莊美玲，劉天慶，宋克東，王樹萍

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新型溫敏性中空纖維膜的制備與表征

莊美玲，劉天慶，宋克東，王樹萍

（大連理工大學化工與環(huán)境生命學部干細胞與組織工程研發(fā)中心，遼寧大連 116024）

采用自由基聚合方法對中空纖維膜（hollow fiber membranes, HFMs）進行了-異丙基丙烯酰胺（NIPAAm）的接枝聚合，制備了一系列PNIPAAm--HFMs，同時考察了成纖維細胞在PNIPAAm--HFMs表面的培養(yǎng)與降溫脫附情況。傅里葉紅外光譜和元素分析結果表明PNIPAAm成功地在中空纖維膜上接枝聚合。動態(tài)接觸角分析結果顯示，當溫度降至LCST以下，PNIPAAm--HFMs表面接觸角明顯降低；蛋白黏附測定結果進一步證實了當溫度發(fā)生改變時，PNIPAAm--HFMs表面呈現(xiàn)親疏水性質變化，即具有溫敏性。37℃時，成纖維細胞在HFMs-0.005, HFMs-0.01和HFMs-0.05表面均能正常黏附、鋪展與增殖；而HFMs-0.2不適宜細胞的黏附與生長。降溫孵育后，黏附于PNIPAAm--HFMs表面的細胞發(fā)生明顯的形態(tài)變化并從其表面發(fā)生脫附，細胞脫附率高達90%以上。以上實驗結果表明，PNIPAAm--HFMs具有良好的溫敏性，可實現(xiàn)細胞的降溫脫附，可與生物反應器相結合用于貼壁型細胞的大規(guī)模擴增與降溫收獲。

聚-異丙基丙烯酰胺；中空纖維膜；接枝聚合；溫敏性；細胞脫附

引 言

組織工程和細胞移植等再生醫(yī)學領域需要大量的種子細胞（109～1011）[1-2]，但是來源于人或者動物組織或體液中的原始種子細胞數(shù)量不足，因此體外擴增并收獲大量保持生物學特性的種子細胞對再生醫(yī)學具有重要的意義。由于具有較大的比表面積，中空纖維膜（hollow fiber membranes，HFMs）可為細胞黏附提供較大的面積，因此其常與生物反應器相結合用于體外細胞的大規(guī)模培養(yǎng)與擴增[3-4]。然而對于貼壁型細胞而言，如何有效并快速地實現(xiàn)細胞的收獲是一個重要的問題。胰酶消化法是目前最常用的細胞收獲方法。胰酶消化是通過選擇性水解蛋白質肽鏈的方式切斷貼壁細胞與培養(yǎng)基底之間的連接從而使細胞脫附[5]。該方法不僅會破壞細胞間的連接蛋白導致細胞的各自解離，更會切斷整聯(lián)蛋白與細胞骨架肌動蛋白之間的連接，導致細胞膜蛋白的損傷，進而破壞了細胞膜導致細胞功能的損失[6-7]。

溫敏性材料聚-異丙基丙烯酰胺[poly(-isopropylacrylamide)，PNIPAAm]的研發(fā)為上述問題的解決提供了新思路。1990年，日本東京女子醫(yī)科大學的Okano等[8]首次利用PNIPAAm制備了溫敏表面，用于細胞的培養(yǎng)與降溫非損傷性收獲。PNIPAAm及其衍生物水溶液會隨溫度的改變發(fā)生可逆的相轉變過程，發(fā)生相轉變時的溫度為最低臨界溶解溫度（LCST，一般在32℃左右）。以PNIPAAm為主的溫敏表面可根據(jù)溫度的改變呈現(xiàn)完全不同的構型和表面潤濕性；在37℃時，溫敏表面呈弱疏水性，適于細胞的黏附和生長；當溫度低于LCST時，表面呈親水性并發(fā)生溶脹，從而使細胞脫附。此后大量的研究結果均表明以PNIPAAm為主體的溫敏表面可以有效地替代傳統(tǒng)酶解法進行細胞的回收[9-11]。

關于溫敏性中空纖維膜的制備并用于細胞培養(yǎng)與收獲目前尚鮮有報道。Wang 等[12]采用過硫酸鉀作為引發(fā)劑，在經(jīng)過堿處理的PVDF中空纖維膜表面進行PNIPAAm的聚合修飾，制備了溫敏性中空纖維膜。純水動態(tài)流量實驗表明，當PNIPAAm的接枝率為11%和36%時，該膜的純水通量隨溫度發(fā)生改變，即當純水溫度低于PNIPAAm的LCST（約33℃），膜表面的PNIPAAm修飾層處于溶脹狀態(tài)，導致PVDF中空纖維膜表面的孔被封閉，因而純水的通量較低，當溫度高于PNIPAAm的LCST時，PNIPAAm修飾層發(fā)生皺縮，膜表面的孔被釋放，因而純水的通量升高；此外他們在研究中也發(fā)現(xiàn)該溫敏性PVDF膜在低溫時具有很好的抗蛋白質污染性。然而，該研究的應用背景并不是細胞培養(yǎng)與收獲方面。

基于上述分析，本研究采用硝酸鈰銨作為引發(fā)劑，在經(jīng)堿處理后的HFMs表面氧化產(chǎn)生自由基，進而進行PNIPAAm的接枝聚合，從而制備具有溫敏特性的PNIPAAm--HFMs；并考察了成纖維細胞在PNIPAAm--HFMs表面的降溫脫附行為。

1 實驗材料和方法

1.1 試劑與儀器

-異丙基丙烯酰胺（-isopropylacrylamide，NIPAAm），純度99%，百靈威科技有限公司；醋酸纖維素中空纖維膜（cellulose acetate hollow fiber membrane，HFM），外徑175 μm, 內(nèi)徑149 μm，日本KAWASUMI；硝酸鈰銨（ceric ammonium nitrate，CAN），國藥集團化學試劑有限公司；HNO3和無水乙醇，分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），美國ScienCell；低糖培養(yǎng)基（low glucose-dulbecco’s modified eagle’s medium，LG-DMEM），美國Gibco。

傅里葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet Instrument Inc；元素分析儀，德國VarioELⅢ；DCA-322動態(tài)接觸角分析儀，美國Cahn公司；酶標儀，美國Bio-Tek公司；倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS OPTICAL CO. LTD。

1.2 PNIPAAm--HFMs的制備

將醋酸纖維素中空纖維膜在乙醇中浸泡清洗2 h后，置于0.05 mol·L-1NaOH 溶液中室溫水解24 h，然后用大量的去離子水進行沖洗，25℃真空干燥備用。NIPAAm接枝改性中空纖維膜的過程參考文獻[13-14]。將總長度為2000 cm的中空纖維膜置于三口燒瓶中，加入25 ml 0.1 mol·L-1的HNO3溶液，密封后通入氮氣，同時置于水浴中加熱至 60℃，氮氣環(huán)境下加入0.137 g CAN；30 min后加入一定質量的NIPAAm （NIPAAm的濃度分別為0、0.005、0.01、0.05、0.1 和0.2 mol·L-1），置于25℃水浴、氮氣保護下反應6 h。反應結束后，用大量去離子水沖洗PNIPAAm--HFMs（分別記為HFMs-0、HFMs-0.005、HFMs-0.01、HFMs-0.05、HFMs-0.1和HFMs-0.2），后置于去離子水中高壓蒸汽滅菌，密封備用。

1.3 PNIPAAm--HFMs的表征

采用傅里葉變換紅外光譜儀考察接枝PNIPAAm后中空纖維膜的化學結構。利用元素分析儀對中空纖維膜進行元素分析，并通過式（1）計算其PNIPAAm接枝量[15-16]。采用動態(tài)接觸角分析儀，通過Wilhelmy吊片法分別測定20℃和37℃時PNIPAAm接枝改性后中空纖維膜的動態(tài)接觸角。采用Bicinchoninic Acid （BCA）蛋白定量試劑盒測定接枝PNIPAAm后中空纖維膜在20℃和37℃時蛋白吸附量（μg·cm-2）。

grafted amount(1)

式中，p和0分別為PNIPAAm--HFMs和未接枝PNIPAAm的HFMs中N元素含量，%；p,theor為PNIPAAm聚合物N元素含量理論值；為HFMs的比表面積，1116 cm2·g-1。

1.4 PNIPAAm接枝改性中空纖維膜用于細胞的收獲

將高壓蒸汽滅菌后的PNIPAAm--HFMs平鋪于培養(yǎng)皿中，PBS清洗3次，每次20 min；加入10% FBS+LG-DMEM，37℃下無菌孵育過夜。吸除培養(yǎng)基后，滴加50 μl 5×105cells·ml-1的SD大鼠新生鼠皮膚成纖維細胞，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，二次接種，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育3 h后，將中空纖維膜-細胞復合物移至新的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)2 d后，用37℃的PBS清洗兩次，以去除未黏附至中空纖維膜上的細胞，然后加入新鮮無血清的冷LG-DMEM，在顯微鏡下連續(xù)觀察細胞形態(tài)變化。

降溫孵育至細胞變?yōu)閳A形后，輕輕吹打中空纖維膜，收集脫附下來的細胞，未脫附的細胞采用胰酶消化法進行收獲。采用血球計數(shù)儀對各組脫附下來的細胞及未脫附的細胞進行計數(shù)，并通過式（2）計算細胞的脫附率。

式中，1和2分別為脫附和未脫附的細胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學分析

每組實驗重復3次，采用Origin 7.5軟件進行統(tǒng)計學處理，所有數(shù)據(jù)以“means±SD”表示，組間比較采用單因素方差分析和檢驗。＜0.05時具有顯著性差異（*），＜0.01時具有非常顯著性差異（**）。

2 實驗結果與討論

2.1 PNIPAAm--HFMs的化學結構表征

圖1顯示了中空纖維膜的衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜。羥基（OH）的伸縮振動吸收峰和亞甲基（CH2）的伸縮振動吸收峰分別出現(xiàn)在3350和2900 cm-1附近；與糖苷鍵伸縮振動有關的連續(xù)特征吸收峰出現(xiàn)在1020～1450 cm-1處，這些是典型的纖維素類特征峰。與未接枝PNIPAAm的中空纖維膜的紅外光譜對比， PNIPAAm接枝修飾后的中空纖維膜在1650 cm-1處的羰基（CO）和1371 cm-1處的甲基（CH3）的伸縮振動吸收峰的強度增強，這主要是由于PNIPAAm中含有大量的羰基和甲基。此外在1550 cm-1處出現(xiàn)了新的酰胺鍵II（NH）的彎曲振動吸收峰，這說明PNIPAAm成功地接枝修飾到中空纖維膜上。

圖1 HFMs的ATR-FTIR譜圖

a—ungrafted HFMs; b—PNIPAAm--HFMs

表1展示出所制備的一系列溫敏性中空纖維膜的N元素含量及PNIPAAm的接枝量。經(jīng)過PNIPAAm修飾后，中空纖維膜中N元素的含量有所增加，且隨著NIPAAm濃度增加，N元素的含量呈增加趨勢，PNIPAAm的接枝量也相應增加，這也證實了PNIPAAm可成功在中空纖維膜上接枝聚合。然而，與理論接枝量相比，PNIPAAm在HFMs上的接枝量很少。這是由于在接枝聚合過程中，NIPAAm也會發(fā)生自聚反應，從而使實際接枝量小于理論值；此外，反應過程中無氧環(huán)境有可能受到破壞，氧氣進入反應體系，導致了自由基淬滅，接枝聚合反應終止，進一步降低了PNIPAAm接枝量。

表1 HFMs氮元素含量及PNIPAAm接枝量

2.2 PNIPAAm--HFMs的溫敏性

在調(diào)控細胞黏附與脫附時，PNIPAAm修飾后的表面在溫度發(fā)生變化時所表現(xiàn)出的親疏水性質的變化是一項重要的表面特性[17]。因此，本研究采用威廉吊片法和BCA法對中空纖維膜表面的潤濕性與蛋白吸附能力分別進行了測定。

采用威廉吊片法，在20℃和37℃下分別對中空纖維膜表面的動態(tài)接觸角進行檢測，結果如表2所示。當溫度由20℃升至37℃時，PNIPAAm修飾的中空纖維膜表面動態(tài)接觸角增加，即中空纖維膜表面疏水性增強。這與PNIPAAm所具有的特性是一致的，即當溫度低于LCST（32℃）時，親水性基團（酰胺基）通過氫鍵作用與水分子相結合，PNIPAAm鏈呈舒展狀態(tài)，從而導致溫敏性表面呈現(xiàn)親水性；當溫度高于LCST時，親水性基團與水分子間的氫鍵作用減弱，疏水性基團（異丙基）之間的疏水締合作用增強，PNIPAAm鏈呈蜷縮狀態(tài)，從而導致溫敏性表面呈現(xiàn)疏水性[18-19]。與此同時對比不同組的動態(tài)接觸角后發(fā)現(xiàn)，當PNIPAAm接枝量增大時，表面的接觸角會有所下降，這可能是由于當中空纖維膜表面PNIPAAm接枝量增加時，中空纖維膜表面PNIPAAm層相應變厚，導致其表面在37℃和20℃時均呈現(xiàn)高度水合狀態(tài)，因而動態(tài)接觸角有所減小，表面親水性增強[20-21]。

表2 中空纖維膜的動態(tài)接觸角

此外表2還表明了溫敏性中空纖維膜表面的PNIPAAm接枝量與不同溫度間動態(tài)接觸角的差值之間的關系。即當PNIPAAm接枝量由2.65 μg·cm-2增加至44.09、50.65、62.58 μg·cm-2時，37℃和20℃間的動態(tài)接觸角差值呈下降趨勢。這可能與溫敏性表面的PNIPAAm層厚度和構象有關[20]。當溫度從37℃降至20℃時，位于表面最外層的PNIPAAm鏈發(fā)生快速的疏水締合，進而在最外層形成較致密層，阻止了內(nèi)部水分子的排出。因此PNIPAAm層較厚時，其構象改變程度較小，動態(tài)接觸角的變化差值相應會比較小。

與細胞黏附有關的蛋白在基底表面的黏附是細胞在材料表面黏附的重要過程，也是用來評價材料表面溫敏性的重要指標，因而本研究測定了37℃和20℃時胎牛血清蛋白在溫敏性中空纖維膜表面的黏附量。胎牛血清是去除血漿中的纖維蛋白而形成的一種復雜的混合物，其包含多種蛋白質，如與細胞黏附息息相關的層粘連蛋白和纖維連接蛋白，以及促進細胞間相互聯(lián)系和生長的膠原蛋白等。胎牛血清是體外培養(yǎng)細胞重要的組成部分，因此本研究選用胎牛血清作為模型蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒對中空纖維膜的表面蛋白黏附能力進行了檢測，結果如圖2所示。經(jīng)過PNIPAAm修飾后的中空纖維膜在20℃和37℃下的蛋白黏附量大多小于未經(jīng)PNIPAAm修飾的中空纖維膜表面的蛋白黏附量。有研究表明當含有親水性基團的聚合物在基底表面的接枝量致密時，由于空間位阻效應，蛋白黏附量較低[17,22]。因此，當PNIPAAm接枝量由2.65 μg·cm-2增加至44.09、50.65和62.58 μg·cm-2時，表面的蛋白黏附量呈下降趨勢。此外，經(jīng)PNIPAAm修飾后的中空纖維膜在20℃時的蛋白黏附量明顯小于37℃時的蛋白黏附量；當溫度為20℃時，中空纖維膜表面由于呈現(xiàn)親水性，導致胎牛血清中的疏水性蛋白（纖維連接蛋白和層粘連蛋白）不易黏附到其表面；當溫度升至37℃時，由于PNIPAAm鏈的疏水締合作用，使其PNIPAAm層結構由舒展狀態(tài)變化為蜷縮狀態(tài)，從而使中空纖維膜表面呈現(xiàn)出疏水性，進而利于疏水性的蛋白的黏附[23-24]。因此，溫敏性中空纖維膜表面的蛋白黏附能力不僅與溫度有關，還與PNIPAAm的接枝量有關。

圖2 20℃和37℃時PNIPAAm-g-HFMs表面蛋白吸附量

NS—not significant; *—＜0.05; **—＜0.01

2.3 成纖維細胞在PNIPAAm--HFMs表面的培養(yǎng)與降溫脫附

將成纖維細胞接種到PNIPAAM--HFMs表面上進行培養(yǎng)，12 h和48 h后觀察細胞狀態(tài)，結果如圖3所示。培養(yǎng)12 h后，細胞可在HFMs-0.005、HFMs-0.01和HFMs-0.05表面黏附并呈鋪展狀態(tài)，與對照組HFMs-0相比，細胞形態(tài)無明顯差異。而HFMs-0.2組不適宜細胞的黏附，細胞多呈圓形。培養(yǎng)48 h后，HFMs-0.2組只有少量的細胞黏附，大量的細胞遷移至培養(yǎng)皿底部生長增殖；其他組HFMs表面上細胞鋪滿中空纖維膜表面，表現(xiàn)出良好的增殖能力。與此同時，HFMs之間細胞出現(xiàn)了搭橋的現(xiàn)象。

圖3 成纖維細胞在中空纖維膜表面的生長形態(tài)

培養(yǎng)2 d后，對成纖維細胞在HFMs-0、HFMs- 0.005、HFMs-0.01和HFMs-0.05表面降溫脫附過程進行考察。圖4展示了降溫脫附過程中細胞形態(tài)的變化。降溫孵育過程中，HFMs-0表面的細胞一直處于黏附鋪展狀態(tài)，細胞形態(tài)無明顯變化[圖4(a)]。而PNIPAAm--HFMs組的細胞形態(tài)均發(fā)生了明顯的變化。如圖4(b)所示，加入20℃培養(yǎng)基孵育40 min后，HFMs-0.005表面黏附的細胞由鋪展狀態(tài)變?yōu)閳A形皺縮狀。HFMs-0.01表面細胞的形態(tài)變化較快，孵育20 min后，鋪展狀態(tài)的細胞便完全皺縮變圓[圖4(c)]。而HFMs-0.05表面上細胞完全皺縮變圓需要降溫孵育30 min[圖4(d)]。當細胞形態(tài)變圓后，輕輕吹打中空纖維膜，細胞團簇便可從溫敏膜表面完全脫附下來。上述結果與Okano等[25]報道的細胞在溫敏材料表面降溫脫附時首先發(fā)生細胞形態(tài)的變化、隨后從材料表面脫附的過程相一致。此外，各組PNIPAAm--HFMs降溫收獲細胞效率均達90%以上，而未經(jīng)過PNIPAAm修飾的HFMs-0組細胞脫附率僅為4.27%±1.64%。即PNIPAAm--HFMs可有效地通過降溫處理收獲細胞。

圖4 降低溫度后HFMs表面成纖維細胞的形態(tài)變化

在細胞降溫脫附過程中，PNIPAAm接枝量不同，細胞形態(tài)完全皺縮變圓所需要的時間也不相同。當PNIPAAm接枝量由0.8 μg·cm-2增加至2.65μg·cm-2時，細胞發(fā)生明顯形態(tài)變化所需要的時間縮短，而當接枝量繼續(xù)增加至44.09 μg·cm-2時，脫附過程耗時增加。這與溫敏性中空纖維膜表面的親疏水性質的變化程度有關。接枝量過低或者過高時，溫敏表面的親疏水性質變化程度較弱，因此細胞受到的脫附推動力也就較弱，細胞脫附過程所需要的時間也就較長。

Knazek等[26]于1972年首次報道了將中空纖維膜用于細胞培養(yǎng)。由于具有較大的比表面積，中空纖維膜可為黏附型細胞提供高達200 cm2·ml-1的黏附表面，從而實現(xiàn)細胞高密度（108cells·ml-1）的培養(yǎng)；此外中空纖維膜的多孔結構也可加速營養(yǎng)代謝物質的傳遞、有利于細胞間信號傳導和細胞因子的相互作用，可更真實地模擬細胞在體內(nèi)生長的微環(huán)境[27]。因此，利用中空纖維膜生物反應器可以進行細胞的大規(guī)模培養(yǎng)與擴增。對中空纖維膜進行PNIPAAm接枝修飾后，中空纖維膜不僅可保持其原有優(yōu)勢，而且具有了溫敏特性。這種溫敏性中空纖維膜用于細胞培養(yǎng)時可通過改變培養(yǎng)基的溫度來調(diào)節(jié)細胞的黏附與脫附，即當培養(yǎng)液溫度高于LCST（約32℃）時，中空纖維膜表面呈弱疏水性，由疏水性蛋白（如纖維連接蛋白、層粘連蛋白）介導的細胞黏附過程可實現(xiàn)細胞在中空纖維膜上黏附與生長；當培養(yǎng)液溫度降至20℃時，中空纖維膜表面變?yōu)槿跤H水性，疏水性蛋白與中空纖維膜間的錨定作用減弱，此時細胞在細胞骨架重建作用下發(fā)生形態(tài)變化（由鋪展狀態(tài)變?yōu)閳A形）進而從其表面脫附下來。綜上所述，溫敏性中空纖維膜可用于黏附型細胞的大規(guī)模培養(yǎng)與非酶解收獲。

表3 成纖維細胞在HFMs表面的降溫脫附率

3 結 論

（1）ATR-FTIR圖譜分析及元素分析實驗結果均表明PNIPAAm能接枝聚合到HFMs上。單體溶液中NIPAAm溶度增大，會使HFMs上的PNIPAAm接枝量增加。

（2）動態(tài)接觸角和BCA蛋白定量測定結果均證實PNIPAAm--HFMs可隨溫度改變發(fā)生親疏水性變化，即具有溫敏性。

（3）細胞生長與脫附實驗表明，HFMs-0.005、HFMs-0.01和HFMs-0.05均可用于細胞的培養(yǎng)與降溫收獲；當PNIPAAm接枝量為2.65 μg·cm-2時，細胞脫附過程耗時最少。

（4）PNIPAAm接枝量在一定程度上影響PNIPAAm--HFMs的溫敏性；接枝量過高過低時，其表面親疏水性變化程度較低，細胞脫附所需時間增加。因此，在制備溫敏性中空纖維膜時，PNIPAAm接枝量一定要控制在適宜的范圍內(nèi)。

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Preparation and characterization of novel thermo-responsive hollow fiber membranes

ZHUANG Meiling, LIU Tianqing, SONG Kedong, WANG Shuping

(Dalian R&D Center for Stem Cell and Tissue Engineering, Faculty of Chemical, Environmental and Biological and Technology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China)

Owing to the large scale area-to-volume ratio involved, hollow fiber membranes (HFMs) provide a tremendous amount of surface area for cell adhesion. Therefore, HFMs are widely used for large-scale expansion of cells. Traditionally, trypsinization is empolyed to harvest adhered cells from the surface of HFMs. However, this proteolytic enzyme treatment will destroy cell viability and function. Therefore, this study prepared a serious poly(-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) grafted HFMs (PNIPAAm--HFMs) with different grafted amounts, and the fibroblasts culture and detachment from PNIPAAm--HFMs with temperature reduction was also investigated. ATR-FTIR and elemental analysis results indicated that the PNIPAAm was covalently grafted on HFMs successfullyfree radical polymerization in the presence of cerium (Ⅳ). Dynamic contact angle measurements showed that the surface contact angle of water on PNIPAAm--HFMs decreased significantly when the temperature dropped below LCST. Additionally, the protein adhesion assay results further confirmed that PNIPAAm--HFMs exhibited thermo-responsive property, namely hydrophilic-hydrophobic phase transition with temperature changed. MEFs adhered, spread and grew well on the surface of PNIPAAm-grafted HFMs except HFMs-0.2 at 37℃. In addition, the experiment of cell detachment showed that the cell can be released from PNIPAAm--HFMs with decreasing temperature and detachment efficiencies were above 90%. In conclusion, the PNIPAAm--HFMs with thermo-responsive property can be an attractive candidate for cell large-scale expansion and cell detachment with temperature reduction.

poly(-isopropylacrylamide); hollow fiber membranes; grafting polymerization; thermo-responsive; cell detachment

2016-05-27.

Prof. LIU Tianqing,liutq@dlut. edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20160723

Q 813.1；TB 381

A

0438—1157（2016）11—4866—07

莊美玲（1988—），女，博士研究生。

國家自然科學基金項目（31170945）。

2016-05-27收到初稿，2016-07-19收到修改稿。

聯(lián)系人：劉天慶。

supported by the National Natural Science Foundation of China (31170945).