伍智蔚， 易忠勝*， 董 露， 馮理濤

(廣西高校食品安全與檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西桂林 541004)

多溴二苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers,PBDEs)是一類阻燃添加劑，已廣泛應(yīng)用于商業(yè)和家用產(chǎn)品[1]。近年來，在動植物體[2 - 4]中均檢出PBDEs，而通過食物鏈PBDEs最終會在人體內(nèi)蓄積[5 - 7]。值得注意的是，PBDEs對人體造成不同的毒性作用[8,9]。此外，PBDEs經(jīng)過體外代謝和藻類植物可以轉(zhuǎn)化為毒性更高的羥基化物(OH-PBDEs)，從而造成二次污染[10]。因此，研究PBDEs和OH-PBDEs的各項(xiàng)毒性指標(biāo)變得越來越重要。PBDEs和OH-PBDEs的標(biāo)準(zhǔn)樣品難以獲取且實(shí)驗(yàn)成本很高，目前僅有少部分的PBDEs同系物被測定各項(xiàng)活性指標(biāo)。定量構(gòu)效關(guān)系方法(QSAR)和分子對接技術(shù)可在有限的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和晶體模型基礎(chǔ)上，利用數(shù)學(xué)建模方法建立基于PBDEs或OH-PBDEs分子結(jié)構(gòu)特征的各項(xiàng)生物活性的預(yù)測模型，能夠有效評估PBDEs或OH-PBDEs同系物的各項(xiàng)生物活性及機(jī)理[11]。然而，QSAR局限于大數(shù)據(jù)量目標(biāo)物的構(gòu)效分析，分子對接由于其分子的剛性對接模型具有不確定性[12]。

本文在前人的工作基礎(chǔ)上，分別利用比較分子相似性指數(shù)法(CoMSIA)和分子全息定量構(gòu)效關(guān)系法(HQSAR)構(gòu)建模型，研究PBDEs和OH-PBDEs對芳基碳?xì)浠衔镉H和力受體(AhR)和甲狀腺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TTR)的毒性親和力，并結(jié)合分子對接[13]剖析其相關(guān)結(jié)合機(jī)理。此外，通過分子動力學(xué)模擬(MD)技術(shù)，探討模型結(jié)合動態(tài)模擬過程。本文從靜態(tài)和動態(tài)兩個方面分別探討AhR和TTR的親和力，有效避免了QSAR和分子對接的缺陷，不僅建立了具有高預(yù)測能力模型還可視化地解釋結(jié)合的過程。

1 原理和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

18個芳烴受體(AhR)的活性數(shù)據(jù)[14]和28個甲狀腺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TTR)的活性數(shù)據(jù)均來自文獻(xiàn)[15 - 17]，活性數(shù)據(jù)采用相對親和力(RBA)的負(fù)對數(shù)pI表示。為保證建立模型樣本集結(jié)構(gòu)多樣性，兩組數(shù)據(jù)集均按照活性值由大到小的順序排列，并且按每隔兩個數(shù)集選取一個數(shù)集作為測試集，其余數(shù)集為訓(xùn)練集，對模型進(jìn)行內(nèi)部檢驗(yàn)。

1.2 小分子表征及預(yù)處理

整個建模過程均在Tripos公司的sybyl(版本，x-1.1)軟件包中進(jìn)行。首先利用Chemdraw(版本，2005)構(gòu)建小分子結(jié)構(gòu)，并對每個分子在Tripos力場中使用Powel能量梯度法進(jìn)行能量最小化。然后以二苯醚為骨架對小分子進(jìn)行疊合，使用LOO方法確立最佳主成分?jǐn)?shù)并以偏最小二乘法(PLS)建立立體、疏水和靜電場的CoMSIA模型，同時采用HQSAR法建立模型比較PBDEs及OH-PBDEs對不同受體的毒性親和力貢獻(xiàn)。

1.3 分子對接與分子動力學(xué)模擬

為研究各小分子與受體的作用模型，本文利用sybyl(版本x-1.1)中的Surflex-dock模塊對小分子與受體進(jìn)行對接。其中受體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(ID:4M4X和4PM1)從Protein Data Bank(PDB)中獲得，加氫，然后使用AMBER方法計(jì)算原子電荷。以CH4、N-H和C=O為分子探針(閥值為0.5，膨脹系數(shù)為1)，確定受體空腔并進(jìn)行對接。合并受體和活性最高的小分子，進(jìn)行隨后的動力學(xué)模擬研究，并使用do_dssp程序?qū)恿W(xué)模擬結(jié)果進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 CoMSIA和HQSAR模型建立

分別對兩組樣本集進(jìn)行CoMSIA模型分析，結(jié)果如表1所示。交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)q2均大于0.55，表明模型具有較好的預(yù)測能力；非交叉檢驗(yàn)的PLS回歸得到擬合相關(guān)系數(shù)r2均達(dá)到0.95以上，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEE)也均小于0.35，說明模型均具有一定的穩(wěn)定性。模型中立體場(S)、疏水場(H)和電子場(E)的貢獻(xiàn)結(jié)果見表1。在AhR受體中模型的場效應(yīng)貢獻(xiàn)主要來源于疏水場(36.9%)和電子場(54.2%)，說明范德華作用對模型有較大影響，小分子的大小對于復(fù)合物的結(jié)合沒有多大影響；而在TTR受體中上述三個場的貢獻(xiàn)相對平均，分別為27.1%(立體場)、34.6%(疏水場)和38.3%(電子場)。

表1 模型結(jié)果和比較

同時，在分子碎片大小為4～7不變的情況下嘗試不同分子碎片區(qū)分參數(shù)組合建立HQSAR模型。結(jié)果表明：AhR樣本集選擇碎片區(qū)分參數(shù)為原子類型(Atom， A)、化學(xué)鍵類型(Bonds,B)、連接性(Connections,Co)和氫原子(Hydrogenatom,H)時，可得到最佳模型：r2=0.911，q2=0.674，該模型具有較高的預(yù)測能力和穩(wěn)定性。此外，TTR的碎片區(qū)分參數(shù)選擇A+B+Co和氫鍵供/受體(Donor & Acceptor,DA)時有最佳模型(r2=0.875)，模型的預(yù)測能力較AhR的模型大，q2=0.789。由此可推測小分子與TTR結(jié)合時氫鍵對復(fù)合物結(jié)合模式的影響較大。

2.2 模型預(yù)測能力和穩(wěn)健度檢驗(yàn)

2.3 模型分析

以活性最高化合物01(AhR：BDE154，TTR：BDE19)為例對模型進(jìn)行等高線圖分析，如圖1所示。a(d)、 b(e)和c(f)分別為AhR(TTR)受體的CoMSIA模型的立體場圖、靜電場圖和疏水場圖。從立體場圖中可以看出C6′(a)和C2(d)位置存在大塊的黃色區(qū)域，說明此位置引入大體積的基團(tuán)可以提高化合物的活性。而C3′(a)位置綠色區(qū)域引入小體積基團(tuán)有利于提高化合物活性，如AhR模型中BDE154(pI=4.64)在C6′位置存在溴，C3′無取代基，其活性比溴取代基位置相反的BDE119(pI=2.98)活性大，因此BDE119對AhR的親和力更強(qiáng)。在圖1b(e)中，藍(lán)色區(qū)域表示引入帶正電荷基團(tuán)有利于提高化合物的活性，紅色區(qū)域表示引入帶負(fù)電基團(tuán)有利于提高化合物的活性。圖1b中C5′和C3附近有藍(lán)色區(qū)域，同樣圖1e中C4位置也有藍(lán)色區(qū)域，這都說明這些區(qū)域引入帶正電基團(tuán)有利于提高活性。同時，在疏水場中，紅色區(qū)域引入疏水性基團(tuán)有利于提高化合物活性，也就是說親水性基團(tuán)將會致使化合物活性降低。例如，TTR受體疏水場(圖1f)中C4′位置周圍有黃色區(qū)域，當(dāng)該位置被具有強(qiáng)親水基團(tuán)取代，化合物活性會降低。因此BDE49(pI=2.55)活性比4′-OH-BDE49(pI=-0.48)活性大，說明帶羥基的化合物對TTR受體的親和力較大。

圖1 模型的等高線圖Fig.1 Contour maps of CoMSIA model

圖2 HQSAR模型的原子對化合物活性貢獻(xiàn)圖Fig.2 Contribution to compound activities of different atoms in HQSAR model

同時，圖2給出了HQSAR預(yù)測模型中原子對化合物活性的貢獻(xiàn)情況。圖2中的原子顏色表明該原子對預(yù)測模型的貢獻(xiàn)，由低到高依次為：紅橙白黃藍(lán)綠。處于光譜中紅色系的顏色反映的是不利的貢獻(xiàn)，從橙色到紅色這種不利的影響依次增大，處于該色系的基團(tuán)對受體的親和力貢獻(xiàn)較小，如圖2b中C2和C6上的溴取代基以及C5位上的氫原子；反之處于光譜藍(lán)色系的顏色反映為有利的貢獻(xiàn)，從黃色到綠色表示對活性的貢獻(xiàn)依次增大，促使具備該色系基團(tuán)的小分子與受體間的親和力增大，如圖2a中C5和C2′上的溴原子以及C6上的氫原子。

2.4 分子對接結(jié)果

分子對接后可以產(chǎn)生多個結(jié)合構(gòu)象，我們選擇結(jié)合能量最低構(gòu)象作為目標(biāo)構(gòu)象。分別以分子活性最高分子01與受體(AhR和TTR)對接結(jié)果為例進(jìn)行詳細(xì)討論。圖3給出了兩個受體與小分子6 ?范圍內(nèi)的結(jié)合情況。在AhR受體中，BDE154完全進(jìn)入到疏水空腔中，被受體殘基包圍，形成穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象。如小圖a所示，小分子BDE154與附近殘基Leu110，Met109和Tyr135形成疏水作用。而在TTR受體中，小分子BDE019只在受體的表面結(jié)合。但是BDE019周圍的殘基與其形成π-π堆積作用的殘基屋頂結(jié)構(gòu)，見小圖b，使得受體TTR與小分子的結(jié)合變得更穩(wěn)定。同時，從a中可以看出BDE019的兩個苯環(huán)分別被殘基Leu17、Lys15、Leu110、Ala109、Ala108、Thr119和Val121所包圍，主要為疏水作用。說明在此位置引入疏水作用強(qiáng)的基團(tuán)有利于提高化合物的活性。

圖3 分子對接結(jié)果Fig.3 The results of molecular docking

2.5 動力學(xué)模擬結(jié)果

使用分子動力學(xué)模擬(MD)的方法，選擇相應(yīng)活性最高的小分子(AhR：BDE154，TTR：BDE19)作為配體，對AhR和TTR的結(jié)合模型進(jìn)行10 ns模擬。采用do_dssp程序分別對AhR和TTR的分子動力學(xué)模擬結(jié)果進(jìn)行估算，結(jié)果如表2所示。當(dāng)小分子與AhR或者TTR結(jié)合時，蛋白受體的二級結(jié)構(gòu)都發(fā)生了相互間的轉(zhuǎn)化，而這種轉(zhuǎn)化則有可能是促使蛋白與小分子結(jié)合得更穩(wěn)定的一種可視化的表現(xiàn)。比如當(dāng)小分子BDE154進(jìn)入到AhR中時，β-折疊(B-Sheet)、α-螺旋(A-Helix和3-Helix)的含量百分比減少，彎曲(Coil)和轉(zhuǎn)角(Turn)則增加。而在TTR與BDE19的結(jié)合模型中，這產(chǎn)生了相反的結(jié)果。當(dāng)小分子BDE154進(jìn)入到AhR中時，β-折疊(B-Sheet)含量百分比增加，而彎曲(Coil)的含量百分比減少。這說明不同受體與小分子結(jié)合時，會以不同的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化方式進(jìn)行結(jié)合，而這種轉(zhuǎn)化方式是隨著受體和配體的不同而改變的。

表2 受體蛋白二級結(jié)構(gòu)平均估算值(%)

3 結(jié)論

QSAR、分子對接和分子動力學(xué)模擬三種方法用于研究多溴二苯醚及其羥基化物與不同受體(AhR和TTR)的親和力構(gòu)效關(guān)系，分別得到了具有較高q2和r2的模型。從配體的原子附近三維等值線圖；不同原子對活性的貢獻(xiàn)圖；疏水空腔對接圖三個不同角度分析小分子與受體的結(jié)合機(jī)制，并且結(jié)果較為一致，并且在動力學(xué)模擬結(jié)果的二級結(jié)構(gòu)中分析發(fā)現(xiàn)隨著小分子的加入，受體的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，而這種轉(zhuǎn)變使得結(jié)合模型更加穩(wěn)定。三種方法相互補(bǔ)充，為指導(dǎo)研究小分子與受體結(jié)合研究提供有效的分析手段和預(yù)測模型。