元向東

(包頭輕工職業(yè)技術(shù)學院，內(nèi)蒙古 包頭,014035)

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香菇菌絲體多糖的化學結(jié)構(gòu)與抗氧化活性分析

元向東*

(包頭輕工職業(yè)技術(shù)學院，內(nèi)蒙古 包頭,014035)

對香菇菌絲體多糖(Lentinus edodesmyceliumpolysaccharides,LMPS)的2種組分(LMPS-1和LMPS-2)進行化學結(jié)構(gòu)特征分析，旨為香菇菌絲體多糖的構(gòu)效關(guān)系研究提供依據(jù)。文中利用高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜(GC)、紅外光譜(IR)分析等對其化學結(jié)構(gòu)特征進行解析，并測定其抗氧化活性。構(gòu)成糖分析結(jié)果顯示：LMPS-1單糖組成為阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖，其摩爾比為2.5∶0.8∶1∶1.8；LMPS-2的單糖組成為鼠李糖、木糖和葡萄糖,其摩爾比為4.2∶1∶2.7。LMPS-1和LMPS-2均有較強的抗氧化活性，LMPS-2更為顯著。香菇菌絲體多糖主要由阿拉伯糖和鼠李糖組成的吡喃型多糖，有較強的抗氧化活性。

香菇；菌絲體；多糖；化學結(jié)構(gòu)；抗氧化

香菇(Lentinus edodes)又稱為花菇，屬真菌門(Eumycophyta)，側(cè)耳科(Pleurotaceae)，香菇屬(Lentinus)，是世界第二大食用菌。香菇口味鮮美，營養(yǎng)豐富，富含多糖、維生素、蛋白質(zhì)、多元酚、樸菇素、膳食纖維等多種生物活性物質(zhì)菌絲體多糖是香菇菌絲體中最重要的生物活性物質(zhì)，作為一種免疫促進劑，已引起人們廣泛的興趣。菌絲體多糖的生物學功能主要有以下幾方面：抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、保肝護肝和降血糖等作用[1-2]。有關(guān)香菇菌絲體多糖的藥理研究，特別是結(jié)構(gòu)方面的研究已引起國內(nèi)外學者的高度關(guān)注，并成為多糖領(lǐng)域的研究熱點。本研究對香菇菌絲體多糖(Lentinus edodesmyceliumPolysaccharides,LMPS)通過DEAE-52纖維素柱和G-100葡聚糖多糖進行分離純化。分別研究了LMPS-1和LMPS-2分子質(zhì)量、單糖組成、鍵型和抗氧化活性，為香菇菌絲體多糖的研究開發(fā)及利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

供試菌種：香菇(Lentinus edodes)，內(nèi)蒙古農(nóng)科院保存。

深層液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O1g，VB10.1g, 水1L，pH自然。

液體種子培養(yǎng)條件：25 ℃恒溫搖床160r/min振蕩培養(yǎng)10d。

深層液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O1g，Vb10.1g, 蛋白胨3g，酵母粉3g，水1L，pH自然。

深層液體發(fā)酵培養(yǎng)條件：100L氣升式液體深層發(fā)酵罐中培養(yǎng)14d，發(fā)酵溫度25 ℃，連續(xù)通入無菌空氣。

實驗試劑：30%H2O2，天津市凱通化學試劑有限公司；體積分數(shù)95%乙醇，天津市百世化工有限公司；DPPH，Sigma公司；DEAE-52纖維素，Sigma公司；葡聚糖G-100，Sigma公司；苯酚，天津市天大化學試劑廠；濃H2SO4，淄博化學試劑廠有限公司；濃HCl，淄博化學試劑廠有限公司；三氯乙酸,天津大茂化學試劑廠。

實驗儀器：752-N紫外可見分光光度計，上海精宏實驗設備有限公司；GC2010氣相色譜儀，日本津島公司；TDL-5-A型臺式離心機上海安亭科學儀器廠；Nicolet380傅立葉變換紅外光譜儀，美國熱電集團；Nicolet380傅立葉變換紅外光譜儀，美國熱電集團；DK-S24型恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；LXJ-68-02型離心機，北京醫(yī)療儀器修理廠；DZF-6021型真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2多糖的提取

利用水提醇沉法提取香菇菌絲體多糖。

1.3成分含量測定

總糖含量采用苯酚-硫酸法[3]測定。

1.4多糖的凝膠柱層析

首先采用DEAE-纖維素離子交換柱對多糖進行分離純化，用濃度梯度為0.2、0.5、1.0mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫速度控制在1mL/min，每個洗脫梯度收集25管，每管收集2mL，利用苯酚-硫酸法測定收集到的多糖溶液濃度，繪制洗脫曲線。然后用葡聚糖G-100凝膠柱對多糖進行進一步分離純化和純度鑒定[4]。用0.1mol/LNaCl溶液充分平衡層析柱后，用蒸餾水作為洗脫劑，洗脫速度控制在0.1mL/min，每管收集2mL，同樣利用硫酸-苯酚法對收集到的多糖溶液濃度測定，繪制洗脫曲線。

1.5多糖的分子質(zhì)量測定

采用高效凝膠滲透色譜法(HPLC)對多糖的分子質(zhì)量進行測定[5]。用高效液相色譜儀(1260,AgilentTechnologies,USA)，SHODEXSB-806HQ色譜柱column(8.0mm× 300mm)及示差折光檢測器測定。流動相為0.2mol/LNaCl溶液，進樣量為100μL，流速為0.5mL/min，柱溫保持在5 ℃。標準品及樣品質(zhì)量濃度均為2mg/mL。用葡聚糖系列樣品作為標準品，以lgMw(分子質(zhì)量對數(shù))對ET(保留時間)繪制標準曲線，得線性回歸方程：lgMw=1-0.342 9ET+11.975，R2= 0.999 1。用0.2mol/LNaCl水溶液將樣品配成濃度為2mg/mL的溶液，上柱測定其保留時間，根據(jù)回歸方程計算分子質(zhì)量。

1.6構(gòu)成糖分析

糖樣品經(jīng)過酸加熱完全水解(0.25mol/LH2SO4，100 ℃，16h)，或者不經(jīng)過水解處理，按照BLAKENEY[6]等制備成各單糖的全乙?；谴佳苌?，然后進行氣相色譜(GC)分析(島津GC-14C，柱溫210 ℃，N2流速30mL/min)，分離柱為島津公司的毛細管柱DB-1(0.25mm× 30m)。

1.7多糖的紅外光譜(IR)分析

多糖的IR分析儀采用PerkinElmer公司的SpectrunGXFT-IR紅外光譜分析系統(tǒng)。樣品采用KBr壓片法進行測定。

1.8多糖的體外抗氧化分析

多糖對DPPH自由基的清除率測定反應體系如下：2mL體積分數(shù)為95%的乙醇或DPPH溶液(0.1μmol/L)，2mL不同濃度的多糖溶液(100～1 000mg/L)。反應混合物在25 ℃水浴15min，在517nm處測定吸光度[7]。清除羥基自由基的測定方法是采用SMIRONFF的方法[8]。多糖還原力的測定方法根據(jù)OYAIZU的方法[9]。

2　結(jié)果與分析

2.1香菇菌絲體多糖的組分分離純化

采用DEAE-纖維素柱對LMPS進行組分分離，分別利用蒸餾水和0.2、0.5、1.0mol/L的NaCl溶液作為流動相對LMPS洗脫，得到2個組分(LMPS-1和LMPS-2)，如圖1所示。對經(jīng)過DEAE-纖維素分離得到的2個組分用葡聚糖G-100凝膠做進一步分離。如圖2所示，LMPS-1和LMPS-2均分離得到一個單一的洗脫峰，表明LMPS-1和LMPS-2均為純多糖。對LMPS-1和LMPS-2進行紫外光譜掃描(ultravialetspectrum,UV)，試驗結(jié)果顯示LMPS-1和LMPS-2在280nm處有特征吸收峰，表明2種組分可能是以糖蛋白的形式存在。

圖1　LMPS的DEAE-纖維素離子交換柱層析洗脫曲線Fig.1　The profile of DEAE-cellulose ion exchange column chromatography byLMPS

圖2　兩種多糖組分的葡聚糖G-100凝膠層析洗脫曲線(A)LMPS-1和(B)LMPS-2Fig.2　The profile of G-100 gel filtration chromatography by two polysaccharides (A)LMPS-1 and (B) LMPS-2

2.2化學結(jié)構(gòu)分析

用高效液相色譜分析多糖分子質(zhì)量如圖3所示。LMPS-1色譜圖出現(xiàn)了2個洗脫峰，說明LMPS-1含有分子質(zhì)量相對集中的2個組分，因此，LMPS-1為不均一多糖。用GPC分析軟件計算后可知，LMPS-1的Mw為5.49×104Da，Mn為2.40×104Da，Mv為5.01×104Da，Mz為1.07×105Da，Mp為1.24×104Da，LMPS-1的Mw/Mn值為2.29。LMPS-2為單一對稱峰，說明LMPS-2為均一多糖。其Mw為1.35×104Da，Mn為1.05×104Da，Mv為3.55×104Da，Mz為1.20×105Da，Mp為1.14×104Da。LMPS-2的Mw/Mn值為1.29。

圖3　兩種多糖高效液相色譜圖分析(A)LMPS-1和(B)LMPS-2Fig.3　Analysis of HPGPC chromatogram by LMPS-1 and LMPS-2

根據(jù)標樣的保留時間來測定單糖的含量，由圖4和表1可知，LMPS-1含有37%的阿拉伯糖、11.4%的木糖、18.2%的甘露糖和33.4%的葡萄糖, 它們的摩爾比為2.5∶0.8∶1∶1.8，從這些數(shù)據(jù)可以看出，LMPS-1含量最多的單糖是阿拉伯糖和葡萄糖。

圖4　兩種多糖氣相色譜圖分析(A)LMPS-1和(B)LMPS-2Fig.4　Analysis of GC chromatogram by LMPS-1 and LMPS-2

表1　氣相色譜結(jié)果

注：-：表明多糖組分中不含有該單糖。

LMPS-2含有54.7%的鼠李糖、10.8%的木糖和34.5%的葡萄糖，它們的摩爾比為4.2∶1∶2.7，可以看出LMPS-2含量最多的單糖是鼠李糖和葡萄糖。

圖5　LMPS-1的紅外光譜Fig.5　FT-IR spectra of LMPS-1

圖6　LMPS-2的紅外光譜Fig.6　FT-IR spectra of LMPS-2

2.3兩種組分的體外抗氧化活性

2.3.1LMPS-1和LMPS-2對DPPH自由基的清除作用

圖7為LMPS-1和LMPS-2對DPPH自由基的清除作用。在濃度為200mg/L時，LMPS-1和LMPS-2對DPPH的清除率分別為(13.85±0.69)%和(32.96±1.65)%。據(jù)報道，當濃度為200mg/L時，桑黃菌絲體多糖對DPPH自由基的清除率為8%[13]。結(jié)果表明，LMPS-2對DPPH具有較高的清除率，是桑黃的412%。

圖7　LMPS-1和LMPS-2對DPPH自由基的清除作用Fig.7　Scavenging effects of LMPS-1 and LMPS-2 on DPPH radicals

2.3.2LMPS-1和LMPS-2對羥基自由基的清除作用

LMPS-1和LMPS-2對羥基自由基的清除作用見圖8，在1 000mg/L時LMPS-1和LMPS-2對羥基自由基的清除率分別為(8.50 ± 0.43)%和(41.2 ± 2.06)%。據(jù)相關(guān)報道，當濃度為1 000mg/L時，蟲草的清除率為20%[14]，樺褐孔菌的清除率為10%[15]。即LMPS-2對羥基自由基的清除作用是蟲草的206.0%，樺褐孔菌的412.0%。

圖8　LMPS-1和LMPS-2對羥基自由基的清除作用Fig.8　Scavenging effects of LMPS-1 and LMPS-2 on hydroxyl radicals

2.3.3LMPS-1和LMPS-2的還原力測定

如圖9所示，在100mg/L時，LMPS-1和LMPS-2在700nm處測得的還原力分別為(0.19 ± 0.01)和(0.53 ± 0.03)，據(jù)報道，桑黃的為0.10[16]，樹舌靈芝的為0.40[17]，即LMPS-2的還原力是桑黃的530.0%，樹舌靈芝的132.5%。LMPS-2的EC50為893.2mg/L。

圖9　LMPS-1和LMPS-2還原力測定Fig.9　Reducing power of LMPS-1 and LMPS-2

3　結(jié)論

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CharacteristicandantioxidantactivitiesofpolysaccharidesbyLentinus edodesmycelium

YUANXiang-dong*

(BaotouLightIndustryVocationalTechnicalCollege,InnerMongolia,Baotou014035，China)

ToisolateandpurifyLentinus edodesmyceliumpolysaccharides(LMPS)throughion-exchangechromatographyandgelfiltrationchromatography,andtoprovideatheoreticalreferenceforrelationshipbetweenstructureandactivityofLMPS.ThestructuralcharacteristicsofpolysaccharidewereelucidatedbyHighPerformanceLiquidChromatography(HPLC),gaschromatography(GC),andinfraredspectrum(IR).Results:TheresultshowedthatLMPS-1wascomposedofrhamnose(Rha),arabinose(Ara),xylose(Xyl),mannose(Man),glucose(Glu)andgalactose(Gal)withamolarratioof1.52:2.96:2.91:0.78:1:1.35;LMPS-2containedRha,AraandXylwithamolarratioof2.91:1:1.1:0.2:0.5..TheresultsshowedthatLMPS-1andLMPS-2hadverystrongreducingpowerandscavengingeffectsonDPPHandhydroxylradicals.LMPSfuranoidsweremainlycomposedofRhaandGluwithstrongantioxidantactivities.

Lentinus edodes;mycelium;polysaccharide;chemicalstructure;antioxidantactivities

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608036

碩士,講師(本文通訊作者，E-mail:18865489890@163.com)。

2015-09-01，改回日期：2016-01-24