陳小曼， 張凱歌， 胡玉玲， 肖小華， 李攻科*

(中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東廣州 510257)

SCN-是一種典型的類鹵素，具有很強的配位能力和鹵素性質(zhì)。將SCN-與過氧化物加入奶粉中，可阻斷細菌代謝，起到良好的抑菌、保鮮效果。雖然SCN-的毒性不及CN-，但攝入過量會抑制人體內(nèi)的碘轉(zhuǎn)移，嚴重影響甲狀腺功能[1,2]。自2008年12月12日起，我國政府明令禁止將硫氰酸鹽作為牛奶或其它食品的添加劑；2010年開始，SCN-成為我國食品安全抽檢的新增項目。目前，有關(guān)SCN-的檢測方法主要有離子色譜(Ion Chromatography,IC)法[3,4]、高效液相色譜法[5,6]、氣相色譜法[7 - 9]、毛細管電泳法[10,11]等。其中，IC法是硫氰酸鹽檢測的推薦標準方法[15]。但該方法的樣品前處理步驟繁瑣、耗時長，不利于現(xiàn)場快速檢測。

表面增強拉曼光譜(Surface-enhanced Raman Spectroscopy,SERS)是一種新型光譜分析手段，具有所需樣品量少、操作簡單、快速、高效、可進行無損分析等特點，可用于現(xiàn)場實時快速檢測。目前已在生物[12 - 14]、食品[15 - 18]、環(huán)境[19 - 21]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。Yang等[22]采用SERS法測定奶粉中SCN-時，以銀納米粒子作為增強試劑，SCN-的線性范圍為2.0～191.0 mg/L。但該方法的檢測靈敏度較差，難以檢測實際奶粉樣品中的SCN-。本文采用商品化SERS增強試劑CP-1，建立了奶粉中SCN-的SERS快速分析方法，并與IC法結(jié)果進行對比分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Delta Nu Inspector便攜式拉曼光譜儀(美國，Delta Nu)；DX-320離子色譜儀(美國，戴安公司)；IonPac AS19強親水性陰離子分析柱(250×4.0 mm)；IonPac AG16保護柱(50×4.0 mm)；TG16-WS離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；C18凈化柱(廣州綠百草生物科技有限公司)。

KSCN標準品、三氯乙酸、KOH、正己烷、正庚烷、石油醚和環(huán)己烷，均購自廣州化學(xué)試劑廠；硅膠和中性氧化鋁購自上海五四化學(xué)試劑有限公司；弗羅里硅土和活性碳購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；C18硅膠購自J.T.Baler公司；色譜純乙腈購自北京Dikma公司；SERS增強試劑CP-1購自廈門市普識納米科技有限公司。實驗用水為純凈水。

1.2 SERS實驗方法

1.2.1標準溶液的配制將KSCN標準品于80 ℃烘箱內(nèi)烘干2 h后，準確稱取0.1673 g于100 mL容量瓶中，用水定容，即得1 000 mg/L SCN-標準儲備液。移取1 mL標準儲備液于100 mL容量瓶中，以150 g/L的三氯乙酸水溶液定容，即得10.0 mg/L SCN-標準中間溶液。移取不同量的標準中間液，并用150 g/L的三氯乙酸水溶液稀釋成0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/L的SCN-系列標準工作液。

1.2.2奶粉樣品前處理稱取奶粉樣品0.10 g和C18硅膠0.05 g于15 mL離心管中，加入10 mL三氯乙酸水溶液(150 g/L)，充分搖勻，300 W下超聲波輔助萃取5 min，9 000 r/min下離心5 min后靜置，待測。

1.2.3SERS檢測拉曼光譜條件：測試模式為Soft Ware，積分時間為15 s，測定次數(shù)為5次，每次測試扣除暗電流1 s，激光功率為High，結(jié)果為Average，分辨率為Low。移取300 μL SERS增強試劑CP-1于拉曼管中，加入100 μL待測液，混勻后進行SERS檢測。根據(jù)SCN-的特征峰定性，根據(jù)峰面積定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 SCN-定量峰的選擇

通過空白溶液和不同濃度SCN-溶液的SERS測試發(fā)現(xiàn)，SCN-的SERS譜峰較簡單，SCN-溶液在約2 110 cm-1受干擾少且有較明顯拉曼響應(yīng)。隨著SCN-的濃度增大，其特征譜峰的響應(yīng)強度逐漸增大。這可能是SCN-吸附在金的表面，引起了C≡N鍵的伸縮振動響應(yīng)[23]，因此選擇2 110 cm-1為SCN-的特征峰。

2.2 SERS法樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1萃取溶劑的選擇分別考察了純凈水和20、100、150 g/L三氯乙酸水溶液作為萃取溶劑時的測定效果。體系中三氯乙酸主要有三個作用：萃取奶粉中的SCN-；沉淀奶粉中的蛋白質(zhì)以利于SERS檢測；使SERS增強試劑團聚以增強其SERS信號。結(jié)果表明，萃取溶劑對SCN-的測定有較大影響，150 g/L的三氯乙酸水溶液效果最好。因此后續(xù)實驗選擇150 g/L的三氯乙酸水溶液作為萃取溶劑。

2.2.2超聲波輔助萃取時間優(yōu)化優(yōu)化了超聲波輔助萃取時間(0、1、3、5、7 min)對奶粉中SCN-萃取效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)超聲萃取5 min后，SCN-的特征譜峰面積最大，萃取效果最好。因此選擇5 min作為超聲波輔助萃取時間。

2.2.3離心時間的優(yōu)化離心時間對SCN-的SERS信號強度也有較大影響。樣品進行超聲波輔助萃取后分別在9 000 r/min條件下離心0、1、3、5、10 min進行SERS檢測。結(jié)果表明，當(dāng)離心時間小于3 min時，SCN-的特征峰不明顯；當(dāng)離心時間超過5 min時，2 110 cm-1附近SCN-的特征峰強度基本不變。因此選擇離心時間為5 min。

2.2.4降低基質(zhì)干擾的方法探究奶粉中存在的脂肪、蛋白質(zhì)等對SERS檢測有較大影響。而大部分脂肪極性較小，蛋白質(zhì)中氨基酸的R基為非極性或疏水性時，也表現(xiàn)出弱極性或者非極性。根據(jù)相似相溶原理，選擇極性小的溶劑對SCN-萃取液進行凈化，有望除去干擾物、降低奶粉基質(zhì)干擾，提高SERS方法的靈敏度。本文研究了正己烷、環(huán)己烷、正庚烷和石油醚[24]對SCN-萃取液的凈化效果(圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不經(jīng)過有機溶劑凈化時，所得樣品中SCN-的SERS峰面積是同濃度標準溶液SERS峰面積的0.42倍，表明樣品基質(zhì)干擾較嚴重。當(dāng)使用有機溶劑進行凈化后，樣品中SCN-的峰面積均有所增加，其中石油醚效果最好，能達到同濃度標準溶液的0.58倍。表明采用有機溶劑凈化處理能減少部分基質(zhì)干擾，但其效果并不理想。

另一方面，本文研究了弗羅里硅土、活性碳、硅膠、中性氧化鋁和C18硅膠等吸附材料[25]對奶粉中雜質(zhì)的吸附及降低基質(zhì)干擾的效果(圖2)。經(jīng)吸附材料處理后，所有樣品中SCN-的SERS峰面積均有一定程度的增加。其中，經(jīng)過C18硅膠吸附雜質(zhì)后，樣品中SCN-的峰面積達到同濃度標準溶液峰面積的0.76倍，效果較好，說明添加C18硅膠能有效降低樣品的基質(zhì)干擾。故后續(xù)實驗中選擇C18硅膠降低樣品的基質(zhì)干擾。

圖1 有機溶劑降低基質(zhì)干擾的效果Fig.1 The effect of organic solvents to reduce the matrix interferences Dotted line represents the peak area of standard solution.

圖2 吸附材料降低基質(zhì)干擾效果Fig.2 The effect of adsorbing materials to reduce the matrix interference Dotted line represents the peak area of standard solution.

2.3 SERS檢測條件的優(yōu)化

2.3.1SERS增強試劑與待測液體積比SERS增強試劑與待測液體積比對SCN-的SERS檢測至關(guān)重要。本文考察了SERS增強試劑與待測液體積比分別為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1 時SCN-的SERS譜峰強度變化。結(jié)果表明，隨著增強試劑與待測液體積比的增加，2 110 cm-1處SERS峰強度呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢；當(dāng)體積比為3∶1時，峰強度最大。最終選擇增強試劑與待測液體積比為3∶1。

2.3.2積分時間的優(yōu)化SERS分析中，積分時間對SCN-的SERS檢測也有較大的影響。本實驗中，隨積分時間的增加，SCN-的特征峰信號呈逐漸增強的趨勢，但積分時間大于15 s后信號將溢出。因此，選擇積分時間為15 s。

2.4 奶粉中SCN-的分析

2.4.1SERS法分析SCN-配制0.10～0.60 mg/L的SCN-系列標準溶液，在優(yōu)化實驗條件下，以2 110 cm-1處譜峰為定量峰進行SERS分析。結(jié)果表明，SERS峰面積和SCN-濃度在0.10～0.60 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，工作曲線方程為：Y=6.104×104X+2.322×104，相關(guān)系數(shù)r2=0.9933，檢出限為0.05 mg/L。

2.4.3SERS法與IC法對比分析隨機抽取35種市售不同奶粉(其中嬰幼兒奶粉15種、中老年奶粉4種、孕婦奶粉8種和兒童奶粉8種)進行SCN-的SERS分析。結(jié)果表明，35種奶粉中，有24種奶粉中SCN-含量高于10.0 mg/kg，7種奶粉的SCN-含量高于25.0 mg/kg。使用IC法對同批奶粉進行對比分析，結(jié)果表明，同一樣品中SCN-的SERS測定值與IC測定值的比值在0.70～1.06之間，兩種方法的分析結(jié)果符合度和重現(xiàn)性良好，方法之間無顯著性差異，各類奶粉的典型測試結(jié)果見表1。圖3和圖4分別為奶粉中SCN-分析的SERS譜圖和IC譜圖。隨機選取4種不同奶粉添加SCN-進行回收率實驗驗證SERS方法的可行性。結(jié)果見表2，SCN-的回收率在70.5%～109%之間，RSD小于9.8%。

表1 不同奶粉樣品中SCN-含量的方法對比結(jié)果(n=3)

表2 實際樣品的SERS測定結(jié)果及加標回收率(n=3)

圖3 奶粉中SCN-測定的SERS譜圖Fig.3 SERS spectra of SCN- in milk powder

圖4 奶粉中SCN-測定的IC圖Fig.4 Chromatogram of SCN- in milk powder

3 結(jié)論

本文建立了奶粉中SCN-的表面增強拉曼快速檢測法，分析了市售35種奶粉中的SCN-含量，并與離子色譜法進行比對分析。結(jié)果表明，奶粉中SCN-的SERS方法與IC方法分析結(jié)果符合度和重現(xiàn)性良好，兩種方法之間沒有顯著差異。相對而言，SERS法可大大降低實驗耗時、簡化實驗過程并降低實驗成本。該方法具有實現(xiàn)奶粉中硫氰酸根現(xiàn)場快速檢測的應(yīng)用潛力。