劉 巖，白 曉，李婷婷，鐘芳麗，沈啟慧*，于東冬，周建光

(1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022；2.浙江大學(xué)醫(yī)院，浙江杭州 310027；3.浙江大學(xué)控制科學(xué)與工程學(xué)院智能系統(tǒng)和控制研究所分析儀器研究中心,工業(yè)控制技術(shù)國家重點實驗室，浙江杭州 310058)

熒光編碼微球由于它的高靈敏度、特異性強(qiáng)和高效的編解碼模式，可以通過流式分析技術(shù)用于多組分微量樣品的高通量檢測，例如：水質(zhì)檢測、免疫熒光分析、藥物代謝、檢驗檢疫[1 - 5]等。用于熒光編碼的熒光材料主要包括量子點(QDs)、熒光染料、稀土配合物等，而QDs由于其獨特的尺寸可調(diào)熒光、超高光強(qiáng)、抗光漂白、具有10～12種熒光顏色的光譜范圍等特點[6,7]，更適合進(jìn)行編碼。

SiO2作為編碼微球的載體，具有無毒、無味、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定以及環(huán)境友好等特點。通過原位合成或者內(nèi)吞的方法制備的QDs@SiO2微球，普遍存在熒光強(qiáng)度低或泄露的問題，與市售的聚苯乙烯載體微球相比，SiO2更難以修飾，因此，限制后續(xù)的應(yīng)用研究。本文采用一步法制備QDs@SiO2微球，通過與QDs表面的配體交換既能保證熒光微球的熒光強(qiáng)度，而且微球表面覆蓋高密度的巰基，不需要對微球表面進(jìn)行活化。該熒光微球克服了泄露的問題，通過流式細(xì)胞分析儀的編碼檢測，可以作為一種高通量的檢測手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

德國Heidolph MR Hei-END磁力攪拌器；湘儀H1650高轉(zhuǎn)速離心機(jī)；德國Bruker AXS公司D8型X-射線粉末衍射儀(XRD)(操作管壓40 kV；管流30 mA；Cu KαL，λ=0.518 416 nm)；美國PE LS-55型熒光分析儀；日本JEOL JSM-6490LV掃描電子顯微鏡(SEM)(配套能譜儀,EDXA)，美國Tecnai G2 S-Twin F20透射電子顯微鏡(TEM,操作電壓200 kV)；德國Leica DM4000B熒光顯微鏡(100 W汞燈);美國BD Accuri C6 流式細(xì)胞分析儀(488 nm激光光源)。

QDs水溶液(自制[8])，三甲氧基巰基丙基硅烷(MPTMS)(97%，J &K Chemical LTD)，氨水、乙醇(分析純，天津大茂化學(xué)試劑)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，半胱氨酸(99%，北京索萊寶科技有限公司)，二硫二硝基苯甲酸(DTNB)(99%，TCI)。本實驗所用水均為Milli-Q制備的超純水。

1.2 實驗步驟

1.2.1QDs@SiO2熒光微球的制備室溫條件下，取MPTMS加入QDs水溶液(橙色熒光)中，恒速磁力攪拌至MPTMS液滴完全消失，呈現(xiàn)透明狀。MPTMS與水的質(zhì)量比為1/50。用濃氨水調(diào)節(jié)溶液的pH到10，在室溫下進(jìn)行恒速攪拌反應(yīng)72 h。得到的微球分別用乙醇和水離心清洗兩次，所得產(chǎn)物分散在乙醇溶液中，室溫保存。測試所需的固體樣品需在室溫條件下真空干燥。

1.2.2熒光微球表面巰基密度的測定表面巰基含量用DTNB法[9]進(jìn)行測量。密度的測試在25 ℃條件下，用0.25 mol/L Tris緩沖溶液(pH=8.3)稀釋半胱氨酸，形成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為：0.00、0.025、0.05、0.10、0.15、0.20 mmol/L。取上述各濃度溶液1 mL，分別加入5 mL預(yù)先恒溫于25 ℃水中的0.1 mmol/L DTNB分析溶液，搖勻后在25 ℃條件下恒溫顯色10 min后，于波長412 nm處測定吸光度值，根據(jù)微球吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的濃度，換算出微球表面的巰基含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 QDs@SiO2熒光微球的表征

利用MTPMS的巰基與QDs之間的配位能力，通過配體交換取代QDs表面原有巰基丙酸(MPA)，溶液中剩余的MPTMS與另一端的硅酸酯發(fā)生水解縮合成球，從而將QDs包覆在微球內(nèi)。圖1a為包裹前后QDs的熒光光譜，包覆后熒光峰位置略藍(lán)移，說明MPTMS作為硅烷，不但能夠完成自身的硅烷聚合，而且與QDs具有很好的相容性，配體交換不能導(dǎo)致聚合過程中的光學(xué)性質(zhì)變化。微球表面未配位的MPTMS可以提供大量的活性巰基，盡管巰基在紅外區(qū)的特征峰很弱，從微球的紅外光譜(圖1b)上依然可以發(fā)現(xiàn)巰基的特征峰(2 556 cm-1)。同時利用DTNB法測的微球表面的巰基含量為0.7 μmol/g，可見本文合成方法的制備條件相對溫和，對巰基的穩(wěn)定性影響比較小，可以減少巰基的氧化和脫落現(xiàn)象的發(fā)生，在微球表面能夠保留大量的巰基。

圖2a為純SiO2微球與包裹QDs微球的XRD譜圖，都可以在20°附近觀察到無定型SiO2的衍射峰，但沒有CdTe衍射峰的出現(xiàn)，可能是QDs的粒徑過小和在硅球中的含量較低導(dǎo)致XRD衍射峰強(qiáng)度過低而難以被發(fā)現(xiàn)。但通過EDXA(圖2b)可以在微球中檢測到Cd和Te元素的存在，從而確定微球包覆了QDs，同時也能看出微球中含有大量的硫元素。另外從TEM照片(圖2d)中能夠清晰地看到QDs的晶格線，也證明了QDs被SiO2有效包裹，同時QDs沒有出現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象，說明MPTMS與MPA的配體交換對硅球的形成沒有顯著影響。圖2e為微球的熒光圖片，從圖中可以看見明亮的熒光，而且微球具有良好的單分散性(圖2c)。

2.2 影響粒徑及單分散性的主要因素

2.2.1反應(yīng)時間對單分散性的影響圖3反應(yīng)時間分別為24、48和72 h制備出的熒光微球的SEM圖片，從圖中能夠清楚地發(fā)現(xiàn)，熒光微球都已成球，但反應(yīng)時間對微球的分散性有明顯的影響。這是由于硅烷在堿性條件下水解，MPTMS水解后生成的硅羥基相互脫水縮合形成Si-O-Si健，隨著反應(yīng)時間的延長逐漸縮合成球。當(dāng)反應(yīng)時間相對較短，微球表面的硅羥基大部分還沒有脫水縮合或部分未水解，微球表面和溶液中還會存在大量的硅羥基，離心清洗時，縮合就可能發(fā)生在微球之間，從而導(dǎo)致微球互相粘連在一起。當(dāng)反應(yīng)時間延長后，微球表面的游離羥基相互縮合成鍵，從而避免微球相互粘連提高單分散性。當(dāng)時間延長到72 h(圖3c)，微球基本呈現(xiàn)單分散狀，粒徑大約為0.95 μm，粒度分布如圖3d所示。因此，在室溫條件下，反應(yīng)時間為72 h后得到的微球單分散性最好。

2.2.2反應(yīng)溫度對單分散性的影響在保證微球單分散性的前提下，縮短反應(yīng)時間為48 h，提高反應(yīng)溫度到40 ℃、50 ℃、60 ℃，從圖4中可以看出，得到的產(chǎn)物都已成球，且粘連情況也隨溫度的升高逐漸改善?？梢婋S著溫度的升高，MPTMS的水解和聚合速度都逐漸加快。但溫度升高能導(dǎo)致巰基的氧化、脫落等副反應(yīng)，大大降低了微球表面的巰基含量，不利于微球的后續(xù)應(yīng)用。因此，制備微球最佳的反應(yīng)溫度應(yīng)該低于50 ℃。

2.2.3反應(yīng)轉(zhuǎn)速對粒徑和粒度分布的影響通過轉(zhuǎn)速控制微球粒徑的報導(dǎo)相對較少，因為考察轉(zhuǎn)速對粒徑的影響對后續(xù)研究具有參考價值。在40 ℃條件下，設(shè)定反應(yīng)時間為48 h，轉(zhuǎn)速為400、500、800、1 000 r/min時，從圖5可以得知，在此條件下微球成球率都非常好，隨著轉(zhuǎn)速的增加，微球直徑從0.9 μm增加到1.25 μm，這是因為增大攪拌速度，能使單體更迅速地附著在微球表面，即促進(jìn)微球快速生長。轉(zhuǎn)速同樣會影響微球的粒度分布，轉(zhuǎn)速較低時，隨著攪拌速度的增加，微球的粒度分布先收斂，隨后渙散，當(dāng)轉(zhuǎn)速為500 r/min時，微球的均一性最好，粒度分布系數(shù)(微球尺寸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD))為4.2%(圖5d)。

在微球的制備過程中，成核與生長過程不能完全分開，相互之間的競爭相對激烈，當(dāng)攪拌速度較低，微球的均一性也較差。當(dāng)攪拌速度增加到500 r/min，單體附著在穩(wěn)定的核或微粒表面的概率更大，當(dāng)大量核出現(xiàn)后，單體選擇沉積在核表面，獨自成核變得不穩(wěn)定，即使有部分成核，根據(jù)Orstwald理論，只有當(dāng)微粒成長到一定臨界尺寸時，它才能繼續(xù)生長，否則將分解成單體，為其它微粒生長提供活性單體。但是如果繼續(xù)增加攪拌速度，微粒的生長超過臨界尺寸，粒徑越大的微粒，比表面積越大，附著單體的概率越大，最終導(dǎo)致粒度分布變寬。

2.3 熒光微球在流式技術(shù)中的應(yīng)用

為驗證QDs@SiO2微球作為編碼微球的應(yīng)用前景，將QDs熒光微球作為分析對象，使用BD Accuri C6流式細(xì)胞分析儀檢測空白熒光微球FMI數(shù)值并記錄。以四個通道的熒光強(qiáng)度統(tǒng)計結(jié)果對FSC-A作圖，單位為對數(shù)測量單位，從圖6中各數(shù)據(jù)點的分布可以看出，通道2的熒光強(qiáng)度與其他通道的有明顯差異。這是因為微球的熒光發(fā)射峰位在590 nm，正處于通道2的測試范圍(580/45)內(nèi)，所以通道2的信號強(qiáng)度明顯大于其他通道信號，且其他通道信號幾乎都小于1 000，可以確定為背景光。另外，因為QDs的激發(fā)范圍較寬，用同一波長可以激發(fā)不同熒光的QDs，因此不同通道可以實現(xiàn)不同QDs熒光微球的同步檢測。將熒光微球分散在Tris-HCl、KH2PO4-K2HPO4、HAc-NaAc、NaOH-硼砂等緩沖溶液中，流式檢測結(jié)果未受影響，證明該方法制備的QDs@SiO2微球具有作為熒光編碼微球的潛質(zhì)。

3 結(jié)論

本文通過MPTMS自身水解縮合包覆量子點制備了QDs@SiO2熒光微球，該方法有效提高包覆QDs的數(shù)量以及微球的熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性。通過控制反應(yīng)時間、溫度和轉(zhuǎn)速，確保微球的粒徑均一性和單分散性。將微球用于流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測試，能夠得到明顯的FMI檢測結(jié)果，具備作為流式分析編碼微球的潛質(zhì)。