桂麗，孫謐，劉均忠，王偉

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島市海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島,266071)　2(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海, 201306)

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中性蛋白酶發(fā)酵液脫色工藝優(yōu)化

桂麗1,2，孫謐1*，劉均忠1，王偉1

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島市海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島,266071)2(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海, 201306)

為了脫除中性蛋白酶發(fā)酵液中的色素，降低色素在產(chǎn)品應(yīng)用中的影響，研究并比較了樹(shù)脂、活性炭、H2O2對(duì)中性蛋白酶發(fā)酵液的脫色效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陰離子交換樹(shù)脂D380(Cl)型能使其有效脫色并保留較高的蛋白酶活性；利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)建立數(shù)學(xué)模型，并確定D380(Cl)型樹(shù)脂脫色最適流速為2.35柱體積/h(bedvolume/h,BV/h)，最佳上樣量為0.4BV，最適上樣酶活力為40 000U/mL，最適pH值為6，此時(shí)，中性蛋白酶發(fā)酵液脫色率為86%，酶活回收率為95%。D380(Cl)型樹(shù)脂連續(xù)使用10次仍有較強(qiáng)脫色能力，脫色率在80%以上，酶活回收率在90%以上。

中性蛋白酶；脫色；樹(shù)脂；響應(yīng)面

中性蛋白酶是最早被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的蛋白酶類，由于其作用條件溫和，催化速率較快，無(wú)工業(yè)污染，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌、皮革、銀洗、飼料、化工和廢棄物處理[1]；特別是因?yàn)橹行缘鞍酌改芩庠系鞍浊覝p少苦味肽的產(chǎn)生，其在食品工業(yè)上的應(yīng)用更為廣闊[2]。中性蛋白酶發(fā)酵液中含有大量色素雜質(zhì)，應(yīng)用在食品加工領(lǐng)域時(shí)這些雜質(zhì)會(huì)直接影響產(chǎn)品的外觀品質(zhì)，此外，脫除色素對(duì)精制酶以提高酶的附加值也有重要意義。因此，針對(duì)中性蛋白酶發(fā)酵液建立有效的脫色方法成為提高其應(yīng)用質(zhì)量的迫切需求。由于不同蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)存在差異，對(duì)不同種類的蛋白酶發(fā)酵液脫色需要篩選合適的脫色介質(zhì)：王芳等利用陰離子交換樹(shù)脂D352對(duì)低溫堿性蛋白酶MP發(fā)酵液進(jìn)行脫色，脫色率和酶活回收率均能達(dá)到90%以上[3]；JOO等人利用陰離子交換樹(shù)脂HPA75對(duì)堿性蛋白酶BACP發(fā)酵液進(jìn)行脫色，脫色率能達(dá)到80%以上，酶活幾乎無(wú)損失[4]；但是，國(guó)內(nèi)外專門(mén)針對(duì)中性蛋白酶發(fā)酵液進(jìn)行脫色的研究不多。本文從適合工業(yè)化生產(chǎn)的要求出發(fā)，以南海海域分離的1株產(chǎn)中性蛋白酶菌株的發(fā)酵液為原料[5]，比較了不同脫色介質(zhì)對(duì)中性蛋白酶發(fā)酵液的脫色效果，進(jìn)而選取合適的脫色介質(zhì)并優(yōu)化脫色工藝條件，以期提高中性蛋白酶的應(yīng)用品質(zhì)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

中性蛋白酶發(fā)酵液：本課題組利用10L發(fā)酵罐發(fā)酵制備，pH7～8，經(jīng)絮凝、過(guò)濾及硫酸銨沉淀除去培養(yǎng)基雜質(zhì)和菌體，酶泥復(fù)溶得不同濃度中性蛋白酶發(fā)酵液。顆?；钚蕴俊⒎勰┗钚蕴?、30%H2O2購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大孔吸附樹(shù)脂NKA、D3520，弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D380，弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂110均購(gòu)自南開(kāi)大學(xué)化工廠；弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D316購(gòu)自山東魯抗立科，其他試劑均為國(guó)藥分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

Φ26mm×457mm玻璃離子交換柱，北京欣維爾玻璃儀器有限公司；UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；CR21GⅢ高速離心機(jī)，日立公司；LKB2219恒溫水浴鍋，瑞典BROMMA公司。

1.3活性炭脫色

選取初始酶活為10 000U/mL的中性蛋白酶發(fā)酵液適量，用0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH值至5.0，添加10g/L的顆粒和粉末活性炭，50 ℃水浴振蕩保溫脫色1h，離心取上清為脫色樣品，調(diào)pH至7.0，取樣測(cè)定其吸光度與酶活。

1.4H2O2脫色

選取初始酶活為10 000U/mL的中性蛋白酶發(fā)酵液適量，用氨水調(diào)pH至8.0，加入30%H2O2，使H2O2終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到3%，50 ℃水浴保溫脫色1h，調(diào)pH至7.0，取樣測(cè)定其吸光度與酶活。

1.5樹(shù)脂脫色

1.5.1樹(shù)脂預(yù)處理[6]

大孔吸附樹(shù)脂用體積分?jǐn)?shù)為4%的HCl浸泡4h，用去離子水洗至中性后，再用40g/L的NaOH浸泡4h，去離子水洗至中性，體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇浸泡5h，去離子水洗凈，濕法裝柱使用；陰離子交換樹(shù)脂用4%HCl和40g/L的NaOH各浸泡4h，去離子水洗至中性，4%HCl浸泡3h轉(zhuǎn)型洗至中性或直接濕法裝柱使用；陽(yáng)離子交換樹(shù)脂用40g/L的NaOH和4%HCl各浸泡4h，去離子水洗至中性，40g/L的NaOH浸泡3h轉(zhuǎn)型洗至中性或直接濕法裝柱使用。

1.5.2樹(shù)脂脫色篩選

取中性蛋白酶發(fā)酵液1/3BV，樣品酶活力20 000U/mL，以1BV/h的流速上樣，后用洗脫液以與上樣流速相同的流速進(jìn)行洗脫，收集液定容后取樣測(cè)定其吸光度與酶活。

1.5.3樹(shù)脂脫色條件優(yōu)化

取1.5.2中篩選出的最優(yōu)樹(shù)脂，利用單因素實(shí)驗(yàn)分析高徑比、流速、pH值、上樣酶活力、上樣量對(duì)脫色效果的影響。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素五水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，采用Design-Expert8.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立數(shù)學(xué)模型，根據(jù)模型預(yù)測(cè)最佳脫色條件并進(jìn)行驗(yàn)證[7]。

1.5.4樹(shù)脂再生性能評(píng)價(jià)

取1.5.2中篩選的最優(yōu)樹(shù)脂，按最適條件進(jìn)行脫色，脫色后用4%HCl和40g/L的NaOH各浸泡4h再生，去離子水洗至中性，4%HCl浸泡3h轉(zhuǎn)型洗至中性，濕法裝柱使用。樹(shù)脂共再生9次。

1.6脫色效果分析方法

1.6.1脫色率的測(cè)定

將脫色前發(fā)酵液和脫色后發(fā)酵液稀釋至同等倍數(shù)，以420nm[8]下吸光度為表征色值，按公式(1)計(jì)算脫色率：

(1)

式中：D，脫色率；A0，脫色前吸光度；A，脫色后吸光度。

1.6.2蛋白酶酶活的測(cè)定(Folin-酚法)

參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23527—2009進(jìn)行，具體如下：1mL稀釋后酶液與1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酪素溶液混合，40 ℃水浴10min，2mL的0.4mol/L三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)，靜置過(guò)濾；空白對(duì)照加樣順序?yàn)槊敢骸猅CA—酪素。取1mL上清液加5mL的0.4mol/LNa2CO3溶液、1mL福林試劑，置于40 ℃水浴中顯色20min取出，冷水冷卻至室溫，680nm波長(zhǎng)下比色。以每毫升原酶液在40 ℃、pH7.0條件下水解酪蛋白，每分鐘釋放1μg酪氨酸的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

2　結(jié)果與討論

2.1脫色效果比較

表1中列出了活性炭、H2O2和樹(shù)脂的脫色效果，由該表可看出樹(shù)脂脫色的方法明顯優(yōu)于活性炭和H2O2脫色：活性炭脫色和H2O2脫色會(huì)使酶活大幅度降低，這與脫色反應(yīng)所處的較高溫度、活性炭對(duì)蛋白的吸附作用以及H2O2的氧化作用有關(guān)，兩種脫色方法的脫色率也較低，這與色素自身特性有關(guān)。根據(jù)表1中列出的結(jié)果，選擇脫色率較高，酶活回收率相對(duì)較高的陰離子交換樹(shù)脂D380(Cl)型進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1　三種不同脫色方法的比較

2.2陰離子交換樹(shù)脂D380(Cl)型脫色工藝的研究

2.2.1單因素實(shí)驗(yàn)

處理?xiàng)l件對(duì)脫色效果的影響如圖1～圖5所示。

由圖1可以看出，高徑比越高越好，這符合塔板理論。高徑比達(dá)到1∶6時(shí)，脫色率和酶活回收率增勢(shì)趨于平緩。考慮實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作因素，選擇1∶6為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用高徑比。

流速過(guò)高則色素與樹(shù)脂接觸不充分而使脫色率下降，流速過(guò)低則樹(shù)脂會(huì)吸附過(guò)多的蛋白酶導(dǎo)致酶活回收率下降。由圖2可以看出，流速在2BV/h以下時(shí)對(duì)酶活回收率和脫色率影響較小，在流速增至2BV/h時(shí)，脫色率降至84%，酶活回收率增至90%左右，繼續(xù)增加流速，發(fā)現(xiàn)其對(duì)酶活回收率影響不大，但脫色率仍在持續(xù)降低。綜合考慮兩因素，選擇2BV/h為最適流速。

圖1　高徑比對(duì)脫色效果的影響Fig.1　Effect of aspect ratio on decoloration and protease yeild(注：流速1 BV/h，水為洗脫液，上樣量1/3 BV，上樣酶活力20 000 U/mL)

圖2　流速對(duì)脫色效果的影響Fig.2　Effect of flow rate on decoloration and protease yield(注：水為洗脫液，上樣量1/3 BV，上樣酶活力20 000 U/mL)

發(fā)酵液與洗脫液的pH值會(huì)影響溶液中的色素、蛋白與樹(shù)脂中離子的交換解離，同時(shí)，pH值對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性也有很大影響，因此，選擇該蛋白酶較穩(wěn)定的pH5～9進(jìn)行pH因素影響實(shí)驗(yàn)。由圖3可以看出，隨著pH值增高，脫色率略微降低，酶活回收率先增后減，偏中酸性時(shí)酶活回收率和脫色率較高，這與該中性蛋白酶等電點(diǎn)和蛋白酶自身穩(wěn)定性以及色素自身特性有關(guān)。綜合考慮兩因素，選擇酶活回收率最高、脫色率較高的pH6為最適脫色pH值。

圖3　pH值對(duì)脫色效果的影響Fig.3　Effect of pH value on decoloration and protease yield(注：流速2 BV/h，上樣量1/3 BV，樣品酶活力20 000 U/mL)

由圖4可以看出，隨著樣品酶活力的增加，脫色率先增后減，酶活回收率變化不大。上樣酶活力較低時(shí)，洗脫液顏色太淺，實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)接近于0，測(cè)得數(shù)據(jù)不在線性范圍內(nèi)，造成脫色率較低；樣品酶活力增加，實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)逐漸在線性關(guān)系的數(shù)值范圍內(nèi)，此時(shí)隨著色素量增大，色素和樹(shù)脂的結(jié)合逐漸達(dá)到飽和，洗脫下來(lái)的色素相應(yīng)增多，使得脫色率逐漸降低；此外，溶液濃度增大，黏性也增大，分子運(yùn)動(dòng)阻力增加，不利于被吸附物質(zhì)向吸附劑表面擴(kuò)散，這也導(dǎo)致了脫色率的降低。綜合考慮，選擇40 000U/mL為最適上樣酶活力。

圖4　上樣酶活力對(duì)脫色效果的影響Fig.4　Effect of the concentration of sample solution on decoloration and protease yield(注：流速2 BV/h，pH值為6，上樣量1/3 BV)

由圖5可以看出，隨著上樣量的增加，脫色率遞減，酶活回收率先增后減。上樣量的增加會(huì)增加樹(shù)脂吸附的色素的量，當(dāng)色素與樹(shù)脂的結(jié)合逐漸達(dá)到飽和，樹(shù)脂對(duì)色素的吸附作用下降，脫色率逐漸降低。酶活回收率先增后減，是因?yàn)闃?shù)脂對(duì)蛋白的吸附先達(dá)到了飽和，蛋白與樹(shù)脂結(jié)合能力下降，此時(shí)隨著上樣量增加，酶活回收率相應(yīng)的增加；上樣量繼續(xù)增加，蛋白流經(jīng)樹(shù)脂所需時(shí)間更長(zhǎng)，與樹(shù)脂的接觸更加充分，使得樹(shù)脂之間的空隙殘留的蛋白更多，從而造成酶活回收率的下降。綜合考慮，選擇0.5BV為最適上樣量。

圖5　上樣量對(duì)脫色效果的影響Fig.5　Effect of the size of sample solution on decoloration and protease yield(注：流速2 BV/h，pH值為6，上樣酶活力40 000 U/mL)

2.2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，流速、上樣量、上樣酶活力3因素對(duì)脫色效果影響大。因此，固定脫色pH值為6、高徑比為1∶6，以流速2BV/h、上樣量0.5BV、上樣酶活力40 000U/mL為中心條件進(jìn)行以流速、上樣量、上樣酶活力為自變量，脫色率和酶活回收率為雙響應(yīng)值[9]的響應(yīng)面條件優(yōu)化，設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果如表2、表3所示。

表2　實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼

表3　中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)CentralComposite設(shè)計(jì)了20組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。利用Design-Expert8.05軟件對(duì)表3兩響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合，得到D380(Cl)型樹(shù)脂對(duì)中性蛋白酶發(fā)酵液脫色率Y1和酶活回收率Y2的回歸方程分別為：

Y1= 84.70-0.65 X1-0.98 X2-1.73 X3-0.2 X1X2-0.24 X1X3+0.18 X2X3-0.14 X12+0.54 X22-1.56 X32

Y2= 95.66+1.25 X1-0.19 X2+1.32 X3-0.44 X1X2+6.25×10-3X1X3-0.52 X2X3-0.8 X12-1.23 X22-1.88 X32

兩模型的方差分析顯示，實(shí)驗(yàn)所建立的兩個(gè)二次項(xiàng)模型具有高度顯著性(P1=0.0004<0.05，P2=0.0001<0.05)，失擬項(xiàng)均不顯著，兩模型的R2分別為0.9112和0.9920，表明模型擬合度較好，能較好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜合兩響應(yīng)模型進(jìn)行軟件分析，得出當(dāng)流速為2.35BV/h，上樣量為0.4BV，樣品酶活力為39 741.04U/mL，其余條件不變時(shí)，脫色率和酶活回收率有最大響應(yīng)，理論最大脫色率為86.0%，酶活回收率為95.3%。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在流速2.35BV/h、上樣量0.4BV、上樣酶活力為40 000U/mL條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3組平行實(shí)驗(yàn)脫色率分別為：86.1%、86.3%、85.9%，酶活回收率分別為：95.5%、95.1%、95.9%，與預(yù)測(cè)值接近，表明該模型預(yù)測(cè)效果良好。通過(guò)優(yōu)化，陰離子交換樹(shù)脂D380(Cl)型對(duì)中性蛋白酶發(fā)酵液的脫色率由最初的(83.2±1.2)%提高至(86.1±0.2)%，酶活回收率由最初的(84.9±0.6)%提高至(95.5±0.4)%，這表明該條件是中性蛋白酶發(fā)酵液脫色的理想條件。

2.2.3樹(shù)脂再生性能評(píng)價(jià)結(jié)果

王芳等利用陰離子交換樹(shù)脂D352對(duì)低溫堿性蛋白酶MP發(fā)酵液進(jìn)行脫色，樹(shù)脂重復(fù)使用6次后仍有較好的脫色效果，但脫色率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)[3]；JOO等人利用陰離子交換樹(shù)脂HPA75對(duì)堿性蛋白酶BACP發(fā)酵液進(jìn)行脫色，樹(shù)脂重復(fù)使用4次時(shí)，脫色率由最初的78%降低至72%，酶活回收率由幾乎無(wú)損失降低至93%[4]。由圖6可以看出，在重復(fù)使用過(guò)程中脫色率和酶活回收率均未呈現(xiàn)明顯降低趨勢(shì)，使用第10次時(shí)脫色率和酶活回收率分別為84.0%、94.1%，說(shuō)明樹(shù)脂再生對(duì)脫色效果影響小，再生后樹(shù)脂仍有較好的脫色性能。D380(Cl)型樹(shù)脂能重復(fù)使用多次，降低了生產(chǎn)成本，滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。

圖6　重復(fù)使用次數(shù)對(duì)脫色效果的影響Fig.6　Effect of the using times of resin on decoloration and protease yield(注：流速2.35 BV/h，pH值6，上樣量0.4 BV，上樣酶活力40 000 U/mL)

3　結(jié)論

(1)通過(guò)比較不同脫色介質(zhì)對(duì)中性蛋白酶發(fā)酵液的脫色效果，發(fā)現(xiàn)樹(shù)脂脫色效果優(yōu)于活性炭和H2O2，在所篩選的樹(shù)脂中陰離子交換樹(shù)脂D380(Cl)型脫色效果最優(yōu)。

(2)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析得出D380(Cl)型樹(shù)脂對(duì)該中性蛋白酶發(fā)酵液脫色的最適條件是流速2.35BV/h，上樣量0.4BV，上樣酶活力40 000U/mL，pH值為6，在此條件下，脫色率能達(dá)到86%，酶活回收率能達(dá)到95%，脫色效果相較初始篩選條件時(shí)有顯著的提高。

(3)D380(Cl)型樹(shù)脂重復(fù)使用10次后脫色率與酶活回收率仍分別超過(guò)80%、90%，且未呈現(xiàn)明顯的降低趨勢(shì)，說(shuō)明樹(shù)脂再生對(duì)脫色效果影響小，再生后樹(shù)脂仍有較好的脫色性能，相較其他同類型的研究有一定優(yōu)勢(shì)。D380(Cl)型樹(shù)脂能重復(fù)使用多次，降低了生產(chǎn)成本，滿足工業(yè)生產(chǎn)需求，有一定應(yīng)用價(jià)值。

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Theoptimizationofdecolorizationmethodofneutralproteasefermentedbroth

GUILi1,2,SUNMi1*,LIUJun-zhong1,WANGWei1

1(KeyLaboratoryofSustainableDevelopmentofMarineFisheries,MinistryofAgriculture;QingdaoKeyLaboratoryofMarineEnzymeEngineering,YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao266071,China)2(CollegeofFoodScience&Technology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Toremovethepigmentsinneutralproteasefermentedbroth,asimplemethodforthedecolorationofneutralproteasefermentedbrothwasdevelopedthroughdifferentmedium.IronexchangeresinD380 (Cl)demonstratedthehighestdecolorationefficiencyandgoodproteaserecovery.Undertheoptimizeddynamicadsorptionconditionsthroughsinglefactormethodandresponsesurfacemethodology(pH6,uploadingandelutionflowrateof2.35BV/h, 0.4BVof40 000U/mLenzymesolution),theratiosofdecolorationandproteaseyieldforD380 (Cl)were86%and95%,respectively.UsedD380 (Cl)couldberegeneratedeasily,andtheregeneratedD380(Cl)wasaseffectiveasnotusedone.After10timesreusesofregeneratedD380(Cl),theratiosofdecolorationandproteaseyieldcouldalsoreach80%and90%,respectively.Itprovidesapotentialapproachforlarge-scaleproductionofneutralprotease.

neutralprotease;decoloration;resin;responsesurfacemethodology

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608017

碩士研究生(孫謐研究員為通訊作者，E-mail:sunmi@ysfri.ac.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金-聯(lián)合基金項(xiàng)目 (U1406402-5)；國(guó)際科技合作與交流專項(xiàng) (2014DFG30890)；國(guó)家實(shí)驗(yàn)室——鰲山科技計(jì)劃(2015ASKJ02-06)

2016-03-08改回日期：2016-04-25