王以斌 繆錦來(lái) 姜英輝 劉芳明 鄭洲 李光友

（1.國(guó)家海洋局第一海洋研究所，青島 266061；2.國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266061）

脯氨酸和可溶性糖在南極冰藻低溫適應(yīng)機(jī)制中的作用

王以斌 繆錦來(lái) 姜英輝 劉芳明 鄭洲 李光友

（1.國(guó)家海洋局第一海洋研究所，青島 266061；2.國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266061）

對(duì)低溫脅迫下兩種南極冰藻胞內(nèi)的脯氨酸和可溶性糖含量的變化進(jìn)行分析研究，探討兩種冰藻對(duì)低溫的適應(yīng)性機(jī)制。測(cè)定不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間下兩種南極綠藻細(xì)胞中的脯氨酸和可溶性糖含量，獲得其在低溫下隨溫度和脅迫時(shí)間變化的趨勢(shì)，分析其產(chǎn)生變化的原因。結(jié)果顯示，溫度越低，塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1胞內(nèi)的脯氨酸和可溶性糖含量增加越明顯。-5℃，培養(yǎng)48 h后，脯氨酸含量是初始值的6.5倍，可溶性糖含量增加60%。衣藻Chlamydomonas sp. L-4胞內(nèi)脯氨酸的含量同樣為溫度越低，胞內(nèi)脯氨酸的含量越高；但隨時(shí)間變化趨勢(shì)與塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1相反，含量隨溫度作用時(shí)間的增加出現(xiàn)減少的趨勢(shì)。-5℃，48 h后脯氨酸含量基本維持不變，可溶性糖含量增幅達(dá)90%。結(jié)果表明，脯氨酸和可溶性糖在南極冰藻的低溫適應(yīng)性機(jī)制中具有重要的作用，但在不同藻種中的作用機(jī)制不同。

南極冰藻；低溫適應(yīng)性；脯氨酸；可溶性糖

1963年Bunt［1］首次報(bào)道南極海水及海冰中有冰藻的存在。此后，各國(guó)科研人員對(duì)其展開(kāi)了大量的研究［2-4］。冰藻可以在南極低溫環(huán)境中快速生長(zhǎng)，是海冰生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級(jí)生產(chǎn)力來(lái)源［3，4］，并且可以耐受海冰反復(fù)凍融所產(chǎn)生的滲透壓急劇變化、高鹽度以及強(qiáng)紫外輻射等極端環(huán)境［4］。

脯氨酸和可溶性糖在高等植物的抗逆生理中發(fā)揮著重要的作用［5］。脯氨酸是在各種生物體內(nèi)均有分布的滲透保護(hù)物質(zhì)，在低溫脅迫條件下，高等植物通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸和可溶性糖含量來(lái)維持細(xì)胞的滲透壓，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)低溫的抵抗能力［6-8］。同時(shí)，可溶性糖的含量與植物抗寒性之間呈正相關(guān)［9］。然而，兩者在相對(duì)低等的海洋微藻的低溫脅迫生理適應(yīng)機(jī)制中的研究未見(jiàn)報(bào)道。

當(dāng)前，對(duì)于南極冰藻低溫適應(yīng)性的機(jī)制研究中，細(xì)胞膜適應(yīng)性變化、冰活性蛋白、不飽和脂肪酸、低溫酶等研究已相對(duì)較多［10］，而關(guān)于脯氨酸及可溶性糖的變化及與低溫適應(yīng)性的相關(guān)性研究較少。本研究通過(guò)分析兩種南極冰藻中的脯氨酸及可溶性糖在低溫脅迫下的變化趨勢(shì)，探究脯氨酸及可溶性糖在南極冰藻適應(yīng)極端低溫環(huán)境中的變化過(guò)程和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種及其培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)用南極冰藻為兩種單細(xì)胞綠藻，塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1和衣藻Chlamydomonas sp. L-4［11，12］，均為中國(guó)第18次南極科考所采集海冰樣品中分離所得，并在國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室獲得長(zhǎng)期保藏。

冰藻在溫控光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20-30 μmol/（m2·s），光暗周期為12∶12；培養(yǎng)基為f/2海水培養(yǎng)基，每日搖動(dòng)4-5次，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期［13］。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量的測(cè)定 細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量的測(cè)定采用酸性茚三酮法［14，15］。

取一定體積的南極冰藻培養(yǎng)液，低溫離心機(jī)4 000 r/min離心5 min，去除上清液后用蒸餾水洗滌。藻泥加入5 mL、5%的乙酸和20 mL蒸餾水，用研磨器研磨20 min后，加入1 g人造沸石，振蕩5 min，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清液3 mL，加入冰醋酸和茚三酮各3 mL，振蕩5 min后，沸水浴1 h，冷卻后加入苯3 mL，充分振蕩，測(cè)定515 nm的光吸收值。同時(shí)取相同體積的冰藻培養(yǎng)液，測(cè)定干重。

脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：Pro（μg/mL）=10.27x +0.00468。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出每毫升樣品中脯氨酸的含量，再計(jì)算出樣品中脯氨酸含量（mg/g）。

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)可溶性糖的提取及含量的測(cè)定 胞內(nèi)可溶性糖的測(cè)定方法采用蒽酮比色法［15，16］。

取一定體積的南極冰藻培養(yǎng)液，低溫離心機(jī)4 000 r/min離心5 min，去除上清液后用蒸餾水洗滌，藻泥加入乙醚后用研磨器研磨10 min成均勻糊狀，加入蒸餾水后放入燒杯中70-80℃水浴30 min，冷卻后滴加飽和中性醋酸鉛至完全沉淀，將混合物及沉淀在100 mL容量瓶中定容，充分振蕩混合后過(guò)濾取清液，清液用草酸鈉去除過(guò)量醋酸鉛后再次過(guò)濾，此時(shí)透明濾液即為可溶性糖提取液。

取1 mL可溶性糖提取液，加入5 mL蒽酮置于試管中，沸水浴中10 min，冷卻后用分光光度法在625 nm處測(cè)定光吸收值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出每毫升樣品中可溶性糖的含量，再計(jì)算出樣品中可溶性糖含量（mg/g）。

1.2.3 溫度對(duì)細(xì)胞內(nèi)脯氨酸和可溶性糖含量的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)定培養(yǎng)溫度為-5℃、0℃和5℃（-5℃-0℃視為低溫），每個(gè)溫度梯度分別處理6、12、24和48 h。測(cè)定不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間下兩種南極綠藻細(xì)胞中的脯氨酸和可溶性糖含量。

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)兩種綠藻胞內(nèi)脯氨酸含量的影響

溫度對(duì)塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1的脯氨酸含量的影響結(jié)果（圖1）顯示，塔胞藻L-1細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸含量在不同溫度作用下的變化幅度有較大差異。在溫度處理初始的6 h內(nèi)，3組別溫度作用下的L-1細(xì)胞內(nèi)脯氨酸的含量變化并不明顯，差別也不大；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，塔胞藻L-1細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸含量開(kāi)始增加，并且3組別溫度作用的細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量的變化有明顯差異。其中在-5℃下，塔胞藻L-1胞內(nèi)的脯氨酸含量增加最多，明顯超過(guò)其它兩組別溫度作用下的結(jié)果；處理48 h后，該組別細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸含量由0.48 mg/g增加到了3.24 mg/g，含量增加到初始值的6.5倍。0℃溫度組別的L-1在48 h后胞內(nèi)的脯氨酸含量也增到初始值的4.8倍；而5℃溫度組別的L-1胞內(nèi)脯氨酸的含量變化則相對(duì)小很多，僅增加到初始值含量的2倍左右。

圖1 溫度對(duì)Pyramidomonas sp. L-1（A）和Chlamydomonas sp. L-4（B）胞內(nèi)脯氨酸含量的影響

相同溫度條件作用下，衣藻Chlamydomonas sp. L-4胞內(nèi)脯氨酸的含量變化趨勢(shì)與塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1相反。同樣由圖1可知，衣藻L-4的細(xì)胞內(nèi)脯氨酸的含量隨著溫度作用時(shí)間的增加出現(xiàn)減少的趨勢(shì)。處理初始，3個(gè)組別的L-4細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸含量都是18.84 mg/g。-5℃處理48 h后，L-4胞內(nèi)的脯氨酸含量基本維持在了初始的含量狀態(tài)，雖略有減少但基本可以視為保持穩(wěn)定。在3個(gè)組別當(dāng)中，該組別細(xì)胞內(nèi)脯氨酸的含量相對(duì)最高，其它兩組別胞內(nèi)脯氨酸的含量都出現(xiàn)了明顯的下降；其中，0℃組別胞內(nèi)脯氨酸的含量降低最多，由0 h時(shí)的18.84 mg/g降低到了48 h后的14.99 mg/g，降幅達(dá)到了20%。

雖然兩種綠藻的胞內(nèi)脯氨酸含量的變化趨勢(shì)不同，但是衣藻Chlamydomonas sp. L-4胞內(nèi)脯氨酸的相對(duì)含量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1，其初始狀態(tài)時(shí)胞內(nèi)脯氨酸含量是L-1的近40倍。-5℃溫度處理48 h后，雖然L-1胞內(nèi)的脯氨酸含量有大幅度增加，但L-4胞內(nèi)的脯氨酸含量仍然是L-1的5.6倍，而這個(gè)差距也是3組溫度組別處理48 h后最小的。

雖然兩種綠藻胞內(nèi)脯氨酸含量的變化趨勢(shì)不同，但均在-5℃時(shí)具有相對(duì)最高的胞內(nèi)含量，這說(shuō)明低溫脅迫下細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸的積累在冰藻的低溫適應(yīng)性過(guò)程中發(fā)揮了積極的作用。

圖2 溫度對(duì)Pyramidomonas sp. L-1（A）和Chlamydomonas sp. L-4（B）胞內(nèi)可溶性糖含量的影響

2.2 溫度對(duì)兩種綠藻胞內(nèi)可溶性糖含量的影響

塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1經(jīng)過(guò)3個(gè)組別溫度處理48 h后，胞內(nèi)的可溶性糖含量出現(xiàn)較大差異，結(jié)果見(jiàn)圖2。其中，0℃和5℃的溫度處理后胞內(nèi)可溶性糖的含量變化相對(duì)于-5℃處理的結(jié)果非常微小。5℃條件下處理48 h后L-1胞內(nèi)可溶性糖的含量變化非常小，0℃組別胞內(nèi)的可溶性糖含量在12 h有所增加，12 h后基本維持在一定含量保持不變。-5℃組別的L-1胞內(nèi)可溶性糖含量變化最為明顯，其含量在處理6 h后開(kāi)始穩(wěn)定增加，由初始時(shí)的3.23 mg/g增加到了48 h時(shí)的5.13 mg/g，增加了約60%的含量。

溫度對(duì)衣藻Chlamydomonas sp. L-4胞內(nèi)可溶性糖含量變化的影響與塔胞藻L-1的變化趨勢(shì)相似，0℃與5℃處理48 h后的可溶性糖含量變化不明顯，-5℃處理48 h后變化較大，含量由初始時(shí)的3.76 mg/g增加到48 h后的7.13 mg/g，增加了90%的含量。

對(duì)比兩種綠藻細(xì)胞內(nèi)可溶性糖的含量，均在-5℃條件下含量最高，并且L-4胞內(nèi)的可溶性糖含量要略高于L-1。

3 討論

脯氨酸的積累是植物體抵抗?jié)B透脅迫的一種有效方式，其可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢(shì)，穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)維持細(xì)胞正常的生理功能［5，7，8］。

本研究的結(jié)果表明，在塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1中，隨著培養(yǎng)溫度的降低，其胞內(nèi)脯氨酸的含量成倍增加。溫度在-5℃，培養(yǎng)48 h后，胞內(nèi)的脯氨酸含量由0.48 mg/g增加到了3.24 mg/g，含量是初始值的6.5倍；0℃溫度組別的L-1在48 h后胞內(nèi)的脯氨酸含量也增到初始值的4.8倍，5℃由于在其可正常生長(zhǎng)的溫度內(nèi)（2-6℃）［11］，因此脯氨酸含量增加較小。這說(shuō)明在低溫（-5℃-0℃）環(huán)境脅迫下，L-1胞內(nèi)通過(guò)富集脯氨酸來(lái)維持細(xì)胞在低溫下的正常生理功能。

溫度對(duì)衣藻Chlamydomonas sp. L-4胞內(nèi)的脯氨酸含量的影響不同于L-1。-5℃條件下，L-4胞內(nèi)的脯氨酸含量沒(méi)有明顯變化，而溫度為0℃和5℃時(shí)，脯氨酸含量隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。這說(shuō)明-5℃的低溫條件下，L-4細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸含量需要維持在一個(gè)較高的水平；而在0℃和5℃時(shí)，脯氨酸的含量適當(dāng)減少即可維持其胞內(nèi)正常的生理活動(dòng)。

Chlamydomonas sp. L-4胞內(nèi)的脯氨酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Pyramidomonas sp. L-1，約為后者的40倍。L-1的脯氨酸對(duì)溫度變化敏感，低溫會(huì)導(dǎo)致其含量成倍增加，而L-4在低溫下可以維持胞內(nèi)較高的脯氨酸含量。這說(shuō)明脯氨酸在南極冰藻的低溫適應(yīng)性機(jī)制中起到了重要的作用，對(duì)于不同的藻種，其發(fā)揮作用的方式不同；L-1和L-4在各自的低溫適應(yīng)過(guò)程中的脯氨酸調(diào)節(jié)機(jī)制和方式是不同的。另一方面，L-1可能對(duì)低溫的反應(yīng)更加敏感；而L-4在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，相對(duì)于L-1更適應(yīng)極地的低溫環(huán)境，因此在胞內(nèi)已合成較高含量的脯氨酸，這種高含量的脯氨酸足以抵御不良環(huán)境對(duì)其造成的傷害，從而維持其正常的細(xì)胞生長(zhǎng)。

根據(jù)脯氨酸在高等植物抗逆過(guò)程中的作用機(jī)制［6-8］，分析脯氨酸在南極冰藻低溫環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中的作用可能有以下幾方面：（1）作為滲透保護(hù)物質(zhì)，調(diào)節(jié)胞內(nèi)外的滲透壓平衡。在海冰的凍融過(guò)程中，生存在其中的南極冰藻不僅受低溫的影響，還需要經(jīng)受由于鹽度的急劇變化而導(dǎo)致的滲透壓的巨大變化，脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)劑能夠迅速維持南極冰藻細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡。（2）保護(hù)和穩(wěn)定蛋白。脯氨酸具有很高的水溶性，其分子結(jié)構(gòu)既具有親水部分，又具有疏水部分，可以同蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)合，又不影響蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水作用，使蛋白質(zhì)不變性，在低溫下保持蛋白質(zhì)的生物活性。（3）脯氨酸可與細(xì)胞內(nèi)的一些化合物形成聚合物，降低細(xì)胞質(zhì)的冰點(diǎn)。（4）清除羥基自由基。脯氨酸能夠清除低溫下產(chǎn)生的活性氧，保護(hù)細(xì)胞膜免受破壞。

高等植物細(xì)胞在低溫下會(huì)大量的積累可溶性糖以提高其抗寒性［8］，袁淑珍等［17］對(duì)低溫脅迫下螺旋藻細(xì)胞內(nèi)可溶性糖的研究也已證明在藻類(lèi)植物細(xì)胞中其作用機(jī)制同樣如此。本研究的結(jié)果表明，在低溫脅迫下，兩株冰藻細(xì)胞內(nèi)的可溶性糖含量均有明顯的增加，-5℃，48 h后，增加量均在60%以上，衣藻L-4胞內(nèi)的可溶性糖含量增幅達(dá)90%。這說(shuō)明兩株綠藻均對(duì)低溫環(huán)境脅迫做出了應(yīng)答響應(yīng)和適應(yīng)性變化。而在0℃與5℃的溫度下處理后，胞內(nèi)可溶性糖的增幅并不明顯。這說(shuō)明，在L-1和L-4可正常生長(zhǎng)的溫度范圍內(nèi)，可溶性糖的含量增加并不明顯，因?yàn)檫@些低溫藻類(lèi)已經(jīng)適應(yīng)了極地的環(huán)境溫度，當(dāng)周?chē)h(huán)境溫度繼續(xù)降低至冰點(diǎn)以下時(shí)，其低溫適應(yīng)性機(jī)制中可溶性糖的變化機(jī)制才會(huì)開(kāi)始發(fā)揮作用。

極地冰藻的低溫適應(yīng)性機(jī)制是其胞內(nèi)各種生化組分共同作用的結(jié)果。以往的研究中，重點(diǎn)關(guān)注了細(xì)胞膜的流動(dòng)性機(jī)制、抗凍蛋白及冰活性物質(zhì)、低溫酶的作用機(jī)制、細(xì)胞膜不飽和脂肪酸的變化機(jī)制等在冰藻低溫適應(yīng)過(guò)程中的作用，而關(guān)于脯氨酸和可溶性糖的研究則相對(duì)較少。本研究通過(guò)對(duì)兩株冰藻在低溫脅迫下脯氨酸和可溶性糖的變化過(guò)程的研究和分析，闡述了這二者在冰藻低溫脅迫適應(yīng)過(guò)程中的作用，為深入了解和分析極地冰藻的低溫適應(yīng)性機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

低溫脅迫下通過(guò)對(duì)兩種南極冰藻胞內(nèi)脯氨酸和可溶性糖含量變化的分析，獲得了其在低溫適應(yīng)性過(guò)程中的變化趨勢(shì)，對(duì)于不同的藻種，兩種物質(zhì)發(fā)揮作用的方式不同。

低溫下塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1胞內(nèi)的脯氨酸和可溶性糖含量均發(fā)生了明顯變化，溫度越低，脯氨酸和可溶性糖含量增加越明顯，溫度越高，增加的幅度越小。-5℃處理48 h后，脯氨酸含量增加到初始值的6.5倍；可溶性糖增加了約60%的含量。

衣藻Chlamydomonas sp. L-4胞內(nèi)脯氨酸的含量變化隨著溫度作用時(shí)間的增加出現(xiàn)減少的趨勢(shì)，溫度越低，胞內(nèi)脯氨酸的含量越高。-5℃處理48 h后，胞內(nèi)的脯氨酸含量基本維持在了初始的含量，0℃降低最大達(dá)到了20%?？扇苄蕴请S溫度的變化趨勢(shì)為溫度降低含量增加；-5℃處理48 h后，L-4胞內(nèi)可溶性糖增加了90%的含量。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Roles of Proline and Soluble Sugar in the Cold-adaptation of Antarctic Ice Microalgae

WANG Yi-bin MIAO Jin-lai JIANG Ying-hui LIU Fang-ming ZHENG Zhou LI Guang-you
（1. First Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Qingdao 266061；2. Key Laboratory of Marine Bioactive Substances，State Ocean Administration，Qingdao 266061）

The content changes of proline and soluble sugar in two Antarctic ice microalgae under low temperature stress were measured and analyzed for understanding their cold-adaptation mechanisms. Measuring the proline and soluble sugar in two microalgae at different low temperatures and culturing time， the changing trend of them with the temperature and stress time at low temperature was obtained， and the reasons of it was analyzed. The lower the temperature was， the more significantly the contents of proline and soluble sugar in Pyramidomonas sp. L-1 increased. The amount of proline was 6.5 times of initial one and the soluble sugar increased 60% after 48 h at -5℃. The content of proline in Chlamydomonas sp. L-4 was in the same way as Pyramidomonas sp. L-1， i.e.， the lower the temperature was， the higher the content of proline was. However， the changing trend of the content with the time was in contrast， decreasing with the culturing time. The proline was almost unchanged after 48 hours at -5℃， while soluble sugar increased 1.9 times. In conclusion， proline and soluble sugar play an important role in the cold-adaptation mechanism of Antarctic ice microalgae， however， the action mechanism is different in the different algae species.

Antarctic ice microalgae；cold-adaptability；proline；soluble sugar

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.024

2015-05-05

國(guó)家海洋局第一海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（2015G10，2013G33），國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31200097，31200272），海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（201305027，201405015）

王以斌，男，助理研究員，研究方向：極地海洋生物學(xué)；E-mail：wangyibin@fio.org.cn

繆錦來(lái)，男，研究員，研究方向：極地海洋生物學(xué)；E-mail：miaojinlai@fio.org.cn