語

近年來，生物技術(shù)已廣泛應(yīng)用于林木種質(zhì)資源和遺傳改良研究領(lǐng)域。目前，利用基因工程技術(shù)獲得了林木速生優(yōu)質(zhì)、抗蟲、抗病、抗寒、抗旱、耐鹽等新種質(zhì)；利用DNA分子標(biāo)記構(gòu)建了多種林木樹種的遺傳圖譜并定位到一些重要性狀的基因。然而，與農(nóng)作物相比，林木育種在分子生物學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用方面還較為落后，還存在許多問題有待研究，如應(yīng)注重轉(zhuǎn)基因林木的田間試驗(yàn)與穩(wěn)定性和安全性評價(jià)。雖然生物技術(shù)在林木遺傳改良的研究和實(shí)際應(yīng)用過程中還存在著一些問題[24]，但隨著相關(guān)科學(xué)理論及技術(shù)手段的不斷發(fā)展和完善，相信在不久的將來它將在林業(yè)自然資源保存、林木育種效率的提高及林木種質(zhì)創(chuàng)新等領(lǐng)域起到關(guān)鍵作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 韋大器.林木抗病基因工程研究進(jìn)展（綜述）[J].亞熱帶植物科學(xué)，2005，34（03）：74-77.

[2] 董宏強(qiáng).林木遺傳改良中的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].黑龍江科技信息，2014（06）：279.

[3] 王敏杰，盧孟柱.林木基因工程育種現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].世界林業(yè)研究，2002，15（03）：7-13.

[4] 陳英，何秋伶，諸葛強(qiáng)，等.林木基因工程研究進(jìn)展[J].分子植物育種，2006，4（01）：1-7.

[5] 李少鋒，蘇曉華，張冰玉.林木基因克隆研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào)，2011，46（01）：79-107.

[6] 張宏亮.低溫脅迫下西葫蘆轉(zhuǎn)錄組分析與SSR分子標(biāo)記開發(fā)[D].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[7] 梁機(jī).分子標(biāo)記技術(shù)及其在林木遺傳改良研究中的應(yīng)用[J].廣西林業(yè)科學(xué)，2001（S1）：1-6.

[8] 王海濱.大豆主要農(nóng)藝性狀QTL定位及分子標(biāo)記輔助選擇研究[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[9] Chung M Y， Lopez-Pujol J， Chung M G. Low genetic diversity in marginal populations of Bletilla striata （Orchidaceae） in southern Korea： Insights into population history and implications for conservation[J]. Biochem Syst Ecol. 2013（46）：88-96.

[10] Dias E F， Sardos J， Silva L， et al. Microsatellite markers unravel the population genetic structure of the Azorean Leontodon： implications in conservation[J]. Plant Systematics and Evolution. 2014， 300（05）： 987-1001.

[11] 王佳媛，吳傳芳，唐亞.基于SNP分子標(biāo)記的凹葉木蘭遺傳多樣性初步研究[J].廣西植物，2012，32（04）：542-547.

[12] 歐陽磊，陳金慧，鄭仁華，等.杉木育種群體SSR分子標(biāo)記遺傳多樣性分析[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）.2014，

38（01）：21-26.

[13] 蘭彥平，顧萬春.生物分子標(biāo)記在林木種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用[J].世界林業(yè)研究，2003，16（02）：12-15.

[14] 萬愛華，徐有明，管蘭華，等.馬尾松種子園無性系遺傳結(jié)構(gòu)的地理變異[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，34（04）：12-14.

[15] 李衛(wèi)星，花艷敏，張秀萍，等.銀杏雄株ISSR分子標(biāo)記及親緣關(guān)系分析[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版）， 2015，36（01）：101-106.

[16] 李義良，趙奮成，張應(yīng)中，等.分子標(biāo)記在松樹遺傳與進(jìn)化研究中的應(yīng)用[J].分子植物育種，2009，70（5）：1004-1009.

[17] 陳考科，黃少偉.桉樹的分子標(biāo)記技術(shù)及遺傳圖譜構(gòu)建進(jìn)展[J].分子植物育種，2005（02）：255-260.

[18] 楊建.鵝掌楸分子標(biāo)記遺傳圖譜構(gòu)建[D].南京林業(yè)大學(xué)，2009.

[19] 李煜.杜仲高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建與重要數(shù)量性狀的分子標(biāo)記[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2015.

[20] 楊玉玲，馬祥慶，張木清.ISSR分子標(biāo)記及其在樹木遺傳育種研究中的應(yīng)用[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2006，2（01）：18-24.

[21] 陳罡，張素清，馬冬菁，等.現(xiàn)代生物技術(shù)在遼寧林業(yè)研究中的應(yīng)用前景[J].遼寧林業(yè)科技，2014（03）：61-63.

[22] 曾燕如，方偉.林木生物技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，20（02）：209-214.

[23] 馬和平，臧建成，李毅，等.生物技術(shù)在林木育種中的應(yīng)用[J].河北林果研究，2005，20（04）：343-346，365.

[24] 張志毅，林善枝，張德強(qiáng)，等.現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在林木遺傳改良中的應(yīng)用[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24（05）：250-

261.

作者簡介：王德源，碩士，貴州省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，助理工程師，研究方向：林業(yè)調(diào)查規(guī)劃。