么婷婷，辛嘉英,2*，王艷，鄭洛昀，王政洋

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076；2.中國科學院蘭州化學物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅蘭州730000）

植物甾醇酯的酶法合成*

么婷婷1，辛嘉英1,2*，王艷1，鄭洛昀1，王政洋1

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076；2.中國科學院蘭州化學物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅蘭州730000）

以油酸和植物甾醇為反應(yīng)底物，利用脂肪酶催化合成植物甾醇油酸酯。對脂肪酶和反應(yīng)介質(zhì)進行了篩選，同時對影響合成植物甾醇油酸酯反應(yīng)的因素進行了探究，考察了底物摩爾比（油酸甾醇比）、酶添加量（脂肪酶質(zhì)量/底物總質(zhì)量）、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)的影響。在單因素的基礎(chǔ)上，經(jīng)酯化率響應(yīng)曲面實驗優(yōu)化反應(yīng)條件，確定最佳反應(yīng)條件：催化酯化反應(yīng)的酶為柱狀假絲酵母脂肪酶（CRL，Candida rugosa lipase），反應(yīng)介質(zhì)為正己烷，底物摩爾比為3∶1，酶添加量為7.2%，反應(yīng)溫度為45.3℃，反應(yīng)時間為25.3h，驗證試驗酯化率可達72.95%。

脂肪酶；植物甾醇油酸酯；響應(yīng)曲面分析

植物甾醇在植物中存在范圍非常廣泛，是一類以環(huán)戊烷全氫菲（甾核）為骨架的天然醇類化合物，具備許多有實際應(yīng)用意義的生理功能［1,2］。植物甾醇結(jié)構(gòu)與膽固醇相似，在生物體內(nèi)與膽固醇以同樣的方式被吸收，植物甾醇能阻礙膽固醇吸收，使其在腸道中的吸收相應(yīng)下降，從而具有降低血中膽固醇量作用［3,4］。植物甾醇具有類激素、類生長素的功能；有增強免疫力、抗炎、抗衰老、預(yù)防糖尿病的功能；可使肌肉增生，促進傷口愈合，增強毛細血管內(nèi)的循環(huán)；而且對預(yù)防心血管疾病有一定的作用［5,6］。植物甾醇廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品等行業(yè)［7］。但植物甾醇不溶于水，脂溶性也相當有限的缺點限制了其應(yīng)用前景。酯化后的植物甾醇酯不僅大大改善了植物甾醇的脂溶性，而且抑制人體對膽固醇的吸收作用優(yōu)于植物甾醇,降膽固醇效果更好［8］。植物甾醇酯的合成主要有化學法和酶法［9］。酶法更綠色環(huán)保、高效，且反應(yīng)條件溫和。酶法合成植物甾醇酯也是國內(nèi)外研究的熱點［10-13］。

本文以脂肪酶作為催化劑，探究催化植物甾醇與油酸合成植物甾醇油酸酯的酯化反應(yīng)，在單因素的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)曲面法對酯化反應(yīng)進行優(yōu)化研究。

1　實驗部分

1.1材料與試劑

油酸（AR天津市永大化學試劑有限公司）；植物甾醇（浙江大為藥業(yè)有限公司）；柱狀假絲酵母脂肪酶（lipase from Candida rugosa，CRL，Type VII，847U·mg-1，Sigma公司）；固定化南極假絲酵母脂肪酶（immobilized Candida antarctica lipase，Novozym435，Type II，10,000U·g-1丹麥諾維信生物技術(shù)有限公司）；木瓜脂肪酶粗酶（lipase from Carica papaya，CPL廣西南寧天綠生物制品有限公司）；豬胰脂肪酶（lipase from porcine pancreatic，PPL，Type II），30～90U·mg-1Sigma公司）。薄層層析硅膠（青島海洋化工廠）；羧甲基纖維素鈉（天津市嘉興化工有限公司）；正己烷，無水乙醚，冰乙酸，環(huán)己烷，異辛烷，苯均為分析純，天津市永大化學試劑有限公司；Type4?型分子篩（大連催化劑廠）。

1.2主要儀器

KH-2000型薄層色譜掃描儀（上?？瀑R生化科技有限公司）；HZQ-C空氣浴振蕩器（哈爾濱東明醫(yī)療器械廠）；BS210S電子天平（德國Sartorius儀器公司）；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海-恒科學儀器有限公司）。

1.3實驗方法

1.3.1植物甾醇油酸酯的合成方法精確稱取一定摩爾比的油酸和植物甾醇以及一定量的脂肪酶，加入到50mL的具塞三角瓶中，同時加入一定量有機溶劑，1～2粒4?分子篩除水，一定的溫度和時間下，在150r·min-1空氣浴振蕩器（搖床）中進行反應(yīng)。

1.3.2植物甾醇油酸酯的酯化率的測定將硅膠GF254用3.5倍質(zhì)量的1%的羧甲基纖維素鈉水溶液調(diào)成均勻的糊狀，然后倒于60mm×120mm的層析板上，制成厚度約2mm的均勻的薄板，自然晾干后于110℃干燥箱中活化2h，用10μL的微量進樣器取4μL酯化反應(yīng)液點于薄板的底端，用選好的展開劑：正己烷：乙醚：冰乙酸（90∶10∶1，V/V/V）于室溫下層析缸中展開30min，自然晾干，然后用薄層色譜掃描儀進行檢測和數(shù)據(jù)的計算，根據(jù)其峰面積計算出植物甾醇油酸酯的酯化率（%），計算公式如下：

2　結(jié)果與討論

2.1脂肪酶的篩選

底物油酸與植物甾醇的摩爾比3∶1，酶加量為底物總質(zhì)量的7%，正己烷5mL，反應(yīng)溫度45℃，150r·min-1搖床反應(yīng)24h條件下，分別對CRL、N435、CPL和PPL催化油酸與植物甾醇酯化反應(yīng)的活性進行了比較，見圖1。

圖1　脂肪酶對酯化反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of lipase on esterification

不同種類不同來源的脂肪酶對催化底物的特異性也有所不同，由圖1可知，在相同的反應(yīng)條件下，脂肪酶CRL催化合成植物甾醇油酸酯的酯化率最高?？赡苁且驗橹久窩RL對底物的特異性選擇更強，從而催化酯化反應(yīng)效果好，因此，選取脂肪酶CRL作為催化植物甾醇油酸酯合成的酶催化劑。

1.2反應(yīng)體系的篩選

由于反應(yīng)體系不容易混合均勻，所以必須加入適當?shù)娜軇﹣碓龃蠓磻?yīng)物與酶之間的接觸面積，從而提高反應(yīng)效率。

選取異辛烷、正己烷、環(huán)己烷、苯4種極性分別為0.1、0.06、0.1、3的有機溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，底物油酸與植物甾醇的摩爾比3∶1，酶加量為底物總質(zhì)量的7%，反應(yīng)溫度45℃，150r·min-1搖床反應(yīng)24h條件下，分別討論不同log P值的有機溶劑對酯化反應(yīng)的影響。

表1　有機溶劑對酯化反應(yīng)的影響Tab.1 Effect of organic solvents on esterification

由表1可知，以正己烷作為反應(yīng)介質(zhì)時，甾醇酯的酯化率比較高，以環(huán)己烷、異辛烷作為反應(yīng)介質(zhì)時，甾醇酯的酯化率比較低，以苯為反應(yīng)介質(zhì)時，不反應(yīng)。極性小的有機溶劑酯化率高，說明這時酶的催化活性好。這是因為有機溶劑極性越大，對應(yīng)的log P值越小，有機溶劑的親水性就越強，而脂肪酶表面有一層水化層，是酶活性中心的必需水［14］，有機溶劑親水性越強越易與酶表面的水結(jié)合從而奪去酶表面的必需水，導致酶的催化活性受到抑制而降低甚至失活，從而使酯化反應(yīng)的酯化率降低甚至不反應(yīng)。因此，選取極性較低，對酶活性影響較小的正己烷作為酯化反應(yīng)的介質(zhì)。

2.3影響酯化反應(yīng)的因素

2.3.1底物摩爾比對酯化反應(yīng)的影響反應(yīng)底物摩爾比對酯化反應(yīng)酯化率的變化影響較大，由于酯化反應(yīng)是可逆反應(yīng)，因此可提高某一底物的含量使反應(yīng)平衡向生成物方向進行，以提高酯化率。由于油酸價格便宜且容易去除，因此選擇底物油酸過量。在酶添加量為底物總質(zhì)量的7%，正己烷5mL，反應(yīng)溫度45℃，150r·min-1搖床反應(yīng)24h的條件下，研究反應(yīng)底物摩爾比對甾醇酯的合成的影響，見圖2。

圖2　底物摩爾比對酯化反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of substratemolar ratio on esterification

由圖2可知，底物摩爾比在1∶1至3∶1變化時，酯化率逐漸上升，在3∶1時達到最高。這是因為隨著底物油酸量的增加，反應(yīng)平衡向著生成物的方向移動，使得酯化率升高。但繼續(xù)增加油酸的量，酯化率反而降低，這表示油酸過度的添加不利于甾醇酯的生成。這是因為當?shù)孜锬柋冗_到3∶1時，體系中的酶已經(jīng)完全飽和，繼續(xù)增加油酸的量會導致甾醇的相對濃度降低，不利于酯化反應(yīng)的進行，因此油酸與植物甾醇的最優(yōu)摩爾比為3∶1，并用于以后的反應(yīng)。

2.3.2酶添加量對酯化反應(yīng)的影響酶作為一種生物催化劑，在一定的濃度范圍內(nèi)對酯化反應(yīng)的酯化率有顯著影響。在底物摩爾比為3∶1，正己烷5mL，反應(yīng)溫度45℃，150r·min-1搖床反應(yīng)24h的條件下，研究酶添加量對植物甾醇油酸酯的合成的影響，見圖3。

圖3　酶添加量對酯化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of enzyme addition amount on esterification

由圖3可知，酶添加量從2%到8%變化時，隨著酶用量的增加，酯化率成上升趨勢，在8%時達到最高。這是因為酶作為一種催化劑，催化了反應(yīng)向著生成物的方向進行，使得酯化率升高。但隨著酶的量繼續(xù)添加，酯化率反而略有下降。這是可能是因為酶用量過大，造成酶聚集在一起使其與底物接觸面積相對減小，導致酯化率降低。因此，選取酶添加量為底物總質(zhì)量的8%為最優(yōu)，并用于以后的反應(yīng)。

2.3.3反應(yīng)溫度對酯化反應(yīng)的影響酶作為生物催化劑，有其適宜的催化溫度范圍，因此溫度也是影響酶催化反應(yīng)的重要因素之一。在底物摩爾比為3∶1，酶用量為底物總質(zhì)量的8%，正己烷5mL，150r·min-1搖床反應(yīng)24h的條件下，研究反應(yīng)溫度對植物甾醇油酸酯的合成的影響，見圖4。

圖4　反應(yīng)溫度對酯化反應(yīng)的影響Fig.4 Effectof reaction temperature on esterification

由圖4可知，當溫度從30℃至45℃變化時，酯化率呈上升趨勢，在45℃時達到最高。這是因為升高溫度可以使反應(yīng)底物的黏度降低，提高底物的溶解度，減小傳質(zhì)阻力，從而有利于酶與反應(yīng)底物間的相互作用，使得酯化率升高。但當溫度超過45℃時，酯化率下降。可能是因為酶作為生物催化劑，有其適宜的催化溫度范圍，溫度過高則會導致酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失去催化活性。因此，45℃為最佳溫度，并用于以后的反應(yīng)。

圖5　反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)的影響Fig.5 Effectof reaction time on esterification

2.3.4反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)的影響確定最佳的反應(yīng)時間可以避免實驗時間浪費，從而提高工作效率。在底物摩爾比為3∶1，酶用量為底物總質(zhì)量的8%，正己烷5mL，反應(yīng)溫度45℃，150r·min-1搖床反應(yīng)的條件下，研究反應(yīng)時間對植物甾醇油酸酯的合成的影響，見圖5。由圖5可知，反應(yīng)時間從6h到24h變化時，酯化率呈上升趨勢，在24h時達到最高。但24h后，隨著反應(yīng)時間的延長，酯化率呈下降趨勢。這是因為酯化反應(yīng)是一個可逆反應(yīng)，隨著反應(yīng)的進行，產(chǎn)生的水會導致反應(yīng)向反方向進行，使植物甾醇油酸酯逐漸分解為甾醇和油酸，從而使酯化率開始下降。因此，24h為最佳時間。

2.4Candida rugosa脂肪酶催化植物甾醇油酸酯合成的優(yōu)化實驗

2.4.1響應(yīng)曲面因素水平的設(shè)定在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗方法對影響酯化率的因素進行分析及參數(shù)優(yōu)化，各因素及水平見表2。

表2　響應(yīng)曲面因素水平表Tab.2 Factors and levels of RSM

2.4.2響應(yīng)曲面實驗方案及結(jié)果選擇反應(yīng)時間（A）、反應(yīng)溫度（B）、底物摩爾比（C）、酶添加量（D）4個因素，每個因素設(shè)定3個水平，以酯化率（Y）為指標，采用Design-Expert.8.05中心組合試驗Box-Behnken設(shè)計實驗。響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表3。

表3　植物甾醇油酸酯酶法合成響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Tab.3 Design and results of RSM

2.4.3二次回歸模型的方差分析

試驗結(jié)果采用Design-Expert8.05軟件的ANOVA程序進行二次回歸分析，模型P＜0.0001＜0.01，表明本實驗所選用的二次模型是極其顯著的。失擬性檢驗P=0.2555，不顯著，且R2為0.9981，因此該模型擬合程度良好，試驗誤差小。因此證明該回歸模型優(yōu)化反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、底物摩爾比和酶添加量對酯化反應(yīng)的酯化率的影響是可行的。

根據(jù)方程各項方差分析表明，回歸方程的一次項A、B、C、D對酯化率的影響顯著（P＜0.05）；二次項A2、B2、C2、D2對酯化率影響極顯著（P＜0.01）；交互項AC、AD、BC對酯化率影響極顯著（P＜0.01）。

反應(yīng)時間（A）、反應(yīng)溫度（B）、底物摩爾比（C）、酶添加量（D）與酯化率（Y）的二元回歸方程為：

表4　回歸模型的方差分析Tab.4 ANOVA analysis of the quadratic regressionmodel

2.4.4響應(yīng)曲面分析將對酯化反應(yīng)有顯著影響的交互作用AC、AD、BC繪制出相應(yīng)的三維響應(yīng)曲面圖，見圖6～8：

圖6底物摩爾比和反應(yīng)時間等高線及響應(yīng)曲面Fig.6 Contour and response surface of substrate molar ratio and reaction time

圖6顯示在因素B（反應(yīng)溫度）、D（酶添加量）為最優(yōu)條件時，因素A（反應(yīng)時間）、C（底物摩爾比）對酯化率的交互影響。由圖6-b可看出，當A（反應(yīng)時間）保持不變時，隨著C（底物摩爾比）的增加，酯化率逐漸增加，然而當?shù)竭_峰值后酯化率隨之減小；C（底物摩爾比）保持不變時，隨著A（反應(yīng)時間）增加，酯化率逐漸增加，達到峰值后逐漸減小。

圖7酶添加量和反應(yīng)時間等高線及響應(yīng)曲面Fig.7 Contour and response surface of enzyme addition amount and reaction time

圖7顯示在因素B（反應(yīng)溫度）、C（底物摩爾比）為最優(yōu)條件時，因素A（反應(yīng)時間）、D（酶添加量）對酯化率的交互影響。由圖7-b可看出，當A（反應(yīng)時間）保持不變時，隨著D（酶添加量）的增加，酯化率隨酶添加量的增加而增大且增加趨勢越來越緩慢；D（酶添加量）保持不變時，隨著A（反應(yīng)時間）增加，酯化率逐漸增加，達到峰值后逐漸減小。

圖8底物摩爾比和反應(yīng)溫度等高線及響應(yīng)曲面Fig.8 Contour and response surface of substrate molar ratio and reaction temperature

圖8顯示在因素A（反應(yīng)時間）、D（酶添加量）為最優(yōu)條件時，因素B（反應(yīng)溫度）、C（底物摩爾比）對酯化率的交互影響。由圖8-b可看出，當B（反應(yīng)溫度）保持不變時，隨著C（底物摩爾比）的增加，酯化率逐漸增加，然而當?shù)竭_峰值后響應(yīng)值隨之減?。籆（底物摩爾比）保持不變，隨著B（反應(yīng)溫度）增加，酯化率逐漸增加，達到峰值后酯化率逐漸減小。

通過Design-Expert8.05軟件對回歸方程進行分析，得到酯化率的最佳條件為反應(yīng)時間25.31h，反應(yīng)溫度45.30℃，底物摩爾比3.03∶1，酶添加量7.22%，此時酯化率理論最大值為73.49%。

采用上述優(yōu)化后的條件，即反應(yīng)時間25.3h，反應(yīng)溫度45.3℃，底物摩爾比3∶1，酶添加量7.2%，進行3次平行驗證實驗，得到的酯化率平均值為72.95%，說明試驗具有良好的重復(fù)性。因此，采用此響應(yīng)面法優(yōu)化酯化反應(yīng)因素比較準確可靠，具有實際應(yīng)用價值。

3　結(jié)論

本文研究了不同脂肪酶對植物甾醇油酸酯合成的催化效果，篩選了適合酯化反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)，考察了影響酯化反應(yīng)的因素，在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗分析，得到合成植物甾醇油酸酯的最優(yōu)反應(yīng)參數(shù)：以脂肪酶CRL作為催化劑，以正己烷作為反應(yīng)介質(zhì)，底物摩爾比為3∶1，酶添加量為7.2%，反應(yīng)溫度為45.3℃，反應(yīng)時間為25.3h，最優(yōu)條件為下酯化率可達72.95%。

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Synthesis of phytosterol esters catalyzed by lipase*

YAO Ting-ting1，XIN Jia-ying1，2*，WANG Yan1，ZHENG Luo-yun1，WANG Zheng-yang1
（1.Key Laboratory for Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；2.State Key Laboratory for Oxo Synthesis and Selective Oxidation，Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China）

With oleic acid and plant cholesterol as substrate，phytosterol oleic acid esterswas synthesized by lipase-catalyzed esterification.The lipase and reactionmedium were screened，and the effects of substratemolar ratio（molar ratio of oleic acid to phytosterols），enzyme addition amount，reaction temperature，reaction time on esterification were studied.Based on single factor experiment，reaction conditionswere optimized by response surface experiment，a quadratic regression equation of esterification was established.The optimal synthesis conditions were as follows：esterification was catalyzed by Candida rugosa lipase，n-hexane as reactionmedium，substratemolar ratio of 3∶1，enzyme addition amount of 7.2%，reaction temperature of 45.3℃and reaction time of 25.3h.Under the optimal conditions，the esterification conversion could reach up to 72.95%.

lipase；phytosterol oleic acid esters；response surfacemethodology（RSM）

O643.32

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20160904

2016-07-06

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項目（No.GC13C111）

么婷婷（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程專業(yè)。

導師簡介：辛嘉英（1966-），男，博士，龍江學者特聘教授，博士生導師。