鄭 張，翟華濤，盧 溶，丁建云，馬小榮，蒙曉嫻，張 艷，林 艷，李舂龍

（北方民族大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

百里香多糖提取工藝及抗氧化性研究

鄭 張，翟華濤，盧 溶，丁建云，馬小榮，蒙曉嫻，張 艷，林 艷，李舂龍

（北方民族大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

以百里香為原料提取多糖，多糖的含量采用硫酸-苯酚法測(cè)定。通過單因素法和正交實(shí)驗(yàn)的方法確定百里香多糖的最佳提取條件。單因素分別選取了時(shí)間、溫度、物料比，確定了對(duì)百里香多糖提取的最優(yōu)單因素條件，進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)，確定了綜合因素。確定利用弱酸弱堿進(jìn)行提取優(yōu)化，再提取純化多糖，進(jìn)行抗氧化性研究。

百里香；多糖；提取

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，中國(guó)人的生活水平有了很大的改善，但是疾病也隨之增加，因此人們對(duì)于自身健康的重視程度愈加強(qiáng)烈。天然植物中的某些具有活性的物質(zhì)具有很好的治療、預(yù)防疾病的效果，這給我國(guó)的中草藥市場(chǎng)帶來了前所未有的機(jī)遇。

植物多糖，有一部分是沒有活性的，而有一小部分通過糖苷鍵鏈接小分子蛋白質(zhì)的是具有活性的（分別為氧苷、硫苷、氮苷、碳苷）。20世紀(jì)60年代初期，研究者逐漸發(fā)現(xiàn)多糖類的活性物質(zhì)有多方面的生理活性。最初知道多糖對(duì)腫瘤、心血管疾病和抗衰老具有少量的療效作用，后來，大量的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，多糖類主要作用于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，影響免疫系統(tǒng)，并且還會(huì)影響核酸、蛋白質(zhì)的合成，以及對(duì)于抗體的生成有一定的促進(jìn)作用。因此多糖類的有效成分能非特異性地提高人體的免疫功能，實(shí)現(xiàn)了用作免疫增強(qiáng)藥的可能。

百里香，屬唇形科多年生半罐木草本植物，分布于我國(guó)的河北、內(nèi)蒙、山西、陜西、甘肅、青海、寧夏等地，資源較為豐富。有研究者用生物阻抗法測(cè)定了百里香植物揮發(fā)油的抗氧化活性［1］。本研究以寧夏固原張易鎮(zhèn)地椒草為原料，使用硫酸-苯酚法測(cè)量多糖的含量［2-3］，探究時(shí)間、溫度對(duì)百里香多糖提取的影響，并分別使用弱酸（檸檬酸、乙酸）和弱堿（碳酸氫鈉）及乙醇，進(jìn)行提取結(jié)果的優(yōu)化，以期為百里香多糖的生產(chǎn)提供部分依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，XFB-500高速中藥粉碎機(jī)，YP3102電子天平，722S可見分光光度計(jì)，SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵。

1.2 試劑

地椒草：寧夏固原張易鎮(zhèn)提供，在實(shí)驗(yàn)室粉碎磨粉，全粉過0.175mm篩。

葡萄糖、濃硫酸、苯酚、碳酸氫鈉、乙醇、檸檬酸、乙酸均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 原料的制備

用粉碎機(jī)將百里香粉碎，過0.175mm篩，放置備用。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于試管中備用，并且分別補(bǔ)充去離子水至2.0mL，精密加入新制5%苯酚溶液1mL，搖勻后，馬上精密量取濃硫酸5mL，搖勻，放置40min，以相對(duì)應(yīng)的試劑為空白組，利用紫外-可見分光光度計(jì)（已經(jīng)預(yù)熱），設(shè)置490nm的波長(zhǎng)測(cè)定對(duì)照品的吸光度，

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 提取實(shí)驗(yàn)

2.3.1 提取時(shí)間

取0.6g百里香用60mL去離子水提取，溫度為45℃。分別在10min、20min、30min、40min、50min、60min條件下提取，用硫酸苯酚法測(cè)定多糖含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。隨著時(shí)間逐漸增加，溶液的吸光度不斷上升，但是在40min后下降，說明多糖在40min左右，提取率是最高的。

圖2 提取時(shí)間對(duì)百里香多糖的影響

2.3.2 提取溫度

取0.6g百里香用60mL去離子水提取，分別在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃條件下提取10min，測(cè)量多糖含量，結(jié)果見圖3。隨著溫度的增加，溶液的吸光度不斷上升，但是在40℃之后，多糖得率下降，說明多糖在40℃左右提取率是最高的。

2.3.3 料液比

取0.5、0.6、0.7g的百里香，在25℃、40min條件下進(jìn)行提取，測(cè)量多糖含量，結(jié)果見圖4。隨著百里香的不斷加入，吸光度逐漸增大，在料液比為0.7的條件下最大。

圖3 溫度對(duì)百里香多糖的影響

圖4 料液比對(duì)百里香多糖的影響

3.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)，確定去離子水提取的正交試驗(yàn)的因素和水平表如表1所示。根據(jù)選擇的因素和水平做正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，當(dāng)浸提時(shí)間為45min，浸提溫度45℃，料液比為0.7時(shí)，多糖提取量最大。并且根據(jù)R值可知影響大小為料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間。

3 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

3.1 使用碳酸氫鈉

在40℃、40min下，稱取0.6g百里香，以1mL為單位加入碳酸氫鈉飽和溶液，測(cè)量碳酸氫鈉用量分別為1mL、2mL、3mL、4mL、5mL時(shí)的多糖含量，結(jié)果見圖5。

圖5 碳酸氫鈉用量對(duì)百里香多糖的影響

由圖5可知，隨著碳酸氫鈉的加入量增加，多糖的得率并沒有很大的變化，說明碳酸氫鈉的加入量對(duì)多糖的提取無影響，但是與其他的優(yōu)化條件相比，得率最高，有可能是碳酸氫鈉與細(xì)胞壁結(jié)合，改變了細(xì)胞的整體結(jié)構(gòu)，沒有傳質(zhì)阻力，使得多糖得率最高。但是與去離子水的最優(yōu)結(jié)果比較，可知去離子水體系多糖得率高，因此不是最優(yōu)提取體系。

3.2 使用乙酸

在40℃、40min條件下，稱取0.6g百里香，以1mL為單位加入乙酸，測(cè)量乙酸用量分別為1mL、2mL、3mL、4mL、5mL時(shí)的多糖含量，結(jié)果見圖6。

圖6 乙酸用量對(duì)百里香多糖的影響

由圖6可知，乙酸用量在4mL的時(shí)候效果最好，與只有去離子水的體系結(jié)果比較可知，提取效果比去離子水的效果好。因此可以推出，使用乙酸可以提高多糖的得率，因?yàn)橐宜峋哂幸欢ǖ臉O性，有助于多糖的提取，是最優(yōu)體系。

3.3 使用乙醇

在40℃、40min條件下，稱取0.6g百里香，以1mL為單位加入乙醇，測(cè)量乙醇用量分別為1mL、2mL、3mL、4mL、5mL時(shí)的多糖含量，結(jié)果見圖7。

圖7 乙醇用量對(duì)百里香多糖的影響

由圖7可知，1mL、2mL、3mL的乙醇用量效果相差不大，相對(duì)于4mL、5mL、6mL的效果要好，但是沒有去離子水的效果好。因此乙醇提取不是最優(yōu)體系。

3.4 使用檸檬酸

在40℃、40min條件下，稱取0.6g百里香，以1mL為單位加入檸檬酸，測(cè)量檸檬酸用量分別為1mL、2mL、3mL、4mL、5mL時(shí)的多糖含量。用同一種方法測(cè)定時(shí)，加入1mL、2mL的檸檬酸，吸光度為0.153和0.340，可以推斷出效果不理想。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及產(chǎn)率計(jì)算

4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

多糖含量及多糖提取率分別按下面兩個(gè)公式進(jìn)行計(jì)算。

其中， 0.9為葡萄糖換算成多糖的系數(shù)。

在溫度、時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)中，在40℃、40min、料液比0.7的條件下，多糖的提取率是最高的，分別是5.27%、5.89%、5.20%。在正交實(shí)驗(yàn)中R值越大，對(duì)百里香多糖提取率的影響就越大，所以各因素對(duì)地椒草提取的影響大小為料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間，通過正交實(shí)驗(yàn)選取45min、45℃、物料比0.7為最優(yōu)結(jié)果。

4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

為了驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在正交實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)結(jié)果下進(jìn)行百里香多糖提取的驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，多糖提取率分別為5.83%、5.77%、5.93%，平均提取率為5.84%，說明優(yōu)化條件的可行性和重現(xiàn)性較好，工藝穩(wěn)定，適合用于百里香多糖的提取。

5 純化多糖及抗氧性研究

5.1 純化多糖

將用乙醇脫脂，在80℃、1h的條件下處理后的百里香0.6g，加入60mL去離子水，在40℃、40min的條件下提取，得濾液，冷卻至室溫，加入乙醇至50%的體系，放置冰箱，靜置一夜，抽濾，再加入乙醇至70%的體系，放置冰箱，靜置一夜，抽濾，取濾液，用丙酮與濾液（4∶1）充分震蕩，靜置，取下層液，濃縮干燥，得多糖［4］。

5.2 抗氧化性研究

Fenton反應(yīng)可以產(chǎn)生·OH自由基，在體系中，加入水楊酸（水楊酸可以結(jié)合·OH），產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm下具有最大吸收峰。加入多糖后，則多糖會(huì)與·OH競(jìng)爭(zhēng)水楊酸，導(dǎo)致吸光度下降［5］。

取純化后的多糖，分別配成濃度為0.1mg·mL-1、0.2mg·mL-1、0.3mg·mL-1的溶液待用。反應(yīng)體系中含 9mmol·L-1的水楊酸溶液、9mmol·L-1的FeSO4溶液及不同濃度的多糖溶液，水浴加熱至37℃，再加入8.8mmol·L-1的雙氧水1mL，啟動(dòng)整個(gè)反應(yīng)。在不同時(shí)間（10min、20min、30min、40min）取適量溶液進(jìn)行吸光度測(cè)量，結(jié)果如圖8所示。可知在25min時(shí)，反應(yīng)停止，吸光度在10～25min是下降的，并且趨勢(shì)明顯，在25min后，吸光度不變，說明反應(yīng)停止。

6 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的熱水提取，測(cè)定了時(shí)間、溫度、料液比對(duì)百里香多糖提取的影響。通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了最佳工藝條件，在浸提時(shí)間45min、浸提溫度45℃、料液比為0.7時(shí)提取效率是最大的，同時(shí)，使用弱酸、弱堿對(duì)百里香多糖提取進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究。通過優(yōu)化提取體系，可以增加多糖的提取率，為以后百里香多糖工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

圖8 抗氧化性研究

百里香多糖具有抗氧化能力，但是由于是體外進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，沒有從人體生理方面進(jìn)行研究，百里香多糖的體內(nèi)生物功效仍有待研究［6］。另外對(duì)于百里香多糖的生理功能可以結(jié)合藥劑學(xué)來分析，對(duì)于其多糖結(jié)構(gòu)可以將其糖鏈斷開，考慮多糖上面的小分子蛋白，將其制成皮上吸收劑，也可以制成栓劑，這種使用方式是對(duì)天然藥物使用的一種革新。

［1］ 丁驍.百里香提取物抗油脂氧化活性研究［J］.糧油加工與食品機(jī)械，2004（4）：37-39.

［2］ 陳群，劉家昌.人參多糖、黃芪多糖、枸杞多糖的研究進(jìn)展［J］.淮南師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2001 （1）：39-41.

［3］ 徐曉飛，陳健.多糖含量測(cè)定的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2009，30（20）：443-448.

［4］ 張穎，潘俊羽.枇杷葉多糖水提醇沉法的提取條件優(yōu)化［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：161-163.

［5］ 馬超，劉杰鳳，周天，等.黃皮果多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（8）：290-292.

［6］ 劉航，國(guó)旭丹，馬雨潔，等.超聲波輔助提取苦蕎麥多糖工藝優(yōu)化及其體外抗氧化研究［J］.食品科學(xué)，2013，34（14）：45-50.

Extraction and Optimization of Polysaccharide fromThyme and its Antioxidant Research

ZHENG Zhang， ZHAI Hua-tao， LU Rong， DING Jian-yun， MA Xiao-rong， MENG Xiao-xian， ZHANG Yan，LIN Yan， LI Chong-long
（School of Chemistry and Chemical Engineering， Beifang University of Nationalities， Yinchuan 750021， China）

Polysaccharide was extracted from thyme， and then was determined by sulfuric acid-phenol method.The optimum extraction conditions were obtained by single factor method and orthogonal test.Time， temperature and material ratio was selected as single factor， the optimal single factor of extraction was determined.The orthogonal test was carried out and the composite factors were obtained.Polysaccharide was extracted from thyme with weak acid and weak base.After purification， the antioxidant research of polysaccharide was carried out.

thyme； polysaccharides； extraction

R 284.2

A

1671-9905（2016）09-0014-04

2015年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201511407009）

李舂龍，碩士，助理研究員，主要從事小分子化合物的合成及化學(xué)工藝研究，電話：09512068121，E-mail：lililong0@126.com

2016-07-01并且分別用濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，測(cè)定并且繪制出標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度曲線，結(jié)果見圖1。