王婉君， 馬 偉*， 孫登明

(淮北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽淮北 235000)

蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔者，是藥物發(fā)揮藥效的重要載體和靶分子，它能與進入體內(nèi)的藥物小分子迅速的結(jié)合并達到動態(tài)平衡，從而發(fā)揮藥物的生物學(xué)功效[1,2]，因此研究具有藥理活性的小分子與蛋白質(zhì)的相互作用，對于解析藥物發(fā)揮藥效的作用機理，揭示藥物藥效的實質(zhì)內(nèi)涵具有重要的意義，同時也是藥物動力學(xué)及臨床藥理學(xué)的重要內(nèi)容。當前藥物小分子和牛血清白蛋白相互作用的研究已見報道[3,4]，但用電化學(xué)方法和熒光光譜法同時研究小分子與蛋白質(zhì)的作用機制和測定方法報道較少。

異煙肼(INH)又稱4-吡啶甲酰肼，是異煙酸的酰肼，對結(jié)核桿菌有抑制和殺滅作用，其生物膜穿透性好，被列為首選抗結(jié)核藥物[5]。本文用自制的L-天冬氨酸修飾電極(PLA/GCE)，用循環(huán)伏安法研究了INH與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，測定了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)，并與熒光光譜法進行了比較。同時INH與BSA的作用具有定量關(guān)系，本文研究了測定的最佳條件，利用熒光光譜法和電化學(xué)方法對INH和BSA進行了測定，獲得了滿意的結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

BAS100/W電化學(xué)分析系統(tǒng)(美國，BAS公司)；FP-6500型熒光光譜儀(日本，島津公司)；pHS-3C型精密酸度計(上海康儀儀器有限公司)。電化學(xué)實驗采用三電極體系：自制聚L-天冬氨酸修飾電極(PLA/GCE)[6]為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲為輔助電極。

BSA(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)儲備液：2.0×10-4mol/L，按常規(guī)配制，在4 ℃左右保存，使用時再稀釋至所需濃度；INH儲備液：1.0×10-2mol/L，使用時再稀釋至所需濃度；L-天冬氨酸溶液：5.0×10-3mol/L；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)；其它試劑均為分析純。水為二次石英亞沸蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1電化學(xué)法取pH=7.0的PBS 2.0 mL，1.0×10-3mol/L INH溶液5.0 mL，加入不同濃度的BSA溶液，以水定容于10 mL容量瓶中，搖勻，靜置10 s后倒入電解池。在溫度298 K條件下，測量INH溶液、INH和BSA混合溶液的循環(huán)掃描伏安(CV)圖。

1.2.2熒光光譜法在10 mL比色管中，加入pH=7.0的PBS 2.0 mL，濃度為2.0×10-4mol/L BSA溶液1.0 mL，再加入不同濃度的INH溶液，以水定容，搖勻，靜置30 min。于溫度298 K下，在熒光光度計上記錄286～500 nm波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜(λex=285 nm，λem=343 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA與INH相互作用的CV圖和熒光猝滅光譜圖

INH和INH-BSA體系的循環(huán)伏安圖見圖1。INH在聚L-天冬氨酸修飾電極上產(chǎn)生一個靈敏的氧化峰，加入BSA后INH的峰電流明顯降低，峰電位左移，表明兩者之間發(fā)生了相互作用。

由于色氨酸和酪氨酸殘基等的存在使蛋白質(zhì)能發(fā)出較強的熒光。由BSA和INH相互作用的熒光光譜圖(圖2)可以看出，在343 nm處有熒光最大發(fā)射峰，固定BSA的濃度，BSA的內(nèi)源熒光強度隨著INH濃度的增加逐漸降低，表明INH能猝滅BSA的內(nèi)源熒光，兩者之間發(fā)生了相互作用。

圖1 異煙肼與牛血清白蛋白相互作用的循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammograms of BSA in the presence of INH1.INH；2.INH-BSA；cINH=5.0×10-4 mol/L；cBSA=2.0×10-5 mol/L；t=5 s；v=0.12 V/s；pH=7.0.

圖2 異煙肼與牛血清白蛋白相互作用的熒光猝滅光譜圖Fig.2 Fluorescence quenching of BSA in the presence of INH cBSA=2.0×10-5 mol/L;cINH(1-10)=0，5.0×10-5，1.0×10-4，1.5×10-4，2.0×10-4，2.5×10-4，3.0×10-4，3.5×10-4，4.0×10-4，4.5×10-4 mol/L;pH=7.0.

2.2 INH與BSA相互作用的光電化學(xué)機理

2.2.1電化學(xué)機理采用循環(huán)伏安法，改變底液的酸度進行測定，結(jié)果見圖3。它表明，隨著pH值的增加，INH與INH-BSA體系中氧化峰和還原峰電位均逐漸負移，峰電位與pH呈良好的線性關(guān)系，INH：Epa(V)=0.6307-0.05075pH，R=0.9977，斜率為50.75 mV/pH，接近59 mV/pH，說明INH在電極上發(fā)生了等電子等質(zhì)子反應(yīng)，氧化還原峰為INH分子苯環(huán)上的鄰羥基氧化所致；INH-BSA：Epa(V)=0.6341-0.05037pH，R=0.9986，斜率為50.37 mV/pH，比INH的斜率減小。

圖3 (A)異煙肼在修飾電極上隨pH的變化的CV曲線;(B)峰電位與pH的關(guān)系曲線；(C)異煙肼-牛血清白蛋白在修飾電極隨pH的變化的CV曲線;(D)峰電位與酸度的關(guān)系曲線Fig.3 (A)Cyclic voltammograms of INH at modified electrode at different solution pH;(B) The relationship between the peak potential and pH；(C) Cyclic voltammograms of INH-BSA at modified electrode at different solution pH;(D) The relationship between the peak potential and pH pH(from 1 to 17):2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0;scan rate:120 mV/s；cINH=5.0×10-4 mol/L，cBSA=2.0×10-5 mol/L，t=5 s.

假定INH與BSA只形成一種簡單的化合物BSA-mINH，而結(jié)合常數(shù)(β)和結(jié)合位點數(shù)(m)可根據(jù)下式[8]求得：

lg[△I/(△Imax-△I)]=lgβ+mlg[Q]

(1)

式中，△Imax表示加入BSA前后INH峰電流的最大差值。作lg[△I/(△Imax-△I)]～lg[Q]的關(guān)系圖，其線性方程為：lg[△I/(△Imax-△I)]=4.189+1.137lg[Q]，R=0.9970。求得m=1.137，β=1.544×104L/mol。

2.2.2熒光猝滅機理熒光猝滅過程分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅[9]。靜態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的基態(tài)分子之間的相互作用，其猝滅過程遵循Stern-Volmer方程：

F0/F=1+Kqτo[Q]=1+KSV[Q]

(2)

上式中，F(xiàn)o是未加入猝滅劑時的熒光強度；F是加入猝滅劑后的熒光強度；Kq是雙分子猝滅過程速率常數(shù)，KSV是Stern-Volmer動態(tài)猝滅常數(shù)。而[Q]則是猝滅劑的濃度，τo是猝滅劑不存在的條件下生物大分子的平均壽命，通常生物大分子的熒光壽命大約為10-8s。

由實驗結(jié)果得出，INH與BSA相互作用的Stern-Volmer方程曲線是一條直線。它們顯示出良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：F0/F=1+4.083×103[Q]，R=0.9966。方程對應(yīng)的斜率為Stern-Volmer方程曲線的猝滅常數(shù)KSV，即KSV=4.083×103L/mol。由KSV=Kqτo，可以求得猝滅過程的速率常數(shù)Kq=4.083×1011L/(mol·s)，遠大于各類淬滅劑對生物大分子的最大擴散常數(shù)2.00×1010L/(mol·s)，因此INH對BSA的熒光淬滅以靜態(tài)猝滅為主。

因為INH對BSA是靜態(tài)猝滅過程，所以可用對數(shù)方程來計算二者的結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點數(shù)n[10]:

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q]

(3)

式中，F(xiàn)0和F分別是不存在和存在猝滅劑時的熒光強度，K為蛋白質(zhì)和猝滅劑的結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點數(shù)，[Q]是猝滅劑的濃度。

以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖為一直線，其線性方程為：lg[(F0-F)/F]=4.170+1.177lg[Q]，R=0.9991；則K=1.479×104L/mol，n=1.177。與電化學(xué)方法基本一致。

2.2.3熱力學(xué)函數(shù)的變化及作用力類型的確定小分子與生物大分子的相互作用力類型包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力[11,12]，根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)參數(shù)焓變△H和熵變△S的相對大小，可以判斷出藥物與蛋白質(zhì)相結(jié)合的主要作用力類型。根據(jù)298 K、308 K兩個溫度下的結(jié)合常數(shù)可以計算出INH和BSA相互作用的熱力學(xué)函數(shù)值，結(jié)果列于表1。根據(jù)實驗結(jié)果298 K、308 K時△H<0，且△S>0。因此可以推測在該溫度范圍內(nèi)，該體系中INH和BSA之間的作用力主要是靜電作用力和疏水作用力。

表1 不同溫度下INH與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.3 測定INH和BSA的最佳條件

實驗表明，電化學(xué)線性掃描伏安法測定INH-BSA的最佳條件為：pH=3.0的PBS，用量為2.0 mL；掃描電位范圍為-0.3～0.7 V；掃描速率為0.12 V/s。熒光光譜法測定INH-BSA的最佳條件為：pH=7.0的PBS，用量為2.0 mL；激發(fā)波長為285 nm；發(fā)射波長為343 nm；放置時間15 min。在最佳條件下，分別用熒光光譜法(固定BSA濃度為2.0×10-5mol/L)、電化學(xué)循環(huán)伏安法(固定INH濃度為5.0×10-4mol/L)對INH-BSA進行了測定，測定結(jié)果見表2。

表2 工作曲線(n=8)

2.4 干擾試驗

采用熒光光譜法對10 mL混合后濃度為5.0×10-4mol/L的INH，及2.0×10-5mol/L的BSA溶液進行測定，允許誤差在±5%以內(nèi)，共存物質(zhì)允許量(mg)為：K+、Na+(4.0),Ba2+、Pb2+(1.0),Fe3+(0.5),Mg2+、Mn2+(0.3),Ca2+、Zn2+、Al3+(0.2),Cu2+、葡萄糖(0.1)。

采用循環(huán)伏安法對混合后濃度為5.0×10-4mol/L的INH，及2.0×10-5mol/L的BSA進行測定，共存物質(zhì)的允許量(mg)為：Na+、K+、Na+、Mg2+、Al3+、Ca2+、Mn2+、Ba2+、Co2+、葡萄糖(≥1.0 mg，未做最高限)，F(xiàn)e3+(0.3)，Pb2+(0.5)，半胱氨酸、Cu2+(0.1)。

2.5 樣品分析

將一定量異煙肼片溶解于100 mL容量瓶中，配制一定濃度的溶液，取5 mL的異煙肼樣品溶液并加入2 mL BSA、3 mL PBS(pH=7.0)，采用電化學(xué)法進行分析；另外，對BSA配制了不同濃度的合成樣品，取2 mL并加入5 mL INH、3 mL PBS(pH=7.0)，采用熒光光譜法進行分析，結(jié)果如表3。

表3 INH和BSA合成樣品分析(n=5)

3 結(jié)論

采用電化學(xué)、熒光光譜兩種方法對INH與BSA的相互作用進行了研究。結(jié)果表明，INH與BSA之間結(jié)合作用較強，靜態(tài)猝滅導(dǎo)致BSA內(nèi)源熒光減弱，而運用電化學(xué)方法，BSA的加入使INH氧化峰電流降低，峰電位基本不變，峰電流的降低值與所加入的BSA濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。研究了其結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和線性范圍等。該研究對于闡明INH在體內(nèi)的運輸過程和藥用機理，設(shè)計和合成新藥的研究有一定的指導(dǎo)意義。