高文斌，曹 超，李進(jìn)軍，劉 巍

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院普通外科，長(zhǎng)沙 410008）

PHLDA3在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

高文斌，曹 超，李進(jìn)軍，劉 巍

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院普通外科，長(zhǎng)沙 410008）

目的：探討PHLDA3在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)行為的影響。方法：通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化檢測(cè)肝細(xì)胞癌組織中PHLDA3 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，分析PHLDA3的表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：肝細(xì)胞癌組織中PHLDA3 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯低于鄰近非瘤肝組織，PHLDA3的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者的AFP、結(jié)節(jié)數(shù)目、血管侵犯、TNM分期和BCLC分期緊密相關(guān)。結(jié)論：PHLDA3在肝細(xì)胞癌中低表達(dá)，與肝細(xì)胞癌的不良臨床病理特征密切相關(guān)，可能是肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的抑制因素。

PHLDA3基因；肝細(xì)胞癌；臨床病理特征

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內(nèi)的常見(jiàn)惡性腫瘤之一［1］。雖然醫(yī)療水平不斷進(jìn)步，但是由于HCC的高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，患者的總體生存仍然很差。HCC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟多因素、復(fù)雜連續(xù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程［2］。研究表明，在HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過(guò)程中與p53、PTEN等抑癌基因的失活或突變有重要關(guān)系［3］。最新的研究發(fā)現(xiàn)PHLDA3與p53存在密切聯(lián)系，在管理細(xì)胞的增殖與凋亡方面發(fā)揮重要作用［4］。然而目前尚無(wú)報(bào)道PHLDA3是否在HCC的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，本研究旨在對(duì)此進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本和臨床資料 收集2012年1月～2013 年12月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院行肝切除術(shù)的105例石蠟包埋HCC組織標(biāo)本。其中25例病人肝切除后，立即在無(wú)菌條件下切取新鮮HCC組織和距離腫瘤邊緣1 cm相應(yīng)的鄰近非瘤肝組織（Adjacent nontumorous liver tissue，ANLT）并置于液氮中保存。全部病人均經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查確診為HCC。收集所有病人臨床資料，其中男性82例，女性23例，平均年齡47.9±9.2歲。

1.2 組織RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 研磨好的新鮮HCC組織及ANLT標(biāo)本，使用Trizol裂解液裂解，提取出來(lái)后用無(wú)RNA酶水溶解，置于-80℃冰箱中保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物，交由上海生工生物技術(shù)公司合成合成。PHLDA3的引物為：上游F-CCACATCTACTTCACGCTGGT，下游R-ATGGCCTGCTGGTTCTTG。產(chǎn)物的大小126bp。按照羅氏試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在ABI7300實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行，具體的實(shí)驗(yàn)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 sec，60 ℃退火60sec，72 ℃延伸30sec，共40個(gè)循環(huán)，72℃10 min。每個(gè)樣本重復(fù)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。使用管家基因GAPDH基因作為內(nèi)參，檢測(cè)結(jié)果采用目的基因與內(nèi)參照的比值表示，分析PHLDA3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 免疫組織化學(xué) 使用5 μm 厚切片常規(guī)脫蠟脫水，經(jīng)檸檬酸抗原修復(fù)液抗原熱修復(fù)，接著山羊血清封閉，然后依次滴加一抗4℃過(guò)夜，生物素化二抗常溫孵育40min，DAB 液顯色，蘇木精復(fù)染后中性樹(shù)脂封片，鏡下閱片。結(jié)果分析依據(jù)Shimizu評(píng)分方法。按染色細(xì)胞數(shù)目的評(píng)分：無(wú)：0分，＜1/3數(shù)目：1分，＜2/3數(shù)目：2分，＞2/3數(shù)目：3分。著色強(qiáng)度的評(píng)分：沒(méi)有著色：0分，淺著色：1分，明顯著色：2分。兩者評(píng)分相加等于0分為（-），2分（±），3分（+），4分（++），5分（+++）。大于2分定為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。分類(lèi)變量通過(guò)χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切檢驗(yàn)比較。P＜0.05為說(shuō)明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHLDA3在HCC組織中mRNA和蛋白的表達(dá)情況 運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢查25對(duì)HCC組織及相匹配的ANLT中PHLDA3 mRNA的表達(dá)情況。將PHLDA3在ANLT中mRNA的表達(dá)量設(shè)為1，計(jì)算PHLDA3 mRNA在HCC組織中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，PHLDA3 mRNA在HCC組織中的表達(dá)量平均值為0.449±0.212，即ANLT中PHLDA3 mRNA的表達(dá)水平是HCC組織中的2.22倍，PHLDA3在HCC組織中mRNA的表達(dá)顯著低于ANLT（P＜0.05，圖1）。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)HCC組織及相匹配的ANLT中PHLDA3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，PHLDA3蛋白主要表達(dá)于ANLT的胞漿和胞膜細(xì)胞，而HCC組織中的陽(yáng)性細(xì)胞很少見(jiàn)（圖2）。HCC組織中PHLDA3的陽(yáng)性表達(dá)率為44.8%（47/105），ANLT中PHLDA3的陽(yáng)性表達(dá)率為85.7%（90/105），兩者相比差異有顯著性（P＜0.05，表1）。

表1 PHLDA3蛋白在HCC組織和ANLT中的陽(yáng)性表達(dá)率比較

2.2 HCC中PHLDA3的表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系 分析105例HCC組織中PHLDA3的表達(dá)水平與其臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，PHLDA3的表達(dá)水平與HCC患者的AFP、結(jié)節(jié)數(shù)目、血管侵犯、TNM分期和BCLC分期緊密相關(guān)（P＜0.05）。而與HCC患者的性別、年齡、乙肝表面抗原、肝硬化、腫瘤大小、腫瘤包膜、Child-Puhg分級(jí)和Edmondson-Steiner分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性（表2）。

圖1 PHLDA3在HCC組織和ANLT中mRNA的表達(dá)

圖2 PHLDA3蛋白在HCC組織和ANLT中的表達(dá)（免疫組化，400×）

表2 肝細(xì)胞癌組織中PHLDA3的表達(dá)與其臨床病例特征的關(guān)系

3 討論

HCC嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的生命健康，研究和闡明HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對(duì)治療HCC患者和提高HCC患者的生存時(shí)間具有重要意義。目前關(guān)于抑癌基因和癌基因在HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的地位已被大家熟知，越來(lái)越多的抑癌基因和癌基因也被不斷發(fā)現(xiàn)。PHLDA3基因是最新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)的基因，已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)PHLDA3是胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤進(jìn)展中的一個(gè)重要的抑癌基因［5］。然而，有關(guān)PHLDA3在HCC中的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文驗(yàn)證了PHLDA3 在HCC組織中mRNA和蛋白的表達(dá)情況，分析了HCC組織中PHLDA3的表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系，這對(duì)闡明HCC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移潛在機(jī)制有重要提示意義。

結(jié)果顯示，PHLDA3在mRNA和蛋白水平在HCC組織中均呈低表達(dá)而在ANLT中高表達(dá)，這提示PHLDA3可能是HCC的一個(gè)抑癌基因。Katarzyna等［6］的研究發(fā)現(xiàn)PHLDA3 是p53基因靶向的下游基因，能夠通過(guò)阻斷AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而腫瘤細(xì)胞在侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程中要能避免細(xì)胞凋亡才能成功［7］，這可能是PHLDA3作為HCC抑制因子的潛在機(jī)制。本研究還發(fā)現(xiàn)，PHLDA3的表達(dá)水平與HCC患者的AFP、結(jié)節(jié)數(shù)目、血管侵犯、TNM分期和BCLC分期密切相關(guān)。AFP是目前HCC的最重要的腫瘤標(biāo)志物，在HCC的診斷和監(jiān)測(cè)中都發(fā)揮不可替代的作用［8］。腫瘤的結(jié)節(jié)數(shù)目、血管侵犯都已經(jīng)有大量研究表明是HCC侵襲轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志［9，10］。TNM分期和BCLC分期是國(guó)際上HCC分期系統(tǒng)中認(rèn)可度最高，以及運(yùn)用最為廣泛［11，12］。這些都提示著PHLDA3可能在HCC的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力中發(fā)揮著重要的抑制作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)PHLDA3在HCC中低表達(dá)，且其mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平存在一致性。更重要的是發(fā)現(xiàn)PHLDA3的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌的不良臨床病理特征密切相關(guān)，可能是肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的抑制因素。本研究提示PHLDA3可能是HCC新的分子標(biāo)志物，進(jìn)一步研究PHLDA3在HCC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，將為HCC的診斷治療和判斷預(yù)后提供重要幫助。

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The clinical significance and the expression of PHLDA3 in hepatocellular carcinoma

Gao Wen-bin， Cao Chao， Li Jin-Jun， Liu Wei
（Department of Surgery， Xiangya Hospital of Central South University， Changsha 410008， China）

Objective To investigate the expression of PHLDA3 in hepatocellular carcinoma and the impacts on biological behavior of hepatocellular carcinoma. Methods The expression levels of PHLDA3 mRNA and protein in hepatocellular carcinoma were detected via real-time fluorescent quantitative PCR and Immunohistochemical methods. The relationship between expression levels of PHLDA3 and Clinicopathologic features of hepatocellular carcinoma were analyzed. Results The expression of PHLDA3 mRNA and protein in hepatocellular carcinoma tissues were both significantly lower than in the adjacent nontumor liver tissue. The expression level of PHLDA3 were closely related with the AFP， nodule number， vascular invasion， TNM staging and BCLC staging in the patients with hepatocellular carcinoma. Conclusion The expression of PHLDA3 in hepatocellular carcinoma was low， and were closely related with adverse clinical pathological features in hepatocellular carcinoma patients，PHLDA3 may be the inhibiting factor for the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma.

PHLDA3 gene； hepatocellular carcinoma； clinicopathologic features

R735.7

A

1673-016X（2016）04-0123-03

2016-03-21

高文斌，E-mail：gaowenbinxy@163.com