梁水美 范陽陽 劉艷艷 卞如如 朱天翼 張全芳 步迅

摘要：為了達(dá)到從分子水平上檢測(cè)化妝品動(dòng)物源性成分的目的，本研究建立了一種從化妝品中提取動(dòng)物源性基因組DNA的方法。該方法使用Chelex-100結(jié)合玻璃奶提取化妝品中的基因組DNA，具有污染小、操作簡(jiǎn)單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)。分別利用紫外分光光度計(jì)、普通PCR和DNA測(cè)序等方法對(duì)提取DNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明DNA濃度和純度均能達(dá)到后期分子檢測(cè)要求。說明本方法提取的DNA適用于在分子水平上檢測(cè)化妝品的動(dòng)物源性成分。

關(guān)鍵詞：化妝品；動(dòng)物源性；基因組DNA；提取方法

中圖分類號(hào)：S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）09-0131-05

AbstractIn order to achieve the purpose of detecting animal origin of cosmetics at the molecular level， a method for extracting genomic DNA of animal origin from cosmetics was established. The Chelex-100 and Glass-milk were used to extract genomic DNA from cosmetics. This method had advantages of less pollution， easy to operate， fast and high efficient. Then， the quality of genomic DNA was detected by UV spectrophotometer， PCR and DNA sequencing. The results showed that the concentration and purity of DNA both met the requirements of later molecular experiment. It indicated that the DNA exacted by this method was suitable for the detection of animal origin of cosmetics at the molecular level.

KeywordsCosmetics； Animal origin； Genomic DNA； Extraction method

近年來具有美容護(hù)膚功效的馬油、馬奶和驢奶等被廣泛應(yīng)用于化妝品中，且此類化妝品倍受亞洲女性青睞。馬油的應(yīng)用在我國(guó)歷史悠久，《名醫(yī)別錄》中記載馬脂肪具有生發(fā)護(hù)發(fā)作用，《本草綱目》中記載馬脂肪味甘、平、生發(fā)。馬油易被皮膚吸收且有美白作用，另外還有加速皮膚新陳代謝、增強(qiáng)細(xì)胞活力、抗皮膚衰老等功效[1]。馬奶被阿拉伯人視為“阿拉所賜的神藥”，歐洲貴婦人使用馬奶沐浴以保持皮膚光滑、美麗，馬奶洗面奶不僅能防止皮膚老化，還有消除皺紋的神奇功效[2]。驢奶中的VA、VE、VC和B族維生素抗氧化、抗衰老，可阻止細(xì)胞內(nèi)不飽和脂肪酸氧化分解，阻止皮膚干燥和角質(zhì)化，其中所含的芋堿酸可以使皮膚細(xì)白、柔嫩光滑、有彈性[3]。

由于馬油、馬奶和驢奶具有很好的美容功效，所以近年來馬油、馬奶和驢奶制品的價(jià)格均高于普通的牛奶制品，市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，部分沒有驢、馬資源的化妝品廠家用牛奶冒充驢奶和馬奶，甚至有的廠家的馬奶、驢奶化妝品中不含有任何動(dòng)物源性成分，嚴(yán)重危害了消費(fèi)者的健康和利益。

目前我國(guó)對(duì)化妝品中動(dòng)物源性成分的檢測(cè)還比較薄弱。從分子水平上檢測(cè)化妝品中的動(dòng)物源性成分是最準(zhǔn)確有效的方法，而該方法首先需從化妝品中提取基因組DNA。由于化妝品特殊的加工工藝及所含成分復(fù)雜，其中的DNA成分已受到嚴(yán)重的破壞，這給DNA的提取帶來很大困難。本研究旨在建立一種能簡(jiǎn)單、快速、高效地從化妝品中提取動(dòng)物源性基因組DNA的方法，為化妝品中動(dòng)物源性成分的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

市售不同品牌的馬和驢動(dòng)物源性油膏、面膜、面霜、乳液和洗面奶等化妝品共20份。

1.2試劑與設(shè)備

Chelex-100為Sigma公司產(chǎn)品；Glass Milk為Thermo產(chǎn)品；DNA分子量Marker DL2000、TaKaRa PCR儀、電泳上樣緩沖液等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；蛋白酶K購(gòu)自生工（上海）有限公司；5424D型高速離心機(jī)，Eppendorf公司；凝膠成像儀，BIO-RAD公司。

1.3化妝品中動(dòng)物源性DNA的提取

取液體狀（200 μL）、膏狀或固體（200 mg）化妝品樣品放入2 mL離心管中，加入5%的Chelex-100 280 μL及20 mg/mL蛋白酶K 20 μL，56℃保溫30 min以上，高速振蕩5～10 s；100℃水浴8 min，高速振蕩5～10 s；13 000 r/min離心3 min，將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中（候選步驟，將溶液轉(zhuǎn)移至離心柱中，13 000 r/min離心1 min，收集液體），加入Glass Milk 20 μL及 gDNA Binding Buffer （6 mol/L NaCl） 600 μL，充分混勻，65℃水浴15 min，期間顛倒混勻幾次；室溫放置5 min，期間顛倒混勻幾次；4 000 r/min離心1 min，棄上清，留管底；70%（體積分?jǐn)?shù)）酒精500 μL，洗滌，8 000 r/min離心1 min，重復(fù)此步驟2次；加入500 μL無水乙醇，吹打懸浮，洗滌，8 000 r/min離心1 min，棄上清；8 000 r/min離心 30 s，用10 μL槍頭吸走殘余液體，室溫干燥10 min；加100 μL TE （pH 7.0） 70℃水浴5 min，離心，吸取上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，使用Nanodrop核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA的濃度和純度，要求濃度在1～20 ng/μL之間，OD值1.7～1.8之間，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4牛、馬和驢通用引物的設(shè)計(jì)

從NCBI數(shù)據(jù)庫中分別下載牛、馬和驢3種動(dòng)物的線粒體16S rDNA基因序列各10條，并進(jìn)行同源性比對(duì)，選取同源性高的序列兩端利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，F(xiàn)：5′-AAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTA-3′，R： 5′-GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)239 bp。

1.5常規(guī)PCR和DNA測(cè)序檢測(cè)

PCR擴(kuò)增采用25 μL體系，其中含10×PCR Buffer （含2 mmol/L Mg2+）2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、5 U Taq酶0.2 μL、10 μmol/L正反向引物各1 μL，DNA模板2 μL，超純水16.3 μL。采用降落PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物純化回收，ABI 3730XL DNA測(cè)序儀測(cè)序（由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院測(cè)序中心完成）。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA質(zhì)量分析

檢測(cè)結(jié)顯示，從20份市售化妝品中提取的基因組DNA OD260/OD280在1.7～1.9之間，平均值為1.8；DNA濃度在14.8～27.8 ng/μL之間，平均濃度為19.8 ng/μL，純度及濃度均能達(dá)到后續(xù)PCR檢測(cè)的要求。

2.2PCR檢測(cè)結(jié)果

以20份市售化妝品中提取的DNA為模板，使用馬、牛和驢的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除空白對(duì)照無擴(kuò)增條帶外，20份化妝品的DNA均有擴(kuò)增，片段大小與目的片段一致，且條帶清晰。

2.3DNA測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

20份市售化妝品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示，只有1、7、8、10、11、14、17、18、19的測(cè)序峰圖單一，無套峰現(xiàn)象，表明這9份化妝品含有的源性成分單一，其他11

份均有套峰現(xiàn)象，表明其中含有不止一種動(dòng)物源性成分。在NCBI上進(jìn)行BLAST分析發(fā)現(xiàn)，7、10和11為牛源性成分，1、8、14、17、18和19為產(chǎn)品標(biāo)示的源性成分。部分源性成分單一化妝品的測(cè)序峰圖見圖2-圖4。

3討論與結(jié)論

含有動(dòng)物成分的產(chǎn)品包括化妝品中動(dòng)物源性成分的檢測(cè)主要應(yīng)用近紅外法[4，5]、ELISA[6]（酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)）和PCR法[7]等。PCR法是目前常用的檢測(cè)方法，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR法依據(jù)物種特異性DNA序列，是當(dāng)前物種源性鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)化妝品中的動(dòng)物源性成分，首先需要從化妝品中提取基因組DNA，DNA的質(zhì)量直接影響PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序等后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果。紫外分光光度計(jì)測(cè)定可初步明確基因組DNA的濃度和純度，內(nèi)源基因的PCR擴(kuò)增能進(jìn)一步確定提取DNA的純度和DNA中是

否存在抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，有效避免PCR反應(yīng)出現(xiàn)假陽性結(jié)果[8]。

以往報(bào)道的從化妝品中提取基因組DNA的方法多使用氯仿、異戊醇、甲醇和四氫呋喃等有害試劑[9]，且耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，本研究所使用的Chelex-100和Glass Milk等試劑無毒、提取耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單，具有快速、簡(jiǎn)單、高效、適用范圍廣（適用于液狀、膏狀和固態(tài)等不同狀態(tài)化妝品中DNA的提取）等優(yōu)點(diǎn)。

應(yīng)用本方法提取20份市售化妝品基因組DNA，紫外分光光度法檢測(cè)OD260/OD280值在1.7～1.9范圍內(nèi)，平均純度為1.8，平均濃度為19.8 ng/μL，表明基因組DNA的質(zhì)量較好，并通過普通PCR法和DNA測(cè)序?qū)μ崛〉腄NA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明本方法能快速有效地提取化妝品中的動(dòng)物源性DNA。該方法為從分子水平檢測(cè)化妝品中的動(dòng)植物源性成分奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)可為相關(guān)監(jiān)督部門對(duì)化妝品的監(jiān)管提供幫助，具有重要的實(shí)踐性意義。參考文獻(xiàn)：

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