李 亞， 李 貞， 梁 濤， 肖仲文， 劉志洪

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點實驗室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)作為一種均相檢測技術(shù)具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點，已廣泛運用于免疫分析、核酸雜交等領(lǐng)域。傳統(tǒng)的單光子激發(fā)所構(gòu)建的FRET技術(shù)，常采用下轉(zhuǎn)換熒光材料為能量供體，紫外光或可見光為激發(fā)光源，易產(chǎn)生生物樣品本底發(fā)光和能量供受體同時被激發(fā)等問題，大大限制了FRET技術(shù)的應(yīng)用[1]。上轉(zhuǎn)換熒光材料(Upconversion Nanoparticles，UCNPs)是一類稀土離子摻雜、反Stokes熒光的無機納米材料。因其能連續(xù)吸收兩個或多個低能量的近紅外光子到達激發(fā)態(tài)，發(fā)射出紫外、可見或近紅外光[2]，可有效避免單光子激發(fā)FRET技術(shù)中的問題，因此UCNPs是一類極具發(fā)展前景的FRET能量供體。

目前，基于上轉(zhuǎn)換熒光共振能量轉(zhuǎn)移(UC-FRET)已成功應(yīng)用于復(fù)雜生物基質(zhì)中的蛋白、酶、核酸等目標物的檢測[3,4]。為了保證UCNPs的熒光強度，其尺寸通常在30～50 nm，然而FRET供受體距離在10 nm 以下才能有效發(fā)生，只有在UCNPs表面或距離表面很近的發(fā)光中心才易發(fā)生FRET，因此FRET效率受限。“核-內(nèi)殼-外殼”夾心結(jié)構(gòu)的SWUCNPs(NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4)，其稀土發(fā)光離子定位于內(nèi)殼層中且緊鄰?fù)鈿ぃ瑲雍穸染煽卦趲讉€納米[5,6]，相較于傳統(tǒng)均相UCNPs，夾心結(jié)構(gòu)SWUCNPs極大地縮短發(fā)光中心與能量受體之間的距離，有利于FRET發(fā)生，猝滅效率高，檢測靈敏度高。同時，SWUCNPs外殼層是惰性的NaFY4基質(zhì)，可有效地阻止溶劑分子猝滅內(nèi)殼中稀土離子的發(fā)光，提高UCNPs的熒光強度[7]。

ClO-作為重要的活性氧類分子之一，具有強氧化性。在哺乳動物免疫系統(tǒng)中，適量的ClO-可消除細菌引起的炎癥，然而過量的ClO-往往與癌癥、心血管、關(guān)節(jié)炎等疾病有關(guān)[8]。目前已報道的基于氨基硫脲[9]、對甲氧基苯酚[10]、二氫熒光黃[11]等有機染料構(gòu)建的ClO-熒光探針，因檢測時需要紫外光或可見光激發(fā)，生物樣本背景熒光和散射光干擾嚴重，導(dǎo)致靈敏度不高。為克服上述缺陷，本文設(shè)計了基于UC-FRET并以夾心結(jié)構(gòu)SWUCNPs為能量供體，F(xiàn)ITC為能量受體的新型ClO-納米探針。該探針用于檢測水溶液中ClO-含量，猝滅效率高達95%，線性范圍為0.02～3.4 mmol/L，檢出限為0.008 mmol/L。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

RF-5301PC型熒光分光光度計(日本，島津公司)；UV-2550型紫外-可見分光光度計(日本，島津公司)；H-7000FA型透射電鏡(日本，Hitachi公司)；980 nm半導(dǎo)體近紅外激光(北京海特光電有限責任公司)；D8型X射線衍射儀(德國，Bucker公司)；Legend-Micro-17R型高速冷凍離心機(美國，Thermo Scientific公司)。

Y2O3、Yb2O3、Tm2O3、油酸(OA)、5%～8%NaClO水溶液，均購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；十八烯(ODE)、對硝基苯甲醛、哌啶、吡啶、3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(MOPS)，均購于上海晶純生化科技股份有限公司(阿拉丁)；還原鐵粉購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；異硫氰酸熒光素(FITC)購于北京百靈威科技有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)購于美國Sigma-Aldrich公司；所有試劑均為分析純，實驗所用水為超純水。

1.2 油酸修飾夾心結(jié)構(gòu)上轉(zhuǎn)換熒光材料(OA-SWUCNPs)的合成

OA-SWUCNPs按照文獻報道的晶種生長法[12,13]合成。稱取840 mg NaF固體于三口燒瓶中，依次加入0.75 mmol油酸釔，10 mL 油酸和10 mL 十八烯。抽真空，氬氣保護，升溫至120 ℃反應(yīng)1 h，再升溫至320 ℃反應(yīng)2 h。從燒瓶中取出4 mL反應(yīng)液，緩慢注入0.4 mmol稀土油酸鹽(溶于8 mL OA∶ODE=1∶1混合溶劑中)，反應(yīng)30 min。接著取出6 mL反應(yīng)液，再緩慢注入1.6 mmol油酸釔(溶于8 mL OA∶ODE=1∶1混合溶劑中)，反應(yīng)30 min。自然冷卻至室溫，反應(yīng)液加入等體積無水乙醇，離心收集沉淀。沉淀用混合溶劑(乙醇∶己烷=4∶1，體積比)離心洗滌6次，最后超聲分散在8 mL無水乙醇中，置于4 ℃冰箱中，備用。

1.3 表面裸露的夾心結(jié)構(gòu)上轉(zhuǎn)換熒光材料(Bared SWUCNPs)的制備

Bared SWUCNPs的合成步驟參照文獻方法[14,15]。取4 mL OA-SWUCNPs乙醇分散液于50 mL圓底燒瓶中，加入30 mL pH=1的乙醇溶液(用濃HCl調(diào)節(jié)pH)超聲2 h，離心分離，收集沉淀。所得沉淀用pH=4的乙醇溶液離心洗滌1次，無水乙醇洗滌2次，水洗滌3次，最后超聲分散在4 mL水中，置于4 ℃冰箱中，備用。

1.4 4-氨基苯基丙烯酸配體的合成

4-氨基苯基丙烯酸的合成路線如圖1所示。稱取對硝基苯甲醛2.0 g(13 mmol)和丙二酸1.3 g(12.5 mmol)，加入0.3 mL哌啶和18 mL吡啶，加熱冷凝回流反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液滴加到大量水中，用濃HCl調(diào)混合溶液至酸性，抽濾后用水洗滌數(shù)次，乙醇洗滌數(shù)次，得到固體產(chǎn)物4-硝基苯基丙烯酸，產(chǎn)率96%。取10 mL水和10 mL乙醇注入50 mL單口燒瓶中，攪拌均勻，加入4-硝基苯基丙烯酸0.5 g(2.591 mmol)，還原鐵粉0.2902 g(5.181 mmol)和NH4Cl 0.2772 g(5.181 mmol)，在80 ℃空氣浴下攪拌溶解，氮氣保護下反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后向燒瓶中加入適量水，然后加入乙酸乙酯萃取分離，收集上層有機相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分溶劑。將所得粗品用硅膠柱層析提取(淋洗劑：乙酸乙酯∶石油醚=1∶2，加1%冰乙酸)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得到黃色固體，即為產(chǎn)物4-氨基苯基丙烯酸，產(chǎn)率35%。1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)：11.96(s，1H)，7.42(d，1H)，7.35(d，2H)，6.56(d，2H)，6.13(d，1H)，5.74(s，2H)。

圖1 4-氨基苯基丙烯酸的合成路線Fig.1 The synthesis schematic diagram of 4-aminophenylacrylic acid

1.5 ClO-探針的制備

1.2 mg bared SWUCNPs分散于1 mL 30 mmol/L的MOPS緩沖溶液(pH=7.2)中，加入10 μL 10 mg/mL 4-氨基苯基丙烯酸(DMSO溶液)，置于搖床中避光反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，再向離心管中加入60 μL 10 mmol/L的FITC，繼續(xù)避光反應(yīng)6 h。離心收集沉淀，用水離心洗滌沉淀3次，最后將沉淀超聲分散在1 mL水中。將得到濃度為1.2 mg/mL的探針溶液，避光置于4 ℃冰箱中，備用。

1.6 基于UC-FRET的ClO-檢測原理

夾心結(jié)構(gòu)上轉(zhuǎn)換能量供體SWUCNPs包含三層：核、內(nèi)殼和外殼。核是沒有摻雜發(fā)光離子的NaYF4納米粒子，內(nèi)殼層是摻雜了稀土發(fā)光離子Tm3+的熒光層。內(nèi)殼層中發(fā)光離子Tm3+隨機分布，處于內(nèi)殼層表面的Tm3+其上轉(zhuǎn)換熒光會被溶劑分子猝滅，降低UCNPs的熒光強度。為了避免溶劑分子對Tm3+熒光的猝滅，內(nèi)殼層表面又覆蓋了一層惰性的NaYF4基質(zhì)外殼。外殼厚度可控制在幾個納米，有效地縮短供體離子與能量受體之間的距離，有利于提高FRET過程的能量轉(zhuǎn)移效率。與此同時，SWUCNPs表面配體OA可通過酸處理的方法去除得到bared SWUCNPs，這樣有利于在其表面修飾上新的功能基團。如圖2所示，當向bared SWUCNPs中加入過量4-氨基苯基丙烯酸配體，該配體分子中游離的羧基與暴露在SWUCNPs表面的稀土離子通過配位作用連接到SWUCNPs。而另一端游離的氨基與FITC通過共價偶聯(lián)結(jié)合，除去多余的FITC即得到ClO-探針。該探針能量供體和能量受體之間距離小，UC-FRET效率高。當探針加入到ClO-溶液中，4-氨基苯基丙烯酸中的碳碳雙鍵被ClO-氧化切斷，SWUCNPs和FITC之間距離增大，F(xiàn)RET作用消失，SWUCNPs的熒光得到恢復(fù)，并且熒光的恢復(fù)程度與ClO-的濃度在一定范圍內(nèi)成正比例關(guān)系，從而可實現(xiàn)對ClO-的定量檢測。

圖2 基于UC-FRET納米探針檢測ClO-的示意圖Fig.2 Schematic illustration of the nanoprobe for ClO- based on UC-FRET from SWUCNPs to FITC

2 結(jié)果與討論

2.1 SWUCNPs的表征

SWUCNPs的合成采用層層自組裝晶種生長法，油酸作為表面配體。從圖3透射電鏡(TEM)圖中，可以十分清晰地看出核、內(nèi)殼和外殼生長的變化過程。NaYF4核(圖3A)，NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm核-內(nèi)殼結(jié)構(gòu)(圖3B)，NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4夾心結(jié)構(gòu)(圖3C)，隨著殼層不斷增加，納米粒子的粒徑逐漸增大，得到尺寸均一的球形納米顆粒。圖3D為bared SWUCNPs的TEM圖，圖中所示 bared SWUCNPs也是大小均一的球形納米顆粒。說明酸處理過程不會破壞SWUCNPs的尺寸及微觀形貌。

圖3 (A) NaYF4核結(jié)構(gòu)；(B) NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm核-殼結(jié)構(gòu)；(C) NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4夾心結(jié)構(gòu)；(D) bared NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4夾心結(jié)構(gòu)透射電鏡(TEM)圖Fig.3 TEM images and size distribution of NaYF4core (A);Core-shell structure NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm (B);NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4sandwich structure (C);Bared NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4 (D)

由圖4(A)X射線粉末衍射(XRD)圖結(jié)果可以看出，該方法合成得到的NaYF4核，NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm 核-內(nèi)殼結(jié)構(gòu)，NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4夾心結(jié)構(gòu)都為純六方相。圖4(B)中bared SWUCNPs與OA-SWUCNPs的XRD譜圖一致，晶體結(jié)構(gòu)為六方相，說明酸處理去除SWUCNPs表面油酸配體時不會改變其晶體結(jié)構(gòu)。

圖4 所得到納米晶體的X射線粉末衍射圖譜Fig.4 XRD patterns of the obtained nanocrystals

2.2 ClO-探針的表征

選用4-氨基苯基丙烯酸作為ClO-的識別分子，本文通過酸處理去除SWUCNPs油酸配體，4-氨基苯基丙烯酸一端游離的羧基與暴露在bared SWUCNPs表面的稀土離子通過配位作用結(jié)合，另一端游離的氨基與能量受體FITC共價偶聯(lián)得到ClO-探針，這種探針的構(gòu)建方式更進一步縮短了能量供受體之間的距離，極大地提高了FRET能量轉(zhuǎn)移效率。對該探針進行傅里葉紅外(FI-IR)光譜表征，如圖5(A)所示SWUCNPs的FT-IR譜圖中，2 964 cm-1和2 854 cm-1是亞甲基中的C-H伸縮振動峰，1 564 cm-1是烯烴中C=C的伸縮振動峰，752 cm-1是烯烴中=C-H的伸縮振動峰，這些都是OA分子的特征峰。而在 bared SWUCNPs的FT-IR譜圖中這些特征峰均幾乎消失，這一變化說明酸處理方法成功去除了SWUCNPs表面的OA配體。由紫外-可見吸收光譜(圖5(B))可以看出，bared SWUCNPs偶聯(lián)通過4-氨基苯基丙烯酸與FITC偶聯(lián)之后在480 nm處有明顯的FITC特征吸收，這表明FITC成功偶聯(lián)到SWUCNPs上。

圖5 (A) OA-SWUCNPs和bared SWUCNPs的傅里葉紅外光譜；(B) bare -SWUCNPs(a),bare -SWUCNPs與有機配體的偶聯(lián)物(b)，探針分子(c)和FITC(d)的紫外-可見吸收光譜Fig.5 (A) FT-IR spectra of the oleate -capped SWUCNPs and bared SWUCNPs;(B) The UV-Vis absorption spectra of bare -SWUCNPs before(a) and after(b) attachment of organic ligands,probe(c) and FITC(d)

圖6 (A)相同濃度SWUCNPs和探針的上轉(zhuǎn)換熒光光譜；(B) 探針熒光回升程度隨時間變化圖Fig.6 (A) Upconversion fluorescence emission spectra of SWUCNPs and probe;(B) The plot of fluorescence response of probe after adding ClO-(2.4 mmol/L) as a function of time

2.3 ClO-對探針的定量檢測

圖6(A)是相同條件下測得的bared SWUCNPs和探針的上轉(zhuǎn)換熒光強度，說明該探針的FRET效率很高，猝滅效率可達95%。當將一定量NaClO溶液加入到探針溶液中，因有機配體被ClO-氧化，碳碳雙鍵斷裂，導(dǎo)致供受體之間距離增大，F(xiàn)RET減弱，bared SWUCNPs熒光恢復(fù)。當在0.06 mg/mL探針溶液中加入2.4 mmol/L ClO-后，供體熒光隨著時間的延長而逐漸恢復(fù)，反應(yīng)時間到達30 min時bared SWUCNPs熒光恢復(fù)到最大值，并到達平臺，如圖6(B)所示。為了獲得穩(wěn)定的檢測信號，在此后的回升實驗中，統(tǒng)一選定反應(yīng)時間為30 min。

在反應(yīng)體系中保持探針濃度(0.06 mg/mL)不變，ClO-濃度從0 mmol/L逐漸增加到3.4 mmol/L，如圖7所示，供體在480 nm波長處相對熒光強度((F-F0)/F0(其中，F(xiàn)0代表沒有ClO-存在時供體的熒光強度，F(xiàn)代表加入不同濃度ClO-后供體的熒光強度)不斷增大，并且增大的程度與ClO-濃度在0.02～3.4 mmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.992，檢出限為0.008 mmol/L。

圖7 (A) 980 nm激光激發(fā)下不同濃度ClO-對探針熒光的回升光譜；(B) 980 nm激光激發(fā)下相對熒光強度與ClO-濃度的線性關(guān)系Fig.7 (A) Fluorescence emission spectra of probe excited with 980 nm light in the presence of varying amounts of ClO-;(B) The linear relationship of the fluorescence recovery and the concentration of ClO- under excitation at 980 nm The concentration of ClO- from a to m:0,0.02,0.04,0.08,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0,2.6,3.0,3.4 mmol/L.

2.4 基于FRET的ClO-檢測方法的選擇性

圖8 其他物質(zhì)的干擾性考察Fig.8 Relative fluorescence intensity of the probe in the presence of different substances

為了考察本方法的選擇性，在檢測體系中加入H2O2、半胱氨酸(Cys)、Fe2+以及葡萄糖等干擾物質(zhì)，25 ℃下孵育30 min，然后在相同條件下測定上轉(zhuǎn)換熒光強度。結(jié)果如圖8所示，在加入的干擾物濃度與ClO-相同的情況下，只有加入ClO-后供體熒光得到明顯的恢復(fù)，而干擾物對探針的熒光沒有明顯影響，尤其是其他活性氧物質(zhì)的影響與空白對照組接近，證實該探針對ClO-具有良好的選擇性。

ClO-是漂白劑的有效成分，常用于飲用水消毒，飲用水中殘留的ClO-含量一般為μmol/L水平。另外，ClO-作為一種重要的活性氧物質(zhì)，參與眾多生理過程，據(jù)文獻報道處于發(fā)炎狀態(tài)下生物體中白細胞每小時能夠產(chǎn)生0.02～0.4 mmol/L的ClO-[16]。本文構(gòu)建的ClO-納米探針，檢測范圍在0.02～3.4 mmol/L，檢出限為0.008 mmol/L，由此可以預(yù)見該探針能夠應(yīng)用于環(huán)境和生物體中ClO-含量的檢測。

3 結(jié)論

夾心結(jié)構(gòu)UCNPs與傳統(tǒng)UCNPs相比，稀土熒光離子盡可能多的集中在納米粒子表面或距離表面很近的范圍內(nèi)，縮短了能量供受體之間的距離，F(xiàn)RET效率顯著提高，從而提高分析檢測靈敏度。本文利用SWUCNPs構(gòu)建了基于UC-FRET的ClO-納米探針，其熒光猝滅效率達95%，并在ClO-濃度為0.02～3.4 mmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為0.008 mmol/L。SWUCNPs為構(gòu)建基于UC-FRET的檢測探針提供了一種新的能量供體，可將其應(yīng)用于其他目標物的分析檢測。