馮登超，高東東，楊喜明

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·論著·

燒傷患者體內磷酸化胰島素樣生長因子結合蛋白1水平變化的研究

馮登超，高東東，楊喜明

目的探討燒傷患者體內磷酸化胰島素樣生長因子結合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein-1，IGFBP-1)含量水平變化。方法選取2012年12月～2014年12月收治的86例燒傷患者為研究對象，收集燒傷患者自入院治療至術后治療10d的血漿，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血漿中胰島素、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和IGFBP-1含量，磷酸化IGFBP-1用Western Blotting檢測。結果燒傷患者血漿IGFBP-1含量與總體表面積(TBSA)燒傷指數呈正相關，IGF-1含量隨著TBSA值升高而顯著下降(P<0.05)。在患者燒傷后72h內，IGF-1含量降低，而IGFBP-1含量[(184±26)ng/mL]升高，相比正常健康組IGFBP-1含量[(16±4)ng/mL]結果有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同時血漿中可檢測到磷酸化的IGFBP-1。結論燒傷患者血漿IGFBP-1含量變化和IGFBP-1持續(xù)的磷酸化與燒傷嚴重程度相關，IGFBP-1持續(xù)的磷酸化可抑制IGF的生物活性，并可作為判斷燒傷患者預后的預警指標。

燒傷； 胰島素； 磷酸化胰島素樣生長因子； 預后

嚴重燒傷患者死亡的最主要原因是膿毒癥和免疫功能失調導致的繼發(fā)性多器官功能衰竭[1]。該疾病來勢兇猛，病情進展快，病死率高，如何及時診斷及有效預防是提高燒傷救治成功率的關鍵。胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)是一類結構上與胰島素部分同源并具有胰島素活性的生物多肽，具有免疫調節(jié)作用，可作為潛在的調控因子對T淋巴細胞的活性和功能進行調節(jié)[2]。胰島素樣生長因子結合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein-1，IGFBP-1)由肝臟、子宮和腎臟等組織器官分泌，對分泌細胞本身、鄰近的組織細胞以及遠端的靶器官均能產生作用，是游離IGF-1生物活性的主要調節(jié)因子[2-3]。IGFBP-1的絲氨酸磷酸化能夠增加其與IGF-1的親和力，從而阻斷IGF-1與其受體的結合，降低IGF-1的生物學活性[4]。研究表明，血清中持續(xù)高水平的IGFBP-1膿毒癥及危重癥患者預后非常差[5]。而燒傷患者受到應激的影響，血漿內IGF-1水平降低， IGFBP-1水平則顯著升高[6]。但磷酸化IGFBP-1水平變化與燒傷患者總體表面積(total body surface area，TBSA)之間的關系尚未見報道,本研究探討燒傷患者體內IGF-1、IGFBP-1和磷酸化IGFBP-1水平變化與患者TBSA之間的關系，以期為臨床判斷燒傷患者病情程度的發(fā)展及預后提供參考。

資料與方法

1資料來源

選取2012年12月～2014年12月收治的不同燒傷面積和深度患者86例，其中男性60例，女性26例；年齡18～72歲,平均(39.2±21.2)歲。按照燒傷面積將患者劃分為4個等級，見表1。其中發(fā)生多器官功能不全(MODS)42例。同期隨機選擇50例在本院體檢的健康人員為對照組，其中男性34例，女性16例；年齡18～67歲，平均(38.9±19.9)歲。兩組患者基線資料比較無顯著性差異。所有患者在納入研究時均告知其本研究的目的和方法，并簽署知情同意書；本研究獲得醫(yī)學倫理委員會批準。

表1　納入患者的基本資料(按燒傷面積分組)

2觀察指標

采集患者燒傷后24h～10d無菌靜脈血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝真空采血管中，所有標本于采集后2h內2 000g/min離心10min，小心轉移上層血漿至離心管中分裝后于-80℃冰箱中保存。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)技術測定不同傷情燒傷患者血漿中胰島素、IGF-1和IGFBP-1濃度，試劑盒均購自美國Webster公司。Western Blotting檢測燒傷患者血漿中磷酸化的IGFBP-1，檢測前不用小牛腸道磷酸酶處理，配制pH<8.3的分離凝膠，將樣品經非變性聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉膜，洗膜、封閉，然后孵育檢測抗體，另一份血漿樣品在用50U小牛腸道磷酸酶處理后作為對照驗證IGFBP-1的磷酸化。為避免批間差異，標本測定一次完成，并對IGF-1、IGFBP-1以及TBSA進行相關分析。本研究持續(xù)時間終點為燒傷患者入院24h～10d或患者死亡。

3統(tǒng)計學分析

結　果

1燒傷患者血漿胰島素、IGF-1、IGFBP-1以及TBSA相關性分析

燒傷患者血漿內胰島素含量與TBSA沒有相關性(圖1a),IGFBP-1水平隨燒傷TBSA值升高而升高(P<0.0001)，IGFBP-1水平與燒傷患者TBSA值顯著正相關，見圖1b。燒傷患者血漿IGF-1水平隨燒傷TBSA值升高顯著降低(P=0.0083)，IGF-1水平與燒傷患者TBSA值顯著負相關，見圖1c。這表明燒傷能引起患者早期IGF-1水平的降低，并且和患者TBSA有關。

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圖1燒傷患者血漿胰島素、IGF-1、IGFBP-1以及TBSA相關性分析。a.燒傷患者血漿內胰島素含量與燒傷面積相關性分析;b．IGFBP-1水平與燒傷患者TBSA值相關性分析;c．IGF-1水平與燒傷患者TBSA值相關性分析

2燒傷患者血漿IGF-1和IGFBP-1水平變化縱向追蹤分析

燒傷患者血漿IGF-1和IGFBP-1水平變化縱向追蹤分析結果見圖2。結果顯示，在10d的采樣期內，只有TBSA 31%～50%(圖2c)和TBSA 51%～95%(圖2d)的燒傷患者血漿中IGF-1值顯著低于正常組(172±58)ng/mL， TBSA 1%～15%燒傷患者在采樣期內與正常組相比無顯著性差異(圖2a)。而TBSA 16%～30%燒傷患者只有在第1天表現出低于正常組。然而對比正常組IGFBP-1(16±4)ng/mL，IGFBP-1在研究期內都表現出顯著升高(見圖2b)，唯一例外的是TBSA 1%～15%燒傷患者只在燒傷入院后3d才表現出顯著增高(見圖2a)。TBSA 51%～95%的燒傷患者中有最高的IGFBP-1值(圖2d)。這些結果說明患者燒傷后，體內IGF-1水平顯著降低，IGFBP-1水平顯著升高。

圖2燒傷患者血漿IGF-1和IGFBP-1水平變化縱向追蹤分析(01=第1天，02=第2天,03=第3天，以此類推)：a.IGF-1和IGFBP-1水平在TBSA 1%～15%患者縱向追蹤分析；b.IGF-1和IGFBP-1水平在TBSA 16%～30%患者縱向追蹤分析；c.IGF-1和IGFBP-1水平在TBSA 31%～50%患者縱向追蹤分析；d.IGF-1和IGFBP-1水平在TBSA 51%～95%患者縱向追蹤分析(采用雙因素的方差分析進行統(tǒng)計學處理:*P<0.05，**P<0.005)

3IGFBP-1在患者燒傷后表現出持續(xù)磷酸化

筆者測出不僅IGF-1和IGFBP-1的水平在患者燒傷后發(fā)生了變化，磷酸化IGFBP-1也發(fā)生了變化。通過免疫印跡檢測IGFBP-1磷酸化表達，結果顯示，燒傷患者體內IGFBP-1的確發(fā)生了磷酸化修飾，并且IGFBP-1磷酸化表達量隨著TBSA的增高而上升。這一結果與ELISA檢測結果得到的趨勢相似。為了驗證IGFBP-1的確發(fā)生了磷酸化，筆者將血漿樣品與小牛腸道堿性磷酸酶(calf intestinal phosphatase，CIP)共孵育處理，結果顯示檢測不到磷酸化的IGFBP-1(圖3)，說明燒傷患者血漿內IGFBP-1磷酸化增高，并且在縱向觀察期限內，始終可觀察到IGFBP-1的磷酸化表達。

圖3　IGFBP-1在患者燒傷后表現出持續(xù)磷酸化

討　論

本次研究中，筆者探討了燒傷與IGF-1/IGFBP-1軸功能的關系。在這項回顧性實驗研究中，筆者收集了年齡在18～72歲燒傷患者的基本資料，并對患者血漿中IGF-1、IGFBP-1進行監(jiān)測測定，發(fā)現燒傷患者TBSA與血漿中IGF-1、IGFBP-1水平相關。隨著燒傷TBSA值的增高，患者血漿中IGF-1與IGFBP-1水平分別降低和增高，并且在燒傷患者入院治療24h～10d內均能觀察到類似變化。筆者推測患者燒傷TBSA可能和IGF-1/IGFBP-1軸功能有關[7]。有報道[8]表明，IGFBP-1的活性在燒傷患者發(fā)生改變，筆者也發(fā)現燒傷患者IGFBP-1的磷酸化顯著升高，而磷酸化的IGFBP-1能夠結合游離IGF-1，從而抑制IGF-1的生物活性[9]。這些變化表明，IGFBP-1的磷酸化變化與IGF-1含量降低同時發(fā)生，從而導致IGF-1的保護作用降低。IGF-1具有保護機體作用，其含量的增高有助于保護機體避免發(fā)生膿毒癥，從而提高生存率[8]。

燒傷患者處于一種高代謝狀態(tài)，機體大量消耗血中葡萄糖，加速蛋白質分解及脂肪的糖異生從而增加血中氨基酸和脂肪酸濃度[1]，此時機體會出現嚴重的代謝紊亂，導致免疫功能下降從而繼發(fā)MODS。IGF-1/IGFBP-1軸功能在燒傷患者免疫細胞的激活及功能調節(jié)中發(fā)揮著保護作用[7-8]。目前認為，燒傷作為一種強烈的應激原，會引起一系列以神經內分泌反應為主的全身非特異性反應[2]。應用血清生長激素(recombinant human growth hormone，rhGH)和IGF-1水平治療可以提高rhGH和IGF-1水平，但僅用IGF-1治療并不能有效防止免疫細胞的凋亡[3]。IGFBP-1是人體內重要的內分泌激素之一，對解釋許多生理、病理現象及治療方面有著重要意義[5]。IGFBP-1是一種具有重要生物學意義的多功能蛋白，許多證據表明IGFBP-1在調節(jié)糖代方面扮演著重要角色，它可以通過調節(jié)IGF-1與受體間的相互作用使血糖升高，也可以直接對血糖代謝產生調節(jié)作用[10]。在本項研究中，患者在燒傷后IGFBP-1的磷酸化形式表達增高，而磷酸化的IGFBP-1對IGF-1的親和力會增強4～6倍[11]。同時，IGFBP-1磷酸化還導致IGFBP-1與細胞表面結合的能力大大下降[11]。而磷酸化的IGFBP-1會抑制IGF-1活性，非磷酸化的IGFBP-1則表現出增強IGF-1活性[12]。患者燒傷后IGFBP-1磷酸化形式的迅速表達，提示IGFBP-1的磷酸化也許是了解燒傷患者體內IGF-1/IGFBP-1軸功能的重要線索。盡管如此，目前對于這一過程中是否有其他特殊的配體參與仍需要后續(xù)進行鑒定?；谀壳暗难芯拷Y果，筆者推測磷酸化的IGFBP-1也可能定位細胞表面或細胞外基質對IGF-1進行轉運，如果磷酸化的IGFBP-1與IGFBP-3競爭性結合IGF-1，這也許能為燒傷患者IGF-1的免疫治療提供新思路。此外，發(fā)現能控制IGFBP-1磷酸化的激酶也是亟待解決的工作之一。所有這些都為針對IGFBP-1磷酸化的治療提供了新的理論依據。

綜上所述，本組研究結果表明，燒傷患者血漿IGFBP-1與TBSA指數呈正相關，IGF-1與TBSA呈負相關，并且伴隨有IGFBP-1的磷酸化表達，這3個指標之間的關系可以作為預警指標從而為大面積燒傷患者的病情評估及診治提供一定依據。但本研究仍存在一定的局限性，如涉及到IGF-1/IGFBP-1軸功能中其他可能參與的生物活性因子仍不清楚[7]。另外，盡管筆者觀察到TBSA與IGF-1/IGFBP-1具有相關關系，但仍不清楚是否由其他因素如年齡、燒傷深度或致病因子導致。筆者也認識到，燒傷患者的激素水平在24h內可能波動較大[13]，為了避免因取樣時間帶來的誤差變化，在每次收集血漿時都盡量同時進行。由于數據的特殊性，患者術后的治愈率以及死亡率在本研究中并未涉及。

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(本文編輯： 郭衛(wèi))

Changes of insulin-like growth factor binding protein 1(IGFBP-1)in patients with burn injury

FENG Deng-chao,GAO Dong-dong，YANG Xi-ming

(Department of Burns and Plastic Hand Surgery,Affiliated Hospital of Yan’an University,Yan’an716000,China)

ObjectiveTo investigate the changes of insulin-like growth factor binding protein 1(IGFBP-1) in patients with burn injury. MethodsEighty-six adult patients with burn injury who were admitted in our hospital from Dec.2012 to Dec.2014 were selected as study subjects. Plasma was collected from the date of admission to 10 days after admission. The plasma levels of insulin,insulin-like growth factor-1(IGF-1) and IGFBP-1 were measured by ELISA. Phosphorylated IGFBP-1 was detected by Western Blotting. ResultsThe plasma level of IGFBP-1 was positively correlated with the total body surface area(TBSA). The plasma level of IGF-1 was decreased significantly with the increased degree of TBSA in burn patients. The plasma level of IGF-1 decreased within 72 h after burn injury. However,the mean IGFBP-1 level [(184±26)ng/mL] was significantly higher than that of normal health subjects [(16±4)ng/mL，P<0.05]. The phosphorylated IGFBP-1 could be detected in plasma in patients with burn injury. ConclusionThe changes of IGFBP-1 and persistent phosphorylation of IGFBP-1 in plasma of patients with burn injury are positively correlated with the severity of burn injury. The sustained phosphorylation of IGFBP-1 can inhibit the biological activity of IGF,and can be accepted as a predictor in predicting the prognosis of burn injury.

burns; insulin; phosphorylated insulin-like growth factor; prognosis

1009-4237(2016)09-0545-04

陜西省自然科學基金研究計劃資助項目(2014JM4199)

716000 陜西，延安大學附屬醫(yī)院燒傷整形手外科

楊喜明，E-mail:xueningjiangya@126.com

R 644

A

10.3969/j.issn.1009-4237.2016.09.010

2015-10-14；

2016-01-08)