鄭鴦鴦，吉薇，吉宏武,2,3,4，蘇偉明,2,3，劉書成,2,3,4

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江，524088)2 (廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江，524088)　3 (廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江，524088) 4 (水產(chǎn)品深加工廣東省普通高校重點實驗室，廣東 湛江，524088)

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大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物對凡納濱對蝦冷藏期間肌肉流變學(xué)與熱學(xué)特性的影響

鄭鴦鴦1，吉薇1，吉宏武1,2,3,4，蘇偉明1,2,3，劉書成1,2,3,4

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江，524088)2 (廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江，524088)3 (廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江，524088) 4 (水產(chǎn)品深加工廣東省普通高校重點實驗室，廣東 湛江，524088)

為了評價大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物對凡納濱對蝦冷藏期間肌肉特性的影響，以注射和未注射大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物的凡納濱對蝦分別為實驗組和空白組，利用動態(tài)流變儀和差示掃描量熱儀(differentialscanningcalorimeter,DSC)分別探究該粗提物對凡納濱對蝦在貯藏(0 ℃)期間肌肉特性的影響。動態(tài)流變儀測定結(jié)果表明，兩組凡納濱對蝦肌肉蛋白均能形成熱凝膠，凝膠開始形成溫度為47 ℃，最終形成凝膠溫度為78 ℃左右，且降溫有利于熱誘導(dǎo)凝膠的進一步加固；貯藏2、4、6天時，注射組的彈性模量G’值總體上大于空白組，凝膠彈性比空白組好。DSC結(jié)果顯示，貯藏0、2天時兩組凡納濱對蝦主要有3個熱吸收峰，對應(yīng)變性溫度大約為48、68、79 ℃，隨貯藏時間延長在53℃左右出現(xiàn)了1個新的熱吸收峰；不過，注射組4個熱吸收峰的變性溫度總體上大于空白組，且2、4天的變性溫度差異顯著(P< 0.05)，蝦肉蛋白的熱穩(wěn)定性得到了提高。因此大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物在凡納濱對蝦貯藏前期(< 6天)能提高熱凝膠的彈性和蛋白的熱穩(wěn)定性，起到了延緩蝦肉軟化和蛋白變性的作用。

大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物；凡納濱對蝦；動態(tài)流變學(xué)；彈性模量；差示掃描量熱法；變性溫度

凡納濱對蝦是我國主要的對蝦品種，深受消費者的歡迎，目前主要以鮮銷和冷鏈的方式進行銷售。但是運輸銷售過程中凡納濱對蝦死后極易發(fā)生組織軟化、肌肉自溶，這大大降低了其市場價格，縮短了貯藏時間。研究發(fā)現(xiàn)來源于蝦頭中肝胰臟的內(nèi)源蛋白酶—類胰蛋白酶的擴散是貯藏期間肌肉組織軟化、品質(zhì)下降的主要原因[1]。因此如何抑制蝦頭中類胰蛋白酶的活性從而延緩組織軟化、肌肉自溶是凡納濱對蝦保鮮技術(shù)亟待解決的重大問題。目前，國內(nèi)外常用的水產(chǎn)品保鮮技術(shù)主要有低溫保鮮、化學(xué)保鮮、氣調(diào)保鮮、輻照保鮮和生物保鮮等。在這些保鮮方法中, 以低溫保鮮和化學(xué)保鮮應(yīng)用最為廣泛。但是低溫保鮮會使蝦肉蛋白變性給解凍后蝦的外觀和口感帶來不良影響，而化學(xué)保鮮的安全性越來越引起人們的擔(dān)憂，所以生物保鮮技術(shù)就這樣逐漸進入人們視野。生物保鮮劑在水產(chǎn)品中的保鮮機理可以籠統(tǒng)概括：殺菌作用、抗氧化作用、抑制酶活作用、成膜作用[2]。常用的生物保鮮劑一般來源于動植物、微生物，其中茶多酚、溶菌酶、殼聚糖、乳酸鏈球菌素與葡萄糖氧化酶等生物保鮮劑在水產(chǎn)品保鮮中應(yīng)用較廣泛[3]。但仍然存在一些問題，如生物保鮮劑成本較高、植物提取率低、提取物中含有多種不明成分、提取過程困難、推廣應(yīng)用性差等。其中，植物源生物保鮮劑因其從植物中天然提取，具有來源廣，成本低，安全無毒，應(yīng)用前景良好等優(yōu)點[4]。豆科、禾本科和茄科類植物種子富含蛋白酶抑制劑[5]。SRIKET和BENJAKUL等[6]通過抑制活性測定、凝膠電泳研究發(fā)現(xiàn)大豆、花生、紅豆和赤豆中的胰蛋白酶抑制劑提取物均能抑制羅氏沼蝦中的類胰蛋白酶，其中大豆中抑制劑含量最高。這些文獻(xiàn)表明大豆提取物富含胰蛋白酶抑制劑，對對蝦具有保鮮作用，但是目前國內(nèi)外關(guān)于大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物對對蝦肌肉特性的影響仍鮮有報道。

凝膠化是蝦糜加工中的重要環(huán)節(jié)，直接關(guān)系到蝦糜制品的品質(zhì)，而熱特性又直接關(guān)系到對蝦的熱加工處理環(huán)節(jié)。為此，本文以凡納濱對蝦為原料，采用動態(tài)流變儀和差示掃描量熱儀(differentialscanningcalorimeter,DSC)探究大豆胰蛋白酶抑制劑物粗提物對凡納濱對蝦肌肉流變學(xué)和熱學(xué)特性的影響，從而為開發(fā)凡納濱對蝦生物保鮮技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

凡納濱對蝦 ( Litopenaeus vannamei)，30～35只/kg,購于廣東省湛江市霞山區(qū)水產(chǎn)批發(fā)市場，保活運送至廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室；大豆(Glycine max)安徽燕之坊食品有限公司；Lowry法試劑盒 上海荔達(dá)生物技術(shù)有限公司；BAPNASigma公司；DMSOAmresco公司；正己烷、氯化鈉，湛江市林達(dá)科技有限公司，均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

HAAKEMARSⅢ流變儀,美國ThermoFisherScientific公司；TAQ2000差示掃描量熱儀(DSC),美國TA公司；KK22F57TI型冰箱,西門子有限公司；AvantiJ-26XP型冷凍離心機,Beckman公司；T25 型勻漿機,德國IKA公司；HHS21-8-S水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3實驗方法

1．3.1大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物的提取

根據(jù)BENJAKUL和VISESSANGUAN[7]方法并稍作修改制備大豆粗提物。大豆粉碎過篩至20目，倒入5倍的正己烷(w/v)，攪拌10min后抽濾，再把抽濾后的濾渣用3倍的正己烷(w/v)進行3次同樣操作以去掉殘余脂肪。脫脂的大豆粉置于通風(fēng)廚里風(fēng)干，直至正己烷完全揮發(fā)。用0.15mol/LNaCl溶液混合大豆粉，室溫下磁力攪拌3h后以6 500g離心30min去除殘渣，上清液在90 ℃熱變性處理10min后用冰水冷卻，再以 8 000g離心10min，上清液透析后冷凍干燥，置于-20 ℃保存。

1.3.2樣品預(yù)處理

用蒸餾水將鮮活的凡納濱對蝦清洗后立即冰猝致死。將蝦分成空白組和實驗組，在實驗組對蝦頭部肝胰臟的中下部位注射5mg/mL的大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物300μL，空白組對蝦注射等量蒸餾水。置于0 ℃冰箱中貯藏，取樣時間依次為0、2、4、6、8、10天。

1.3.3 動態(tài)流變學(xué)測定

將已到取樣時間的凡納濱對蝦去頭、殼和腸線，切碎后用勻漿機把蝦肉絞碎。用干凈的鑰匙將樣品均勻涂布于測試臺。流變儀設(shè)定條件參考LIU[8]并做稍微改動：轉(zhuǎn)子型號P35TiL，振蕩模式(Osc)，頻率為0.1Hz，應(yīng)變?yōu)?%，平行板間距為1mm；溫度范圍10 ～100 ℃,升溫速率為2 ℃/min，在100 ℃恒溫20min后再以相同速率降溫至10 ℃。加樣后滴加石蠟油防止水分蒸發(fā)。

1.3.4熱特性分析

差示掃描量熱法采用美國TAQ2000的差示掃描量熱儀。將已到取樣時間的凡納濱對蝦去頭、殼和腸線，切取第二腹節(jié)的蝦肉放在氧化鋁坩堝中進行稱量、加蓋密封，以空坩堝為參比。測試參數(shù)為：溫度范圍10～100 ℃，升溫速率以 5 ℃/min，樣品室氮氣流量為50mL/min。通過TA軟件分析變性溫度，每個樣品至少測試2次以確保再現(xiàn)性。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用Origin8.0和SPSS22軟件進行分析和繪圖。組間比較采用t檢驗，P< 0.05為差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1蝦肉動態(tài)流變學(xué)特性

肌原纖維蛋白是肌肉中的主要蛋白,也是形成彈性凝膠的主要成分，而肌球蛋白又是肌原纖維蛋白中形成熱誘導(dǎo)凝膠的最主要蛋白質(zhì),單獨條件下可形成好的凝膠。其的肌原纖維蛋白質(zhì)如肌動蛋白、調(diào)節(jié)蛋白和細(xì)胞骨骼蛋白不能形成凝膠,但是對肌球蛋白形成凝膠的粘彈性具有重要的影響[9]。LIU、XIONG和FRETHEIM等在研究不同種類牛肉、雞肉和豬肉的黏彈性時發(fā)現(xiàn)，加熱過程中G’值隨溫度上升呈現(xiàn)波浪狀，增加、下降、再上升，溫度為85 ℃時凝膠強度最強[10]。這3個過程可以劃分為凝膠預(yù)備區(qū)、凝膠弱化區(qū)和凝膠加強區(qū)，這種現(xiàn)象也同樣存在于魚類等其他蛋白凝膠中，這是肌原纖維蛋白和肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠典型的流變學(xué)轉(zhuǎn)變過程。

在溫度掃描中，隨著溫度的上升蝦肉蛋白發(fā)生了向凝膠態(tài)的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致蛋白的流變特性也發(fā)生了相應(yīng)的改變。由圖1可以看出，空白組和注射組凡納濱對蝦肌肉蛋白均能形成熱凝膠，凝膠開始形成溫度為47 ℃，最終形成凝膠溫度為78 ℃左右，且降溫有利于熱誘導(dǎo)凝膠的進一步加固；在整個溫度范圍內(nèi)，兩組肌肉蛋白的彈性模量G’都隨貯藏時間逐漸降低，且升溫時流變學(xué)曲線出現(xiàn)4個拐點溫度(InflectionPoints,IP)，依次在47、55、62和78 ℃左右。G’的變化可分成大致3個區(qū)域，55 ℃之前G’增加(凝膠預(yù)備期)，55～62 ℃下降(凝膠弱化區(qū))，62～78 ℃再上升(凝膠強化區(qū))，G’總的變化趨勢符合肌原纖維蛋白典型的流變轉(zhuǎn)變過程。凝膠從47 ℃開始形成，然后G’從47 ℃快速上升直到55 ℃，彈性模量到達(dá)第一個峰值，彈性模量快速增加可能是由于肌球蛋白分子頭部的重酶解肌球蛋白或其亞基變性，纖絲之間不可逆的相互作用增強，凝膠強度增加[11]。隨后G’快速下降直到62 ℃，然后又一直呈上升至78 ℃第2次達(dá)到峰值。55～62 ℃范圍G’下降，很可能是因為肌球蛋白中的輕酶解肌球蛋白變性，導(dǎo)致纖絲之間形成強度不大的黏性膠，因此流動性增加而彈性減小[12-13]。62～78 ℃范圍G’再次上升，表明蛋白變性最后階段完成，巰基含量急速下降，共價結(jié)合的二硫化合物和疏水相互作用形成了不可逆的三維凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[14]。最后在降溫過程中G’呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢，說明降溫有利于熱誘導(dǎo)凝膠的進一步加固，主要是因為冷卻有利于氫鍵的形成。鯉魚、金槍魚[15]G’值的總體變化趨勢也呈現(xiàn)波浪狀，李艷青研究發(fā)現(xiàn)鯉魚[16]蛋白在加熱到 46 ℃時G’達(dá)到一個最大值，接著從 46～54 ℃，G’急劇下降，直到 80 ℃趨于穩(wěn)定。不同來源的肌球蛋白其變性時的轉(zhuǎn)變溫度不同，從豬肉、雞肉、牛肉和火雞中提取的肌球蛋白，其轉(zhuǎn)變溫度一般在45～55 ℃，魚類略低[17]。雖然不同原料肉的G’突變點所對應(yīng)的溫度存在差異，但是G’總的變化趨勢仍符合肌原纖維蛋白的典型流變學(xué)特性。

a-空白組；b-注射組圖1　貯藏過程中兩組凡納濱對蝦的流變學(xué)特性變化Fig.1　Changes of rheological properties of Litopeneaus vannamei during storage

a-2天；b-4天；c-6天；d-8天；e-10天圖2　貯藏過程中兩組凡納濱對蝦的G’值變化Fig.2　Changes of G’ value of two groups of Litopeneaus vannamei during storage

由圖2可知，對比相同貯藏時間下2個處理組蝦肉蛋白G’值的總體趨勢可以發(fā)現(xiàn)，貯藏2、4、6天時注射組G’值總體上大于空白組，說明注射組蝦肉最終形成的凝膠彈性比空白組好，從而揭示了大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物發(fā)揮了效用，在一定程度了抑制了蝦頭中的類胰蛋白酶、延緩了蝦肉的軟化。但是在貯藏2天時，注射組在78 ℃左右最終形成凝膠和降溫過程中G’值卻開始低于空白組，可能是因為貯藏時間短導(dǎo)致大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物發(fā)揮作用慢，也可能是其他因素造成，這仍需要進一步的研究。貯藏8、10天時，兩組G’值的總體趨勢相似，注射組G’值低于空白組。這是因為貯藏后期微生物作用加強，占據(jù)主導(dǎo)作用，李蕾蕾等[18]在研究南美白對蝦菌相變化時也發(fā)現(xiàn)冰溫貯藏(-0.8 ℃)2、4、6天時菌落總數(shù)保持穩(wěn)定，而6天以后菌落總數(shù)迅速上升。

2.2蝦肉熱學(xué)特性

圖3揭示了肌肉熱轉(zhuǎn)變的3個主要轉(zhuǎn)變區(qū)，A、B和C區(qū)。第1個熱轉(zhuǎn)變A在40～60 ℃有最大熱吸收峰，已經(jīng)證實是肌球蛋白引起；第2個熱轉(zhuǎn)變B發(fā)生在60～70 ℃，由膠原蛋白和肌漿蛋白引起；第3個熱轉(zhuǎn)變是肌動蛋白的熱吸收，在80 ℃之間[19-22]。SIMS和BAILEY也研究指出肌球蛋白的整個變性過程在40～60 ℃之間，它是肌肉中3種主要結(jié)構(gòu)蛋白中最不穩(wěn)定的蛋白[23]。

A-肌球蛋白亞基；B-肌漿蛋白和膠原蛋白；C-肌動蛋白圖3　一個典型的肌肉熱曲線圖[24]Fig.3　A typical thermal curve of muscle is composed of three major zones

從圖4的DSC圖可以看出，未經(jīng)處理的空白組凡納濱對蝦主要有3個熱吸收峰，這與圖3揭示的肌肉熱轉(zhuǎn)變的3個主要轉(zhuǎn)變區(qū)是相符的。表1列舉了兩組對蝦的熱變性溫度，貯藏0、2天時，兩組凡納濱對蝦蝦肉均有3個熱吸收峰，對應(yīng)變性溫度在48、68、79 ℃左右，依次對應(yīng)圖4-a中的峰1、峰2和峰3，而隨著貯藏時間延長,從第4天開始在53 ℃左右增加了1個新的熱吸收峰(峰4)，見圖4-b，這主要是肌球蛋白的逐漸降解引起的。這是因為肌球蛋白含有多個亞基，其球形頭部和螺旋尾部的分子結(jié)構(gòu)十分不同，所以肌球蛋白顯示一個或多個熱轉(zhuǎn)變過程。而且肌球蛋白亞基會隨環(huán)境變化而變化，其中pH和離子強度對其亞基構(gòu)象的穩(wěn)定性具有重要作用[25]。根據(jù)圖3最后可以推測出表1中的峰1、峰4是肌球蛋白的熱吸收峰，峰2是膠原蛋白和肌漿蛋白的熱吸收峰，峰3是肌動蛋白的熱吸收峰。

表1　兩組凡納濱對蝦蝦肉蛋白的熱變性溫度　單位：℃

由表1可以看出，在相同貯藏時間下，注射組凡納濱對蝦的4個熱吸收峰的變性溫度總體上大于空白組的變性溫度。由此可以說明注射組的凡納濱對蝦的蛋白穩(wěn)定性總體上比空白組要高，注射大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物有助于提升蝦肉蛋白的穩(wěn)定性。另外，對同一貯藏時間下兩個處理組對蝦的變性溫度依次進行配對樣本T檢驗，置信區(qū)間的百分比設(shè)為95%。配對檢驗結(jié)果表明，貯藏2、4、6、8、10天的差異顯著性水平分別為0.038、0.04、0.358、0.178、0.881，其中貯藏2、4天時差異顯著(P<0.05),說明在貯藏前期(2、4天)注射大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物對凡納濱對蝦的熱特性有顯著影響，能提高蝦肉蛋白的熱穩(wěn)定性。而在貯藏后期由于其他因素如微生物等的影響，該粗提物不再發(fā)揮顯著性作用。

3　結(jié)論

大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物能夠影響凡納濱對蝦冷藏前期(< 6天)的流變學(xué)和熱學(xué)特性。該粗物能不僅能提高蝦肉的彈性模量G’值，增加肌肉彈性，而且能提高蝦肉的熱變性溫度，提升肌肉的熱穩(wěn)定性。因此，大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物可以抑制凡納濱對蝦冷藏期間肌肉的軟化，從而延長其貨架期，在凡納濱對蝦保鮮方面具有應(yīng)用前景。

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EffectofcrudeextractsoftrypsininhibitorfromsoybeanontherheologicalandthermalpropertiesofLitopeneaus vannameimuscleduringcoldstorage

ZHENGYang-yang1,JIWei1,JIHong-wu1,2,3,4*,SUWei-ming1,2,3,LIUShu-cheng1,2,3,4

1 (CollegeofFoodScienceandTechnology,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang524088,China)2(GuangdongProvincialKeyLaboratoryofAquaticProductsProcessingandSafety,Zhanjiang524088,China)3 (GuangdongEngineeringResearchCenterofSeafood,Zhanjiang524088,China)4(KeyLaboratoryofAdvancedProcessingofAquaticProductsofGuangdongHigherEducationInstitution,Zhanjiang524088,China)

InordertoevaluatetheeffectofcrudeextractsoftrypsininhibitorfromsoybeanonthemusclepropertiesofLitopeneaus vannameiduringstorage(0 ℃) ,thedynamicrheometeranddifferentialscanningcalorimeterwereusedtoinvestigatethedifferencebetweentheexperimentalgroupinjectedwithcrudeextractsandtheblank.Dynamicrheologyresearchshowedthattwogroupsofshrimpcouldbeabletoformthermalgel.Theformationofthegelbeganatabout47 ℃andbetternetworkoccurredathightemperature(about78 ℃).Thegelwasfurtherreinforcedthroughcooling.Elasticmodulus(G’)ofinjectinggroupwashigherthanthatoftheblankonDay2, 4, 6duringstorage.Thegelelasticityofinjectinggroupwasbetter.DSCresultsrevealedthatonday0andday2ofstorage,twogroupsofshrimphad3endothermicpeaksandthedenaturationtemperaturewereabout48 ℃, 68 ℃,79 ℃,respectively.Anewendothermicpeakatabout53 ℃appearedwiththetimeextension.However,thedenaturationtemperatureof4endothermicpeaksofinjectinggroupwashigherthanthatoftheblankgroupasawhole.ThecrudeextractsoftrypsininhibitorhadremarkableeffectonthedenaturationtemperatureonDay2andDay4ofstorage(P<0.05).Therefore,thecrudeextractsoftrypsininhibitorfromsoybeancouldimprovetheelasticityofthethermalgelandproteinstabilityduringtheearlystageofthestorage(< 6days),thusresultindelayofsofteninganddegenerationofLitopeneaus vannamei.

crudeextractoftrypsininhibitorfromsoybean; Litopeneaus vannamei;dynamicrheology;elasticmodulus;differentialscanningcalorimeter;denaturationtemperature

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608038

碩士研究生(吉宏武教授為通訊作者，E-mail：jihw62318@163.com)。

中國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-47)；廣東省產(chǎn)學(xué)研合作項目(2013B090600155)；廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強校項目(GDOU2014050203，GDOU2013050314)

2015-11-05，改回日期：2015-12-16