侯陽陽，冉治霖，李紹峰

（1.沈陽建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧沈陽116109；2.深圳信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院交通與環(huán)境學(xué)院，廣東深圳518172；3.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院深圳市城市節(jié)水及工業(yè)污水資源化技術(shù)重點實驗室，廣東深圳518055）

基于hsp70mRNA的RT-qPCR方法評估水中病源微生物的滅活效果*

侯陽陽1，冉治霖2，李紹峰3

（1.沈陽建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧沈陽116109；2.深圳信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院交通與環(huán)境學(xué)院，廣東深圳518172；3.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院深圳市城市節(jié)水及工業(yè)污水資源化技術(shù)重點實驗室，廣東深圳518055）

基于熱誘導(dǎo)hsp70mRNA的表達(dá)，建立一種RT-qPCR方法來評估水中病源微生物的滅活效果。以大腸桿菌為實驗對象，通過RT-qPCR方法定量hsp70mRNA表達(dá)，以氯胺消毒樣本與空白對照樣本的hsp70mRNA表達(dá)量之比，確定滅活效果。實驗結(jié)果顯示：該方法檢測的靈敏度為900cfu·mL-1；對氯胺滅活效果的檢測，該方法的滅活率明顯低于平板培養(yǎng)檢測結(jié)果?；趆sp70mRNA的RT-qPCR方法，具有準(zhǔn)確、快速、特異性強(qiáng)的優(yōu)點，可用于評價水中病源微生物的滅活效果。

熱休克蛋白70mRNA；逆轉(zhuǎn)錄定量PCR；大腸桿菌；檢測；滅活

微生物致病風(fēng)險是影響供水安全的一個重要問題。據(jù)統(tǒng)計，美國每年發(fā)生748000例隱孢子蟲病例［1］；全球每年約60000名兒童感染輪狀病毒［2］；3%～6%的肺炎是由嗜肺軍團(tuán)菌引起的；其中，受到病原性微生物污染的飲用水是此類疾病傳播的重要途徑。解決這一問題不僅需要飲用水消毒技術(shù)的快速發(fā)展，開發(fā)準(zhǔn)確、快速、特異性強(qiáng)的水中病源微生物滅活效果評價技術(shù)也是一個關(guān)鍵問題。

目前，國內(nèi)外在水中病源微生物活性評價方面開發(fā)了多種新型方法，包括：EPA 1623法、IFA（免疫熒光檢測法）、細(xì)胞感染、原位雜交技術(shù)、RT-PCR技術(shù)等，但各方法均有不足之處［3］。逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）是一種定量mRNA轉(zhuǎn)錄水平的重要方法［4］，而mRNA的轉(zhuǎn)錄水平又與生物機(jī)體的活性相關(guān)［5］，因此，RT-qPCR技術(shù)在微生物活性檢測領(lǐng)域得到大量運用［6-8］。

熱休克蛋白的表達(dá)是生物體內(nèi)的一種自我保護(hù)機(jī)制，當(dāng)生物體受到外界刺激時，表達(dá)產(chǎn)生熱休克蛋白以增強(qiáng)抵御外界環(huán)境變化的能力［9，10］。采用hsp70mRNA作為微生物活性檢測的目的基因［11］，經(jīng)過熱誘導(dǎo)，其表達(dá)量會大大增加［10，12］，因此，相比其他目的基因RNA，以hsp70mRNA作為檢測定量的目的基因具有更高的靈敏度。本研究基于誘導(dǎo)水環(huán)境中微生物hsp70mRNA表達(dá)，運用RT-qPCR技術(shù)，以水環(huán)境中常見的細(xì)菌（大腸桿菌）研究對象，建立一種快速、精確的檢測方法，并應(yīng)用于評價水環(huán)境中病源微生物滅活效果。

1　實驗部分

1.1實驗材料

本實驗使用的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Escherichia coli，ATCC 25922）購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，大腸桿菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min）。PCR實驗所用耗材均購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2主要實驗儀器和試劑盒

Applied Biosystems QuantStudio6 Flex熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；NanoDrop2000超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；TProfessional Standard Gradient96 PCR儀（耶拿公司，德國）；MIKRO 200R冷凍離心機(jī)（Hettich公司，德國）。

總RNA提取試劑盒TRIzol Reagent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol、熒光定量試劑盒SYBR SelectMaster Mix、均購自Invitrogen公司。

1.3實驗方法

1.3.1引物合成根據(jù)GenBank中公布的大腸桿菌hsp70基因序列（D10765），利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計熒光定量引物序列。上游序列為：5'-TGT TCTGACTGGTGACGTGAAA-3'；下游序列為：5'-TG CTTGGTCGGGATAGTGG-3'；引物序列由由華大基因合成。擴(kuò)增片段長度為126bp，擴(kuò)增序列為：

TGTTCTGACTGGTGACGTGAAAGACGTACTGC TGCTGGACGTTACCCCGCTGTCTCTGGGTATCGAA ACCATGGGCGGTGTGATGACCACGCTGATCGCGA AAAACACCACTATCCCGACCAAGCA

1.3.2定量標(biāo)準(zhǔn)品制備本實驗采用的標(biāo)準(zhǔn)品為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，具體制備方法見參考文獻(xiàn)［13］。提取含有hsp70基因的質(zhì)粒DNA，用超微量分光光度計測量質(zhì)粒DNA濃度。按以下公式計算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)：

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)（copies·μL-1）=（NL×10-9）×m/（n×660）

式中NL：阿伏伽德羅常數(shù)6.02×1023，m：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA濃度，ng·μL-1；n：擴(kuò)增序列長度，bp；雙鏈DNA一對核苷酸的質(zhì)量為660g·mol-1。

本實驗中提取的質(zhì)粒DNA濃度為151.9ng· μL-1，計算得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品初始濃度為1.1× 1012copies·μL-1。將初始質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按10倍梯度稀釋得到qPCR的定量標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.3誘導(dǎo)條件的優(yōu)化為了提高檢測方法的效率和靈敏度，需要選擇最適宜的條件誘導(dǎo)hsp70mRNA表達(dá)。本實驗采用熱誘導(dǎo)方式，主要優(yōu)化熱誘導(dǎo)溫度和時間。取培養(yǎng)過夜的大腸桿菌于離心管中，每個樣品1.5mL，分為4組，用HBSS緩沖溶液漂洗3遍；4組菌液分別在37、39.5、42、44.5℃下作用；各組分別在0，30，60，90，120，180min取樣（已分裝與離心管中），立即提取RNA并用RT-PCR方法定量hsp70mRNA拷貝數(shù)。

1.3.4RT-qPCR過程

（1）總RNA提取取經(jīng)過熱誘導(dǎo)菌液1.5mL，4℃、5000r·min-1離心3min，盡棄上清收集菌體，加入1mL TRIzolReagent，反復(fù)抽吸振蕩，靜置5min；加入0.2mL氯仿，靜置3min，4℃、12000r·min-1離心15min，將上清液移至另一離心管中（注意吸取上清液時避免吸取中間白色層）；向上清液中加入0.5mL異丙醇，室溫靜置10min；4℃、12000r·min-1離心10min，盡棄上清，加入75%酒精1mL溫和洗滌沉淀，4℃、7500r·min-1離心5min，盡量去上清，室溫晾干5～10min；加入30μLDEPC處理水溶解RNA沉淀，55～60℃水浴10～15min。用超微量分光光度計測定RNA濃度并檢測OD260/OD280。

（2）RNA逆轉(zhuǎn)錄采用TProfessional Standard Gradient 96 PCR儀將大腸桿菌總RNA逆轉(zhuǎn)錄到cDNA，反應(yīng)體系由以下成分組成：2.0μL 10×RT Buffer，0.8μL25×dNTPMix，2.0μL10×RT Random Primers，1.0μL MultiScribeTMReverse Transcriptase，1.0μL RNase Inhibitor，2μL RNA，11.2μL Nuclease-free H2O反應(yīng)體系總體積為20μL。反應(yīng)程序為：25℃反應(yīng)10min，37℃反應(yīng)120min，85℃反應(yīng)5min，保持10℃到反應(yīng)結(jié)束。

（3）定量PCR采用Applied Biosystems Quant Studio 6 Flex實時熒光定量PCR儀定量目的基因cDNA，SYBR Green標(biāo)記目的基因，退火溫度為59℃。反應(yīng)體系由以下成分組成：1.0μL正向引物（10μM），1.0μL反向引物（10μM），5μL cDNA，10μL SYBRR Select Master Mix（2X），3.0μL RNase-freewater，反應(yīng)體系總體積為20μL。反應(yīng)程序為：50℃反應(yīng)2min，1個循環(huán)；95℃反應(yīng)2min，95℃反應(yīng)15s，59℃反應(yīng)15s，72℃反應(yīng)1min，40個循環(huán)。

1.3.5靈敏度實驗將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液做十倍梯度稀釋，每個梯度取樣1.5mL，離心用HBSS平衡溶液漂洗3次，經(jīng)過42℃熱誘導(dǎo)1h后，提取RNA用RT-qPCR方法定量各稀釋梯度hsp70 mRNA拷貝數(shù)，同時用平板培養(yǎng)法計數(shù)大腸桿菌濃度。

1.3.6大腸桿菌滅活檢測實驗將培養(yǎng)過夜的大腸桿菌菌液用PBS緩沖液做適當(dāng)稀釋，模擬待消毒水樣。分別用初始濃度為0.5，1，3，5，10mg·L-1的氯胺（NH2Cl）處理10min，對照樣本未做消毒處理。消毒結(jié)束后立即用10%的無菌硫代硫酸鈉（Na2S2O3）中和，終止消毒。分別取樣、離心、用HBSS平衡溶液漂洗3次。室溫放置1h后，轉(zhuǎn)移至42℃培養(yǎng)箱熱誘導(dǎo)1h，用RT-qPCR方法定量hsp70mRNA拷貝數(shù)。同時用平板培養(yǎng)法計數(shù)活菌數(shù)。

1.3.7消毒效果評價對于平板培養(yǎng)法，消毒效果依據(jù)經(jīng)過消毒后水樣中大腸桿菌的存活率進(jìn)行判斷，滅活率S1=lg（Nt/N0），Nt為經(jīng)過消毒后水樣中剩余的大腸桿菌數(shù)，N0為未經(jīng)消毒實驗前水樣中的大腸桿菌數(shù)。對于本實驗中基于hsp70mRNA的定量RT-qPCR檢測方法，消毒效果依據(jù)經(jīng)過消毒后水樣中大腸桿菌hsp70mRNA的表達(dá)效率來判斷。滅活率S2=lg（Mt/M0），Mt為經(jīng)過消毒后水樣中大腸桿菌hsp70mRNA表達(dá)量，M0為未經(jīng)消毒實驗的對照樣品中hsp70mRNA表達(dá)量。

2　結(jié)果與討論

2.1qPCR的檢測區(qū)間與特異性

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，臨界循環(huán)數(shù)（threshold cycle）為縱坐標(biāo)建立定量目的基因濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1　hsp70定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 qPCR standard curve of hsp70 gene

由圖1可知，目的基因濃度最優(yōu)檢測區(qū)間為1.1× 101～1.1×108copies·μL-1。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.254x+39.3，式中y代表Ct值，x代表基因濃度的對數(shù)值。

大腸桿菌定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.996，目的基因定量PCR擴(kuò)增效率為102.9%。PCR溶解曲線呈單一的熔點峰，峰型窄而尖（圖2），峰值為（84±0.3）℃，由溶解曲線圖可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好，不存在非特異性擴(kuò)增。

圖2　hsp70溶解曲線Fig.2 Melt curve of hsp70 gene

圖2結(jié)果表明，本實驗建立的定量hsp70 cDNA（mRNA）的標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測范圍廣、靈敏度較高，且擴(kuò)增產(chǎn)物特性性良好。

2.2誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果

4組菌液分別在37、39.5、42、44.5℃進(jìn)行熱誘導(dǎo)；各組分別在0，30，60，90，120，180min取樣，立即提取RNA并用RT-PCR方法定量hsp70 cDNA拷貝數(shù)。經(jīng)過不同溫度和時間誘導(dǎo)后hsp70 cDNA的表達(dá)拷貝數(shù)見圖3。

圖3　不同溫度誘導(dǎo)hsp70基因表達(dá)Fig.3 Induction of hsp70 gene by different temperature

由圖3可知，熱誘導(dǎo)之前各組樣本的hsp cDNA大致相同，都在2.5×105copies左右。誘導(dǎo)溫度保持37℃，隨著作用時間增加，hsp70 cDNA含量基本不變，依然保持2.5×105copies；誘導(dǎo)溫度升高到39.5℃，隨著作用時間增加，hsp70 cDNA含量逐漸升高，120min時達(dá)到1.4×106copies，此后hsp70 cDNA含量基本不再增加；誘導(dǎo)溫度為42℃時，隨著作用時間增加，hsp70 cDNA含量迅速增加，30min時已到達(dá)1.05×106copies,60min時達(dá)到1.4×106copies，此后延長作用時間，hsp70 cDNA含量不再增加；誘導(dǎo)溫度為44.5℃，hsp70 cDNA含量先是迅速增加，30min時已經(jīng)達(dá)到1.3×106copies，此后又逐漸下降。

誘導(dǎo)溫度為37℃，與大腸桿菌培養(yǎng)溫度相同，hsp70mRNA表達(dá)量基本保持不變。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為39.5℃，hsp70mRNA表達(dá)量達(dá)到最大需要120min，而當(dāng)誘導(dǎo)溫度為42℃時，只需60min，即可達(dá)到相同的誘導(dǎo)效果。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為44.5℃時，hsp70mRNA的表達(dá)量先急劇增加，30min后逐漸下降，究其原因，可能是較高的溫度影響了菌體的代謝，這與熱誘導(dǎo)隱孢子蟲hsp70 mRNA表達(dá)研究結(jié)果相似［11］。綜上所述，hsp70mRNA最適宜的誘導(dǎo)條件為42℃作用60min。

2.3靈敏度檢測結(jié)果

由10倍梯度稀釋的大腸桿菌目的基因PCR擴(kuò)增曲線（圖3）可知，大腸桿菌濃度在9×102～9×107cfu·mL-1存在擴(kuò)增曲線，而當(dāng)濃度為9×10cfu·mL-1時，已不能產(chǎn)生擴(kuò)增曲線。實驗結(jié)果表明該方法的最低檢測限低至900cfu·mL-1。

圖4中，1～7分別為濃度的大腸桿菌樣品，8為陰性對照。

圖4　靈敏度檢測結(jié)果Fig.4 Results of sensitivity test

本實驗建立的RT-qPCR檢測方法對大腸桿菌的檢測限最低低至900cfu·mL-1，較段弘揚(yáng)［14］等報道的大腸桿菌的最低檢測限大大降低。這主要是由熱休克蛋白的獨特性質(zhì)決定的。當(dāng)生物體受到熱處理或其他外界刺激后，生物體內(nèi)的hsp70mRNA表達(dá)量會大量增加［12］。相比β-tubulin、amyloglucosidase、CP2等基因mRNA，以hsp70mRNA作為活性檢測的目標(biāo)基因可以提高RT-qPCR檢測的靈敏度［15］。

2.3消毒效果檢測

取待檢測樣品1.5m L，提取RNA，運用RT-qPCR方法定量大腸桿菌hsp70 cDNA拷貝數(shù)。經(jīng)過不同濃度氯胺消毒樣本的檢測擴(kuò)增曲線如圖4所示，1～5的氯胺投加量0、0.5、1、3、5mg·L-1，而經(jīng)10mg·L-1氯胺消毒的樣本，不能檢測出基因擴(kuò)增。根據(jù)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可計算出hsp70 cDNA的拷貝數(shù)，結(jié)果見表1。

圖5　RT-qPCR檢測結(jié)果Fig.5 Results of detection by RT-qPCRmethod

表1　RT-qPCR檢測對應(yīng)的CT值及拷貝數(shù)Tab.1 Number of copies of hsp70 cDNA/RNA

平板培養(yǎng)法檢測模擬消毒水樣中大腸桿菌濃度為cfu·mL-1。通過平板培養(yǎng)法和RT-qPCR方法檢測氯胺滅活大腸桿菌滅活效果見表2。

表2　兩種方法檢測效果對比Tab.2 Comparison of detection affectby twomethods

對比兩種方法檢測的對數(shù)滅活率可知，RT-qPCR方法與培養(yǎng)法之間具有一定的相關(guān)性，RT-qPCR方法檢測的滅活率低于培養(yǎng)法檢測結(jié)果。而經(jīng)過10mg·L-1的氯胺滅活10min后，使用RT-qPCR方法檢測不到擴(kuò)增曲線，說明此時大腸桿菌濃度已經(jīng)低于RT-qPCR方法檢測的最低檢測限。

氯胺消毒滅活大腸桿菌實驗中，平板培養(yǎng)法檢測的對數(shù)滅活率高于RT-qPCR方法檢測結(jié)果?？赡苁怯捎诋?dāng)細(xì)菌受到外界環(huán)境壓力后可以進(jìn)入“具有活性但不可培養(yǎng)（viable butnonculturable，VBNC）”［16］的狀態(tài)，這種狀態(tài)下細(xì)菌無法通過常規(guī)的培養(yǎng)法檢測出來，但“VBNC”狀態(tài)的病原菌仍然保持代謝活性和致病性，基于mRNA的PCR技術(shù)可以檢測這種狀態(tài)的細(xì)菌［17］。

消毒劑的滅活處理作為一種外界刺激，也會促進(jìn)微生物體內(nèi)hsp70mRNA的表達(dá)的增加，所以經(jīng)過滅活的微生物不能立即使用該RT-qPCR進(jìn)行檢測［18］。經(jīng)過消毒處理的大腸桿菌需在室溫放置1h，消除已滅活大腸桿菌hsp70mRNA的影響，再通過42℃熱刺激1h誘導(dǎo)有活性菌體hsp70mRNA大量表達(dá)，此時hsp70mRNA的表達(dá)量與大腸桿菌的活性具有相關(guān)性，可以通過RT-qPCR進(jìn)行滅活效果檢測。

3　結(jié)論

（1）本實驗以水中典型的病源微生物（大腸桿菌）為研究對象，基于RT-qPCR方法定量經(jīng)過熱誘導(dǎo)hsp70mRNA表達(dá)量。目的基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線最優(yōu)檢測區(qū)間在1.1×101～1.1× 108copies·μL-1，且擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好。

（2）熱誘導(dǎo)大腸桿菌hsp70mRNA表達(dá)的最適宜條件是42℃作用1h。

（3）本實驗以1.5mL的取樣量提取mRNA，進(jìn)行RT-qPCR檢測，對大腸桿菌的最低檢測限可達(dá)900cfu·mL-1。

（4）對于大腸桿菌消毒效果檢測，平板培養(yǎng)法與RT-qPCR方法具有一定的相關(guān)性，但平板培養(yǎng)法檢測的滅活率大于RT-qPCR方法檢測結(jié)果。RT-qPCR方法可以檢測處于“VBNC”狀態(tài)的細(xì)菌。

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Assessing the inactivation of pathogenicm icroorganism s in water based on reverse transcription quantitative PCR with hsp70mRNA*

HOU Yang-yang1，RAN Zhi-lin2，LIShao-feng3
（1.School ofMunicipal and Environmental Engineering，Shenyang Jianzhu University，Shenyang 116109，China；2.Departmentof Transportation and Environment，Shenzhen Institute of Information Technology，Shenzhen 518172，China；3.Shenzhen Key Laboratory of IndustrialWater Saving and Municipal Sewage Reclamation Technology，Shenzhen Polytechnic Institute，Shenzhen 518055，China）

Based on the expression of heat shock-induced hsp70 mRNA，a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction（RT-qPCR）assay method was established to assess the inactivation of pathogenic microorganisms in water.With escherichia colias experimental objects，the copy numbers of hsp70mRNA was quantified by RT-qPCR method after heat shock induced，the effect of inactivation was evaluated by comparing the copy numbers of chloraminated sample and control sample.The results shows that the sensitivity of detection was 900cfu·m L-1；for the detection of chloram ine inactivation，the inactivation of this method was significantly lower than that of plate culturemethod.The RT-qPCR method based on hsp70 mRNA was rapid，specific and highly sensitive，and used to assess the inactivation of pathogenicmicroorganisms in water.

hsp70mRNA；RT-qPCR；E.Coli；detection；inactivation

R123.6

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20160914

2016-03-29

深圳市科技創(chuàng)新計劃基礎(chǔ)研究（學(xué)科布局）（No.JCYJ201602 26092135176）

侯陽陽（1989-），男，河南鶴壁人，碩士生（沈陽建筑大學(xué)與深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院聯(lián)合培養(yǎng)），主要研究方向：水污染控制技術(shù)。

李紹峰（1972-），男，黑龍江佳木斯人，博士，教授，主要研究方向：水污染控制及污水資源化技術(shù)。