王曉芬, 陳美芬， 劉俊俊， 鄢愛平， 萬益群*，

(1.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西南昌 330031；2.南昌大學(xué)分析測試中心，江西南昌 330047)

氨基酸是含羧基和氨基的一類有機化合物的通稱，是生物體內(nèi)不可缺少的營養(yǎng)成分之一，它構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，參與生物體內(nèi)的新陳代謝和生理過程，與生物的生命活動密切相關(guān)[1]。臍橙具有較高的營養(yǎng)、藥用、保健價值，備受廣大消費者的喜愛。氨基酸也是臍橙風(fēng)味的主要組成物質(zhì)。江西贛南盛產(chǎn)臍橙，譽稱“臍橙之鄉(xiāng)”，由于其得天獨厚的土壤條件，生產(chǎn)的臍橙果大形正，橙紅鮮艷，光潔美觀，肉質(zhì)脆嫩化渣，風(fēng)味濃甜芳香，已得到國內(nèi)外知名人士、專家和國家有關(guān)部門的高度評價和肯定，其產(chǎn)品已銷往世界各地。而在經(jīng)濟利益驅(qū)使下，市場上開始出現(xiàn)較多的“偽贛南臍橙”，嚴(yán)重?fù)p害了果農(nóng)及消費者的利益。臍橙中氨基酸的種類及含量與臍橙種類、產(chǎn)地及質(zhì)量等因素密切相關(guān)。分析臍橙中氨基酸不僅可以判別臍橙的品質(zhì)[2,3]，衡量其營養(yǎng)價值，還可以甄別其產(chǎn)地。目前測定氨基酸的方法主要有氨基酸自動分析儀法[4,5]、氣相色譜及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6 - 8]、高效液相色譜及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9 - 11]、毛細(xì)管電泳法[12,13]以及離子色譜法[14,15]等。

本研究應(yīng)用高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法對贛南6個縣的臍橙中的氨基酸的品質(zhì)進行探討，并找出了不同區(qū)域臍橙中氨基酸種類及對應(yīng)含量的差異性。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

ICS-2500型離子色譜儀(美國，Dionex公司)，包括GP50四元梯度泵、LC25色譜柱箱、ED50電化學(xué)檢測器，安培檢測池由金電極、Ag/AgCl參比電極和包含池體的鈦對電極組成；儀器控制數(shù)據(jù)處理采用Chromeleon 6.5色譜工作站；AP210電子天平(美國，Ohaus公司)；KQ-100DE超聲波清洗儀(昆山超聲儀器廠)；Milli-QS超純水器(美國，Millipore公司)。

精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)、蘇氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、纈氨酸(Val)、絲氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)(純度均大于99%，購于德國Sigma Aldrich公司)；NaOH溶液(純度均大于99%，購于德國Sigma Aldrich公司)；NaOH溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%～52%，德國Sigma Aldrich公司)；NaAc溶液(美國戴安公司)；聚苯乙烯-二乙烯基苯型陽離子交換樹脂(PS-DVB)003x7(南開大學(xué)化工廠)；氨水、HCl、甲酸、乙醇均為分析純；實驗用水均為電阻率18.2 MΩ·cm的超純水。

臍橙樣品采自江西贛南章貢區(qū)、贛縣、大余縣、信豐縣、安遠(yuǎn)縣和崇義縣。

1.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取4.00 g的臍橙樣品于50 mL離心管中，加入15 mL 70%的乙醇，于溫度40 ℃下超聲提取20 min，過濾。重復(fù)提取一次，合并濾液于50 mL容量瓶中，并用水定容。分別用10 mL 1 mol/L HCl 和10 mL 1 mol/L NaOH溶液反復(fù)預(yù)處理陽離子交換樹脂。取2 mL處理好的樹脂裝入玻璃柱中(15×0.9 cm)，加入5 mL提取液，靜置幾分鐘，使樣品中的氨基酸與樹脂充分結(jié)合，然后以0.1 mL/min的速度流出，再用30 mL 0.02%的甲酸以1 mL/min的速度洗脫干擾物質(zhì)。最后，用10 mL 2 mol/L氨水以0.5 mL/min的速度將氨基酸洗脫下來。洗脫液收集至離心管內(nèi)，于90 ℃水浴下氮吹至近干，用水溶解并定容。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：AminoPac PA10分析柱(250×2 mm)，AminoPac PA10保護柱(50×2 mm)；柱溫：35 ℃；流速：0.15 mL/min；進樣體積：25 μL；淋洗液：水、NaOH溶液和NaAc溶液進行梯度淋洗。洗脫條件為：0.0～2.0 min,76%H2O,24%NaOH；2.0～8.0 min,76%～64%H2O,24%～36%NaOH；8.0～11.0 min,64%H2O,36%NaOH；11.0～18.0 min,64%～40%H2O,36%～20%NaOH,0%～40%NaAc；18.0～21.0 min,40%～44%H2O,20%～16%NaOH,40%NaAc；21.0～23.0 min,44%～14%H2O,16%NaOH,40%～70%NaAc；23.0～42.0 min,14%H2O,16%NaOH,70%NaAc；42.0～42.1 min,14%～20%H2O,16%～80%NaOH；42.1～44.1 min,20%H2O,80%NaOH；44.1～44.2 min,20%～76%H2O,80%～24%NaOH；44.2～74.0 min,76%H2O,24%NaOH。積分安培檢測器波形同文獻氨基酸檢測波形[16]。

圖1 17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(1 mg/L)Fig.1 Chromatogram of 17 amino acids standard mixture solution (1 mg/L)Peaks:1.arginine;2.lysine;3.asparagine;4.alanine;5.threonine;6.glycine;7.valine;8.serine;9.proline;10.isoleucine;11.leucine;12.methionine;13.phenylalanine;14.glutamic acid;15.aspartic acid;16.cystine;17.tyrosine.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分析條件的優(yōu)化

采用了水、NaOH和NaAc溶液作為淋洗液，淋洗過程分為三個部分：首先，用NaOH溶液將弱保留氨基酸淋洗下來，然后加入NaAc溶液淋洗強保留氨基酸，最后再用NaOH溶液平衡柱子。弱保留氨基酸的靈敏度，隨NaAc溶液濃度的改變很小或幾乎不變，而NaAc濃度改變時，含兩個羧基的氨基酸與含一個羧基的氨基酸其靈敏度的改變相差較大，可利用這一點來提高氨基酸之間的分離度，以獲得理想的分離效果。通過多次實驗，最終色譜淋洗條件見1.3。

在優(yōu)化的梯度洗脫條件下，探討了淋洗液流速為0.1、0.15、0.3 mL/min時對氨基酸分離效果的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流速為0.1 mL/min時，17種氨基酸完全分離，但分離時間長達43 min，且賴氨酸的響應(yīng)值較低；當(dāng)流速為0.3 mL/min時，氨基酸不能完全分離，例如丙氨酸和蘇氨酸。流速為0.15 mL/min，17種氨基酸分離良好，且分析時間為36 min。因此，實驗選擇流速為0.15 mL/min進行測定。在上述優(yōu)化的條件下，17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分離色譜圖見圖1。

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1提取方法的選擇探討了直接浸取、水浴回流提取和超聲輔助提取三種方法對臍橙中氨基酸的提取效果，氨基酸提取效率為：超聲輔助提取>水浴回流提取>直接浸取，且由于直接浸取法耗時較長，水浴回流提取法需要較多的試劑，超聲輔助提取操作簡便，提取效率高，故選用超聲輔助提取法提取臍橙中的氨基酸。

2.2.2提取條件的優(yōu)化以臍橙為樣品，對氨基酸的提取條件進行了優(yōu)化實驗。采用L16(44)進行正交試驗，所考慮的4個因素分別為乙醇提取劑的體積分?jǐn)?shù)(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)和溶劑用量(D)(表3)。按表1方式進行的16組實驗中，每組實驗重復(fù)3次。各組實驗所得17種氨基酸的平均回收率，列于表2。比較表中K和R的數(shù)據(jù)可看出，四個因素中，乙醇提取劑的濃度影響最大，其次是提取溫度、溶劑體積、提取時間。綜合17種氨基酸的優(yōu)化水平，最終確定優(yōu)化的提取條件為A3B3C4D3，即用15 mL的70%乙醇作為提取劑在40 ℃下超聲輔助提取20 min。

表1 正交試驗設(shè)計因素水平表

表2 17種氨基酸的L16 (44)正交試驗結(jié)果

2.3 線性方程和檢出限

將氨基酸儲備液配制成一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按選定的色譜條件進行測定，以峰面積對濃度進行線性回歸，結(jié)果見表3。17種氨基酸在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性良好，檢出限為0.01～0.19 mg/L。

表3 17種氨基酸的線性方程及檢出限

2.4 回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

準(zhǔn)確稱取4.00 g左右臍橙勻漿，分別添加2 mg/L、8 mg/L兩個水平的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按選定方法進行樣品處理和檢測，以峰面積計算氨基酸在2個添加水平的回收率，每個添加水平重復(fù)試驗5次，方法回收率在72.5%～130.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.5%～10.1%之間，方法基本能滿足實際樣品分析。

2.5 樣品的測定

應(yīng)用所建立的分析方法，對采自贛南六個地區(qū)的臍橙樣品進行分析，結(jié)果見表4。

表4 贛南臍橙樣品中氨基酸分析結(jié)果(mg/kg,n=3)

3 結(jié)論

本文采用正交設(shè)計對臍橙樣品中氨基酸的提取條件進行了優(yōu)化，并用PS-DVB 003x7型陽離子交換樹脂去除提取液中共存的碳水化合物，結(jié)合離子色譜-積分脈沖安培法檢測了17種氨基酸，方法快速簡單，無需進行柱前或柱后衍生。對贛南6個地區(qū)臍橙樣品中氨基酸進行分析，結(jié)果滿意。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地臍橙樣品中一些氨基酸的水平存在一定差異，有可能作為鑒別臍橙種植產(chǎn)地的一個參考指標(biāo)。