余東棟，陸 杰，孫筱萌，方 曉，李 靜，尹應(yīng)樂，陳緒煌*,3

(1.湖北工業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院，湖北武漢 430068；2.空軍預(yù)警學(xué)院黃陂士官學(xué)校，湖北武漢 430034；3.綠色輕工材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430068)

乙烯基二茂鐵(VFc)具有良好的氧化還原可逆性，氧化還原電位約為0.4 V左右VFc與其他單體共聚合成的聚合物電子媒介體的研究最為廣泛。以VFc與其他共聚單體，如N-異丙基丙烯酰胺[1]、十二烷基甲基丙稀酸酯[2]、甲基丙烯酸縮水甘油酯[3]、甲基丙烯酸羥基乙酯[4]等合成的聚合物電子媒介體都表現(xiàn)出良好的電化學(xué)性能，并廣泛應(yīng)用于葡萄糖、苯酚衍生物、半乳糖等的分析檢測(cè)。聚丙烯酰胺具有良好的化學(xué)、機(jī)械穩(wěn)定性和對(duì)微生物分解的惰性，廣泛應(yīng)用于酶固定和生物傳感器的基體。將丙烯酰胺(AM)以共聚的方式引入聚合物鏈中可提高聚合物鏈的親水性。甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)含有可質(zhì)子化的叔胺基基團(tuán)，Bütün等指出DMAEMA均聚物的酸度系數(shù)pKa為7[5]，而葡萄糖氧化酶和葡萄糖脫氫酶的等電點(diǎn)分別為4.2和4.5，將叔胺基引入共聚物鏈中，有望在近中性pH范圍內(nèi)分析液中，帶正電荷的聚合物鏈可以和帶負(fù)電荷的酶之間形成離子鍵，因此用該共聚物來修飾葡萄糖生物傳感器，有利于提高酶電極電子轉(zhuǎn)移效率。

本實(shí)驗(yàn)通過采用自由基聚合的方法，實(shí)現(xiàn)AM、VFc和DMAEMA三種單體共聚，合成了具有水溶性和氧化還原性能的聚合物電子媒介體，并通過示差掃描量熱法、紅外光譜、紫外-可見光譜和電化學(xué)方法對(duì)共聚物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、組成、質(zhì)子化作用和電化學(xué)性能進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

U-3900紫外-可見光分光光度計(jì)(日本，日立公司)；pHB-8酸度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)；Nexus型紅外光譜儀(美國(guó)，熱電尼高力公司)；DSC8000示差掃描量熱儀(美國(guó)，PE公司)；CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)。

乙烯基二茂鐵(VFc)(分析純，純度≥98%，上海泰坦科技股份有限公司)；甲基丙烯酸-二甲氨基乙酯(DMAEMA)(優(yōu)級(jí)純，純度≥99%，上海泰坦科技股份有限公司)；透析袋(截留分子量：3 500道爾頓，biosharp)；丙烯酰胺(AM)(優(yōu)級(jí)純，純度≥99.9%，biosharp)；1,4-二惡烷(分析純，純度≥99.5%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無水乙醇(分析純，純度≥99.7%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；偶氮二異丁氰(AIBN)(分析純，純度≥99.89%，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。

1.2 共聚物的合成及純化

VFc、AM和DMAEMA共聚物采用自由基聚合法合成的。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：向燒瓶中加入AM、VFc、DMAEMA和1.4-二惡烷，并快速攪拌使共聚單體完全溶解，隨后將溶液置于低溫狀態(tài)下通氮?dú)獬? h，緊接著加入共聚單體摩爾數(shù)0.18%的偶氮二異丁氰(AIBN)，并迅速置于65 ℃水浴中反應(yīng)。反應(yīng)過程中持續(xù)通氮?dú)獗ＷC反應(yīng)液在無氧的條件下聚合，以防止共聚單體VFc發(fā)生氧化從而抑制其聚合發(fā)生[6]。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)液中逐漸有沉淀產(chǎn)生。反應(yīng)24 h后，停止通氮?dú)獠⒎磻?yīng)液置于室溫下冷卻。隨后將反應(yīng)液進(jìn)行離心，將得到的沉淀物反復(fù)以丙酮沉淀-去離子水溶解的方式進(jìn)行洗滌，最后將沉淀物的去離子水溶液置于透析袋(截留分子量：3 500道爾頓)中進(jìn)行透析(透析液：乙醇和去離子水的混合溶液)。

1.3 共聚物的表征

1.3.1紫外-可見光譜表征共聚物中VFc單元的含量通過紫外-可見光測(cè)量其在440 nm下的吸光度，并以VFc(最大吸收波長(zhǎng)：440 nm)作為標(biāo)準(zhǔn)物來進(jìn)行表征的。三元共聚物的質(zhì)子化作用是通過0.5～1 mol/L KOH溶液滴定0.02 g/mL的pH=2共聚物水溶液，并通過紫外-可見光譜和酸度計(jì)分別對(duì)溶液的吸光度和pH值進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)進(jìn)行表征。

1.3.2紅外光譜表征通過Nexus型紅外光譜儀對(duì)共聚物進(jìn)行定性分析。實(shí)驗(yàn)條件：采用粉末KBr壓片共研磨法制樣，掃描范圍400～4 400 cm-1。

1.3.3示差掃描量熱法表征三元共聚物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)通過示差掃描量熱儀來進(jìn)行表征。實(shí)驗(yàn)條件：溫度范圍100～260 ℃，升溫速率10 ℃/min。

1.3.4電化學(xué)性能表征三元共聚物的電化學(xué)性能通過使用電化學(xué)工作站，采用三電極系統(tǒng)(玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲為對(duì)電極)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)條件：提純后的三元共聚物溶于0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 共聚物組成及結(jié)構(gòu)

從表1中可以看出共聚物中VFc單體轉(zhuǎn)化率較低，這是因?yàn)閂Fc的競(jìng)聚率相對(duì)較小，鏈自由基誘發(fā)AM和DMAEMA單體發(fā)生聚合的幾率大于VFc。其次以VFc基團(tuán)為端基的增長(zhǎng)鏈自由基容易發(fā)生電子由二茂鐵基團(tuán)向自由基轉(zhuǎn)移，即“分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移”[7]，從而致使鏈自由基失活和增長(zhǎng)鏈的提前終止。共聚物玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg為203.56 ℃(表1)，而聚丙烯酰胺均聚物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度只有190 ℃[10]，因此可以推斷合成的聚合物中可能含有VFc或DMAEMA結(jié)構(gòu)單元或者二者同時(shí)存在。這是因?yàn)閂Fc的二茂鐵基團(tuán)的空間位阻較大，而DMAEMA具有較長(zhǎng)的側(cè)鏈，二者引入線性聚丙烯酰胺都將使得高分子內(nèi)旋受阻，從而表現(xiàn)出玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的增加。

表1 共聚物的聚合及表征

Note:amonomer concentration 1.4 mol/L;bdetermined from the absorbance at 440 nm based on the absorption of ferrocenyl group by UV-Vis spectrophotometer.

圖1為三元共聚物的紅外(IR)光譜圖，1 670 cm-1處為酰胺中羰基(C=O)對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰[9]，即證明了聚合物中含有AM結(jié)構(gòu)單元，1 405、1 050和814 cm-1處為二茂鐵基團(tuán)的特征吸收峰[10]，該吸收峰的出現(xiàn)表明VFc已經(jīng)成功地引入至共聚物分子鏈中。而在2 832 cm-1的吸收峰為N-CH3中甲基的伸縮振動(dòng)吸收峰[11]，1 130 cm-1處為C-N伸縮振動(dòng)吸收峰[14]，說明共聚物的高分子鏈中含有DMAEMA結(jié)構(gòu)單元。綜合以上數(shù)據(jù)可以得出，合成所得的產(chǎn)物為AM、DMAEMA和VFc三元共聚物。

2.2 共聚物的質(zhì)子化作用

酸度系數(shù)pKa體現(xiàn)了一種化合物的離子化能力。本實(shí)驗(yàn)合成的共聚物中含有DMAEMA結(jié)構(gòu)單元即存在叔胺基基團(tuán)，因此當(dāng)pH值小于該聚合物的pKa時(shí)，共聚物中的叔胺基基團(tuán)會(huì)發(fā)生質(zhì)子化作用，從而使得共聚物帶正電荷，增加了該聚合物在溶液中的溶解度。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)共聚物在水溶液中的溶解度與pH值之間的關(guān)系曲線來表征共聚物的質(zhì)子化作用，該方法廣泛地應(yīng)用于兩性聚合物等電點(diǎn)的表征[13]。當(dāng)pH值低于6.5時(shí)，隨著共聚物溶液的pH值的降低，共聚物水溶液在750 nm下的吸光度也隨之降低，說明共聚物的溶解度逐漸增加。該區(qū)域內(nèi)聚合物溶解度的變化主要?dú)w功于兩個(gè)方面：第一，隨著溶液pH值的降低，共聚物中叔胺基基團(tuán)發(fā)生質(zhì)子化作用，其離子化程度增加。第二，共聚物中二茂鐵基團(tuán)在較低的pH環(huán)境下將會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)生成二茂鐵鹽，增加了聚合物的親水性，進(jìn)而增加了共聚物的溶解度，降低了溶液的吸光度，該反應(yīng)可從溶液的顏色上得到驗(yàn)證[6]，當(dāng)溶液pH值大約由3降至2左右時(shí)，溶液逐漸由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榈{(lán)色，并隨著pH值的降低，其顏色的轉(zhuǎn)變更加明顯。從理論上來講，當(dāng)溶液pH值逐漸增加時(shí)，其離子化程度逐漸降低，其吸光度逐漸增加并趨向于一定值，而圖2中當(dāng)pH值大于6.5時(shí)，溶液的吸光度逐漸降低，這是由于隨著溶液pH值的增加，共聚物的溶解性也逐漸降低，共聚物逐漸地從溶液中析出并結(jié)成團(tuán)沉積于溶液的底部，從而表現(xiàn)出吸光度的降低。綜合以上數(shù)據(jù)，可以推斷出共聚物在pH值小于6.5時(shí)可發(fā)生質(zhì)子化作用，從而賦予其正電荷，該結(jié)論可在Bütün的論文[5]中得到驗(yàn)證。葡萄糖氧化酶和葡萄糖脫氫酶的等電點(diǎn)分別為4.2和4.5，因此在pH近中性的溶液中，共聚物中叔胺基質(zhì)子化產(chǎn)生的正電荷會(huì)與酶產(chǎn)生的負(fù)電荷形成離子鍵，從而達(dá)到酶固定的目的，而且該共聚物中主要以柔性鏈段AM結(jié)構(gòu)單元為主，因此賦予了該共聚物很好的柔性，從而實(shí)現(xiàn)電子的直接轉(zhuǎn)移，同時(shí)高活性自由度的高分鏈段也有利于共聚物支鏈中帶正電荷的叔胺基與酶中帶負(fù)電荷的基團(tuán)形成離子鍵，進(jìn)一步提高修飾電極的電子轉(zhuǎn)移效率。另外，離子鍵與共價(jià)鍵相比其作用力較小，因此采用共聚物中DMAEMA結(jié)構(gòu)單元與酶之間形成的離子鍵來固定酶的方法，有助于減小酶固定對(duì)酶活性的影響。

2.3 共聚物電化學(xué)性能

圖2為有無共聚物存在情況下，磷酸鹽緩沖溶液的循環(huán)伏安法曲線。從圖中可以看出當(dāng)無共聚物存在時(shí)，曲線的電流值很小近似等于零，且無氧化還原峰存在，而加入共聚物后循環(huán)伏安法曲線上出現(xiàn)了明顯的氧化還原峰，其氧化還原峰電位分別為0.246 V(EPa)和0.170 V(EPc)，說明合成的共聚物具有氧化還原性能。對(duì)于在溶液中快速運(yùn)動(dòng)的單電子轉(zhuǎn)移氧化還原物質(zhì)，其氧化還原峰電位差在室溫(25 ℃)下，其數(shù)值為59 mV[14]，該共聚物的氧化還原峰電位差為76 mV略微高于其理論值。

圖3在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=7)中，掃描速率5 mV/s下，共聚物中單體組成與氧化峰電流之間的關(guān)系曲線。從圖中可以看出，單體中DMAEMA含量對(duì)氧化峰電流的影響不大，而隨著單體中VFc含量的增加，氧化峰電流也隨之增加，該現(xiàn)象表明增加單體中DMAEMA含量并不能夠增加共聚物中二茂鐵基團(tuán)的含量，而增加單體中VFc含量可有效地提高共聚物中二茂鐵基團(tuán)的含量。為了能夠保證修飾電極具有較高的檢測(cè)極限和縮短電極表面與酶之間的距離，共聚物中需具有足夠的二茂鐵基團(tuán)和叔胺基基團(tuán)，然而在提高上述兩種基團(tuán)含量的同時(shí)，也會(huì)降低共聚物的親水性和柔性，因此需要綜合考慮以上影響因素。

圖4為共聚物在不同掃描速率下的循環(huán)伏安法圖。從圖中可以看出該共聚物具有良好的氧化還原可逆性。在該檢測(cè)模式下，電極與聚合物之間的電子轉(zhuǎn)移主要分為兩個(gè)步驟：聚合物擴(kuò)散至電極表面附近，鏈段中二茂鐵基團(tuán)在附加電壓的作用下發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生電子；電子在二茂鐵基團(tuán)之間的“跳槽”以及二茂鐵基團(tuán)與電極之間的電子轉(zhuǎn)移。由于電子在修飾電極中傳遞速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于聚合物的擴(kuò)散，因此聚合物氧化還原電位并不隨著掃描速率的升高而發(fā)生明顯的改變，即氧化還原峰電位與掃描速率大小無關(guān)，而氧化還原峰電流則隨著掃描速率的增加而增加(圖4)。氧化還原峰電流與掃描速率的關(guān)系如圖5所示，氧化還原峰電流與掃描速率的平方根成正比，其關(guān)系符合Randles-Sevcik公式[15]，可得出共聚物在磷酸鹽緩沖溶液中的擴(kuò)散系數(shù)約為4.17×10-12cm2/s，該數(shù)值相對(duì)較低，證實(shí)了共聚物與電極之間的電子轉(zhuǎn)移受擴(kuò)散控制[16]。另外，不同掃描速率下氧化峰電流與還原峰電流的比值接近于1，因此可以證明該共聚物在磷酸鹽緩沖溶液中實(shí)現(xiàn)了與電極之間的可逆電子轉(zhuǎn)移。

3 結(jié)論

通過自由基聚合的方法成功地將VFc、AM和DMAEMA共聚單體合成了具有水溶性和氧化還原活性的聚合物電子媒介體，并通過示差掃描量熱法和紅外光譜子媒證實(shí)了該聚合物電子媒介體是VFc、AM和DMAEMA的三元共聚物。共聚物中的DMAEMA結(jié)構(gòu)單元在近中性的溶液中可發(fā)生質(zhì)子化作用，因此共聚物可與酶之間形成離子鍵，從而達(dá)到酶固定的目的，而且該共聚物中主要以柔性鏈段AM結(jié)構(gòu)單元為主，因此該共聚物具有很好的柔性、親水性，從而賦予了酶電極高的檢測(cè)極限、高的電子轉(zhuǎn)移效率以及聚合物電子媒介體與電極之間直接的電子轉(zhuǎn)移三大優(yōu)點(diǎn)。另外，共聚物的擴(kuò)散系數(shù)較低，因此以該共聚物來修飾電極有助于提高修飾電極的穩(wěn)定性。該共聚物可作為優(yōu)良的聚合物電子媒介體應(yīng)用于葡萄糖生物傳感器領(lǐng)域。