張奇，姜增妍，張露，馬玉岳，徐友強(qiáng)，裴疆森，程池*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)　2(山東省富馬酸生物轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，山東 煙臺(tái)，265709)

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“一鍋法”生物轉(zhuǎn)化富馬酸制備L-天冬酰胺

張奇1，姜增妍2，張露1，馬玉岳2，徐友強(qiáng)1，裴疆森1，程池1*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)2(山東省富馬酸生物轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，山東 煙臺(tái)，265709)

L-天冬酰胺廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工合成和微生物培養(yǎng)等領(lǐng)域。目前工業(yè)上主要依靠化學(xué)合成和直接提取方法制備。該研究首次采用雙酶催化富馬酸“一鍋法”制備L-天冬酰胺。克隆來源于大腸埃希氏菌JM109的天冬酰胺合成酶A基因asnA，并于產(chǎn)L-天冬氨酸酶的E.coliCICC 11022S中表達(dá)，表達(dá)的蛋白分子質(zhì)量約為37 kDa，與預(yù)期大小相符，比酶活力為1443.7 U/g。利用構(gòu)建的工程菌E.coliCICC 11022S/pET28a(+)-asnA全細(xì)胞高密度催化富馬酸生產(chǎn)L-天冬酰胺，以高效液相色譜法及PITC柱前衍生-高效液相法檢測底物、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化10 h，富馬酸轉(zhuǎn)化率為94.7%，L-天冬酰胺產(chǎn)量可達(dá)125.1g/L，生產(chǎn)速率為12.51 g/(L·h)。

一鍋法；富馬酸；天冬酰胺合成酶；L-天冬酰胺；生物轉(zhuǎn)化

L-天冬酰胺(L-asparagine，L-Asn)，又名天門冬酰胺、天門冬素、α-氨基丁二酸一酰胺，于1806年首次被法國化學(xué)家LOUIS和PIERRE從蘆筍汁中分離，隨后陸續(xù)在各種動(dòng)植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工合成和微生物培養(yǎng)等領(lǐng)域[1]。

L-天冬酰胺與糖能進(jìn)行氨基-羰基反應(yīng)，形成特殊的香味物質(zhì)，可作為食品添加劑用于清涼飲料；同時(shí)，它也是微生物培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)重要的添加劑[2]。L-天冬酰胺常用于氨基酸輸液及降壓、平喘、抗消化性潰瘍和胃功能障礙等，并可用于治療心肌梗死、心肌代謝障礙、心力衰竭、心臟傳導(dǎo)阻滯和疲勞癥等。它對(duì)于大腦的發(fā)育和其功能是必需的。此外，它能通過解除高谷氨酰胺抑制引發(fā)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)腫瘤的治療[3]。在寡糖轉(zhuǎn)移酶的作用下，L-天冬酰胺能夠與N-乙酰氨基葡糖在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)結(jié)合，對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定與功能的發(fā)揮至關(guān)重要，是蛋白質(zhì)糖基化的重要形式[4-6]。

目前，L-天冬酰胺的制備主要采用提取法和化學(xué)合成法。提取法是通過從富含L-天冬酰胺的天然材料如白羽扇豆、草木樨等中分離[7]。該方法受原材料質(zhì)量因素影響大，工藝復(fù)雜不易控制，且污染嚴(yán)重。化學(xué)合成法主要通過L-天冬氨酸與氨水進(jìn)行酰胺化制得[8]。該方法存在污染大、副反應(yīng)多等缺陷。

通過天冬酰胺合成酶催化銨離子或谷氨酰胺的氨基進(jìn)行轉(zhuǎn)移的生物合成過程為耗能過程，需要大量ATP參與(圖1)[9-11]，由此使生產(chǎn)成本大幅提升，限制了應(yīng)用，因此國內(nèi)外鮮有報(bào)道，但該過程反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)效率高、副產(chǎn)物少，同時(shí)對(duì)設(shè)備的要求低、投資小、生產(chǎn)過程簡單，易于操控，仍具有一定的開發(fā)前景。本課題組前期構(gòu)建了1株高產(chǎn)天冬酰胺合成酶的菌株大腸埃希氏菌CICC 11034S (EscherichiacoliCICC 11034S)，采用活細(xì)胞自身糖酵解系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-天冬酰胺，有效解決了ATP成本過高的難題[12]。

圖1　L-天冬酰胺生物合成Fig.1　Biosynthesis of L-asparagine

“一鍋法”源于化學(xué)合成，指兩步或兩步以上的化學(xué)反應(yīng)在一個(gè)反應(yīng)體系中一次合成目的產(chǎn)物，具備操作簡單、省時(shí)省力、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。隨著酶工程技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在一些特定目的產(chǎn)物的酶法合成中也引入了相應(yīng)的方法，即在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)加入多種酶，同步催化反應(yīng)以獲得目的產(chǎn)物[13]。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上利用分子生物學(xué)手段，將大腸埃希氏菌JM109的天冬酰胺合成酶A基因(Asparagine Synthetase A gene,asnA)擴(kuò)增并轉(zhuǎn)化至高產(chǎn)天冬氨酸酶的E.coliCICC 11022S中，構(gòu)建工程菌E.coliCICC 11033S，誘導(dǎo)表達(dá)后，利用菌體自身糖酵解功能合成的ATP，進(jìn)行全細(xì)胞催化，實(shí)現(xiàn)從富馬酸向L-天冬酰胺的雙酶催化“一鍋法”生物合成，有效節(jié)省生產(chǎn)時(shí)間，并解決了L-天冬酰胺生產(chǎn)過程中消耗ATP的高成本問題。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

E.coliJM109、E.coliCICC11022S、pET28a(+)為實(shí)驗(yàn)室保藏；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside, IPTG)、硫酸卡那霉素(Kanamycin Monosulfate,Kan)、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、分子生物學(xué)試劑盒購于天根(北京)；異硫氰酸苯酯(Phenyl isothiocyanate, PITC)、ATP購于生工(上海)；培養(yǎng)基購于陸橋(北京)；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純。

1.2asnA基因克隆及工程菌構(gòu)建

采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取E.coliJM109基因組DNA，以此為模板，以AsnAU(5’-GCC GAA TTC ATG AAA ACC GCT TAC-3’，攜帶EcoRI酶切位點(diǎn))和AsnAD(5’-GTT AAG CTT TTA CAG CAG AGA AGG GAC-3’，攜帶HindIII酶切位點(diǎn))為引物PCR擴(kuò)增asnA，經(jīng)EcoRI和HindIII酶切后連接至相同酶切后的pET28a(+)，轉(zhuǎn)化至具備表達(dá)天冬氨酸酶能力的E.coliCICC11022S，隨后篩選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR及酶切鑒定，選取陽性克隆測序分析。

1.3ASNA表達(dá)及分析

將構(gòu)建的基因工程菌于LB/Kan(含50 μg/mLKan的LB培養(yǎng)基)中37 ℃，200 r/min，過夜培養(yǎng)后，1%轉(zhuǎn)接LB/Kan培養(yǎng)液3 h后加入終濃度0.1 mmol/L IPTG 25 ℃，160 r/min，誘導(dǎo)6 h，收集菌體，超聲破碎后離心收集上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

酶活力定義：在200 mmol/LL-天冬氨酸、10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L NH4Cl、10 mmol/L ATP、100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、菌體濕重20 mg/mL體系下，37 ℃催化反應(yīng)30 min，以1 min催化L-天冬氨酸產(chǎn)生1 μmolL-天冬酰胺所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。

1.4高效液相分析

底物富馬酸采用高效液相色譜(HPLC)檢測，色譜條件為：色譜柱，GRACE Prevail Organic Acid(25 mm× 4.6 mm)；流動(dòng)相，A∶B=95∶5(A：10 mmol/L KH2PO4(pH2.3)；B：甲醇)；檢測器，VWD-3000RS；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；進(jìn)樣質(zhì)量濃度：5、10、20、50、100 mg/L。中間產(chǎn)物L(fēng)-天冬氨酸及終產(chǎn)物L(fēng)-天冬酰胺采用PITC柱前衍生-高效液相方法檢測[12]。

A：富馬酸色譜圖；B：富馬酸定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2　底物富馬酸HPLC分析Fig.2　Analysis of fumaric acid by HPLC

富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg/L)的色譜圖如圖2A所示，根據(jù)不同濃度富馬酸的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2B)，回歸曲線方程為：Y=0.399 2X+0.009 7。以全細(xì)胞為酶原催化富馬酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-天冬酰胺，每1 h取樣1次，以HPLC法測定富馬酸，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算富馬酸含量。

1.5全細(xì)胞催化

配制全細(xì)胞催化反應(yīng)體系，將1 mol富馬酸加入800 mL水中，隨后以氨水調(diào)pH至8.0，使其充分溶解，隨后加入終濃度為20 mmol/L葡萄糖和2 mmol/L氯化鎂；離心發(fā)酵液，收集菌體，無菌水清洗后，將菌體加入轉(zhuǎn)化體系中，使菌體終濃度OD600 nm=12；最后將反應(yīng)液體積定容至1 L，此時(shí)富馬酸濃度為1 mol/L。37 ℃、50 r/min催化反應(yīng)14 h，每1 h取樣，以色譜法檢測底物富馬酸、中間產(chǎn)物L(fēng)-天冬氨酸和終產(chǎn)物L(fēng)-天冬酰胺。

2　結(jié)果與分析

2.1工程菌株構(gòu)建

以E.coliJM109基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后通過限制性內(nèi)切酶酶切、回收并連接，轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliCICC11022S中，篩選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR和酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示，經(jīng)PCR擴(kuò)增，可于1 000 bp處觀察到明顯的條帶；篩選轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行PCR和酶切鑒定，于1 000 bp處可見明顯的目的基因PCR擴(kuò)增條帶和酶切條帶，表明已成功構(gòu)建含目的基因asnA的基因工程菌株，命名為E.coliCICC11022S/pET28a(+)-asnA，并于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心保藏，保藏號(hào)：CICC 11033S。

M-DNA Marker；1-PCR產(chǎn)物；2-PCR鑒定；3-酶切鑒定圖3　asnA基因克隆及轉(zhuǎn)化子鑒定Fig.3　Amplification and identification of asnA gene

2.2天冬酰胺合成酶A表達(dá)及酶活力分析

將誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌裂解液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4所示，與含pET28a(+)空載體的對(duì)照菌株E.coliCICC 11022S/pET28a(+)相比，E.coliCICC11022S/pET28a(+)-asnA裂解上清液與沉淀中均在約37 kDa處可見蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)期大小36.6 kDa相符，其表達(dá)后存在形式包括可溶性蛋白和包涵體兩種。

以菌體細(xì)胞為酶原按酶活力定義所述方法測定表達(dá)的天冬酰胺合成酶A的酶活力，其比酶活力為1 443.7 U/g。

M-Marker；1-E. coli CICC11022S/pET28a(+)-asnA裂解上清液； 2-E. coli CICC11022S/pET28a(+)裂解上清液；3-E. coli CICC11022S/pET28a(+)-asnA裂解沉淀圖4　SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of ASNA expression

2.3轉(zhuǎn)化過程監(jiān)測

以PITC-HPLC法測定L-天冬氨酸和L-天冬酰胺，根據(jù)[12]報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)體系中L-天冬氨酸和L-天冬酰胺濃度，繪制過程曲線，結(jié)果如圖5所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，富馬酸濃度逐漸降低；于此同時(shí)，L-天冬氨酸含量逐步提升，在4 h時(shí)，反應(yīng)體系中L-天冬氨酸含量達(dá)最高，積累濃度達(dá)70 g/L以上，隨后逐漸下降；反應(yīng)體系中L-天冬酰胺的含量隨著時(shí)間的延長持續(xù)上升，10 h時(shí)，L-天冬酰胺含量達(dá)高點(diǎn)，產(chǎn)量為125.1 g/L，綜合生產(chǎn)速率為12.51 g/(L·h) ，此時(shí)富馬酸的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)94.7%。

圖5　轉(zhuǎn)化過程中底物與產(chǎn)物含量分析Fig.5　Analysis of substrate and product

3　討　論

天冬酰胺合成酶的結(jié)構(gòu)包含催化活性區(qū)域和結(jié)合區(qū)域，即具有兩個(gè)反平行β-折疊的負(fù)責(zé)水解谷氨酰胺的活性部位的N-末端和負(fù)責(zé)結(jié)合Mg2+、ATP和L-天冬氨酸的C-末端兩部分。天冬酰胺合成酶可分為天冬酰胺合成酶A和天冬酰胺合成酶B，前者只可以利用銨離子進(jìn)行L-天冬氨酸的酰胺化，后者的氨基既可來源于谷氨酰胺，也可以來源于銨離子。天冬酰胺合成酶A主要存在于微生物中，目前科研人員已經(jīng)克隆并表達(dá)了多種微生物來源的天冬酰胺合成酶A基因[11]。本研究以E.coliJM109的基因組DNA為模板，成功克隆了asnA基因，與已知序列同源性為99.9%，僅一個(gè)堿基差異；蛋白序列同源性為100%。本研究構(gòu)建的ASNA表達(dá)體系，能夠成功表達(dá)可溶性蛋白，由于目的蛋白大部分為可溶解狀態(tài)，盡管有部分蛋白質(zhì)以包涵體存在于菌體裂解沉淀中，但不影響整個(gè)催化體系。

盡管天冬酰胺合成酶能催化L-天冬氨酸合成L-天冬酰胺，但由于其轉(zhuǎn)化過程中需要ATP的參與，導(dǎo)致成本過高，因此采用該酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-天冬酰胺鮮有報(bào)道，而L-天冬酰胺生產(chǎn)技術(shù)也一直停留在化學(xué)合成法和直接提取法[1, 7-8]。本課題組前期報(bào)道了采用活細(xì)胞催化方式為從L-天冬氨酸到L-天冬酰胺轉(zhuǎn)化提供所需ATP的關(guān)鍵技術(shù)[12]。本研究對(duì)前期工作進(jìn)一步延伸，采用單菌雙酶 “一鍋法”催化，從底物富馬酸直接轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-天冬酰胺，在簡化工藝、節(jié)省時(shí)間、節(jié)約人力成本的基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低了底物成本。

本研究建立了一套“一鍋法”生產(chǎn)L-天冬酰胺的生物轉(zhuǎn)化工藝，通過克隆天冬酰胺合成酶A基因并構(gòu)建高效表達(dá)該酶的基因工程菌株，實(shí)現(xiàn)從富馬酸到L-天冬酰胺的生物酶法催化合成。以全細(xì)胞為酶原催化該反應(yīng)，以葡萄糖替代ATP，通過菌體細(xì)胞自身的葡萄糖酵解體系和三羧酸循環(huán)，實(shí)現(xiàn)ATP的合成與再生，進(jìn)而成功解決了L-天冬酰胺生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)工藝中ATP成本過高的難題。

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L-asparagine production by one-pot biotransformation method

ZHANG Qi1, JIANG Zeng-yan2, ZHANG Lu1, MA Yu-yue2,XU You-qiang1, PEI Jiang-sen1, CHENG Chi1*

1(China National Research Institute of Food & Fermentation Industries, China Center of Industrial Culture Collection, Beijing 100015, China)2(Shandong Biotransformation Engineering Research Center of Fumaric Acid, Yantai 265709, China)

L-asparagine was one of natural amino acids, which was widely used in food, medicine, chemical synthesis, microbial culture and so on, and mainly obtained by chemical synthesis or direct extraction methods. In this study, one-pot reaction was reported to synthesize L-asparagine by two kinds of enzyme. Asparagine synthetase gene A (asnA) fromEscherichiacoli(E.coli) JM109 was amplified and transformed intoE.coliCICC 11022S using molecular biological methods, and then the ASNA was expressed. The molecular weight of expressed protein was of about 37 kDa by SDS-PAGE, which was consistent with the expected size. After analyzing the ASNA activity, the enzyme activity was 1 443.7 U/g wet cell. Finally, the constructed strainsE.coliCICC 11022S/pET28a (+)-asnAwas applied on conversion from fumaric acid toL-asparagine. After catalyzing for 10 h, the substrate and product were detected by PITC column derivatization-high performance liquid. The conversion ratio of fumaric acid was 94.7%, the yield of L-asparagine was up to 125.1 g/L, and the production rate was 12.51 g/(L·h).

one-pot reaction； fumaric acid； Asparagine synthetase A；L-asparagine； biotransformation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608010

博士，副教授(程池教授級(jí)高級(jí)工程師為通訊作者，E-mail：cheng100027@163.com)。

2016-01-08，改回日期：2016-01-28