王潔 余磊 楊東 李婕 王洪鐘

（清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084）

基于酵母表面展示技術(shù)的胸苷磷酸化酶全細(xì)胞催化劑的構(gòu)建

王潔 余磊 楊東 李婕 王洪鐘

（清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084）

胸苷磷酸化酶（TP）在核苷類代謝通路中發(fā)揮重要作用，可催化生成多種核苷類似物。構(gòu)建了TP的酵母表面展示系統(tǒng)作為全細(xì)胞催化劑。從大腸桿菌K12菌株中克隆編碼TP的deoA基因，利用酵母表達(dá)質(zhì)粒pKFS構(gòu)建重組質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株。高拷貝陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)96 h后，免疫熒光結(jié)果顯示TP在酵母細(xì)胞表面成功展示。利用β-胸苷為底物，重組酵母細(xì)胞作為全細(xì)胞催化劑，經(jīng)HPLC檢測(cè)，結(jié)果表明展示在酵母表面的TP有催化活性，可以催化β-胸苷生成產(chǎn)物胸腺嘧啶。

胸苷磷酸化酶；全細(xì)胞催化；畢赤酵母；表面展示

近50年來(lái)，核苷類似物被廣泛用于治療病毒感染及腫瘤類疾病，其中已有超過(guò)9種抗代謝核苷類抗腫瘤藥物和25種核苷類抗病毒藥物經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市［1］。核苷類似物是由人工改造天然核苷的糖基或堿基而合成的核苷類衍生物，由于和天然核苷結(jié)構(gòu)相似，在生物體內(nèi)會(huì)和天然核苷競(jìng)爭(zhēng)，通過(guò)抑制相關(guān)聚合酶與核酸結(jié)合等方式干擾核酸的復(fù)制合成［2］，達(dá)到治療腫瘤類疾病或抑制病毒增殖的目的。

目前核苷類似物的工業(yè)合成方法主要是傳統(tǒng)的化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)合成反應(yīng)步驟多，反應(yīng)條件苛刻，產(chǎn)物純度低［3］；而生物轉(zhuǎn)化法條件溫和，成本低，應(yīng)用較廣泛。早期的生物轉(zhuǎn)化法只能用來(lái)生產(chǎn)少數(shù)天然核苷；近年采用較多的生物轉(zhuǎn)化法是酶法合成，通過(guò)將參與核苷代謝通路的酶重組轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過(guò)酶的純化固定等方式來(lái)催化核苷類似物的合成［4］。本課題首次采用了一種新型生物轉(zhuǎn)化方法，即開(kāi)發(fā)于20世紀(jì)90年代的酵母表面展示法［5］，來(lái)研究核苷類似物的生物酶催化。酵母表面展示法無(wú)需酶的純化固定，便于遺傳改造。它通過(guò)表達(dá)不同的錨定蛋白，可以將多種外源蛋白定位在酵母細(xì)胞壁上，利用全細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行生物催化過(guò)程，有可以反復(fù)多次利用、成本低的優(yōu)點(diǎn)，已有報(bào)道成功利用酵母表面展示技術(shù)來(lái)展示a-半乳糖苷酶［5］、糖基轉(zhuǎn)移酶［6］和脂肪酶［7］等酶，該方法也被廣泛應(yīng)用于生物催化劑、活疫苗、蛋白質(zhì)文庫(kù)篩選和癌癥診斷等領(lǐng)域。

核苷類似物的生物催化法常用的酶包括N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶和核苷磷酸化酶。核苷磷酸化酶包括胸苷磷酸化酶（TP）、尿苷磷酸化酶（UP）和嘌呤核苷磷酸化酶（PNP），通過(guò)兩步反應(yīng)可逆地催化核苷（或脫氧核苷）生成核糖-1-磷酸和堿基。本實(shí)驗(yàn)所研究的TP（EC 2.4.2.4）最先由Schwartz于1978年在E. coli K12中克隆純化［8］。哺乳動(dòng)物來(lái)源的TP同時(shí)可作為血管生成因子，在腫瘤組織中有過(guò)表達(dá)現(xiàn)象［9］。本研究旨在通過(guò)構(gòu)建TP的畢赤酵母表面展示系統(tǒng)，并作為全細(xì)胞催化劑，催化β-胸苷轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶的反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

pKFS質(zhì)粒和畢赤酵母GS115菌株由華南理工大學(xué)的林影教授贈(zèng)送，E. coli K12菌株由本實(shí)驗(yàn)保存，E. coli DH5α和pMD19-T質(zhì)粒購(gòu)自TaKaRa公司。

限制性內(nèi)切酶、T4連接酶和4×蛋白質(zhì)SDS PAGE上樣緩沖液（40 mmol/L Tris-HCl pH8.0，200 mmol/L DTT，4% SDS，40% Glycerol，0.032% Bromophenol Blue）均購(gòu)自TaKaRa公司，PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和DNA trans2K Plus Marker購(gòu)自TransGen公司，酵母基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)，鼠源抗flag單抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗和Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購(gòu)自中杉金橋公司，胸腺嘧啶、β-胸苷（HPLC級(jí)）購(gòu)自大連美侖公司，基因測(cè)序和引物合成由睿博興科公司完成。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。pKFS質(zhì)粒由林影教授改造pPIC9K質(zhì)粒得到，pKFS帶有絮凝素Flo1蛋白的N端絮凝功能結(jié)構(gòu)域（874aa，F(xiàn)lo1p short chain，縮寫(xiě)為FS）錨定系統(tǒng)［10］。為構(gòu)建靈活度更高的FS-TP融合蛋白，本研究設(shè)計(jì)了一段（G4S）3蛋白linker［7，11］，加到正向克隆引物deoA-pKFS-F上，隨后是deoA基因的5'端序列，為保證融合蛋白的完整表達(dá)，序列的起始密碼子被移除。為便于檢測(cè)外源蛋白，在deoA基因下游加入了編碼flag標(biāo)簽（氨基酸序列為DYKDDDDK）的核苷酸序列，在設(shè)計(jì)下游引物時(shí)去掉了deoA基因的3'端序列的終止密碼子。

deoA基因PCR產(chǎn)物連到pMD19-T質(zhì)粒上進(jìn)行測(cè)序。利用Mlu I和Not I內(nèi)切酶雙酶切pMD19-T-deoA和pKFS質(zhì)粒，將deoA基因插入Flo1基因的下游，所得重組質(zhì)粒為pKFS-LA，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coli DH5α中，在氨芐抗性的LB板上涂布培養(yǎng)，利用deoA-pKFS-F1、deoA-pKFS-R1引物進(jìn)行菌落PCR來(lái)篩選陽(yáng)性克隆。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GS115和重組轉(zhuǎn)化子的篩選 制備GS115酵母細(xì)胞的感受態(tài)，重組質(zhì)粒經(jīng)Sal I線性化后，利用電擊儀（Bio-Rad）進(jìn)行電擊，轉(zhuǎn)化到GS115酵母細(xì)胞。電轉(zhuǎn)參數(shù)為1.5 kV，2 ms。轉(zhuǎn)化子涂布到MD板培養(yǎng)6-7 d后，用MD液體培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)皿，洗脫下來(lái)的酵母懸液分別涂布到含1 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL G418抗生素的MD平板上，培養(yǎng)5-6 d。挑取不同MD板的陽(yáng)性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組，進(jìn)行基因組PCR鑒定。

1.2.3 胸苷磷酸化酶的誘導(dǎo)表達(dá)及免疫熒光檢測(cè) 采用兩步法誘導(dǎo)GS115表達(dá)外源蛋白。GS115野生菌株和經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的酵母轉(zhuǎn)化子GS115-LA接種到BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD為2-6，離心后分別用BMMY培養(yǎng)基重懸至OD為1左右，取2 mL細(xì)胞作為誘導(dǎo)0點(diǎn)4℃保存，之后加入1%的甲醇于20℃、200 r/min進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)7 d，每隔24 h取樣。

取培養(yǎng)96 h的1 mL GS115、GS115-LA細(xì)胞離心后，用1×PBS（pH7.0）洗3次，然后用含1 mg/mL BSA、2 mL鼠源抗flag單抗的1×PBS在室溫下低速振蕩孵育2 h，孵育結(jié)束后用1×PBS洗3次，用含1 mg/mL BSA、1 mL Alexa-Fluor 488標(biāo)記的羊抗鼠二抗的1×PBS在黑暗環(huán)境下振蕩孵育1 h。1×PBS洗滌3次后，用GE的DeltaVision高分辨率成像系統(tǒng)分別檢測(cè)GS115和GS115-LA細(xì)胞的熒光。

1.2.4 Western blot檢測(cè)胸苷磷酸化酶的誘導(dǎo)表達(dá) 準(zhǔn)備1 mL樣品，用破壁緩沖液室溫處理30min，離心后加入20 mL 4×蛋白SDS-PAGE上樣buffer和60 mL去離子水重懸，煮沸10 min后離心，取20 mL上清上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，用Bio-Rad轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，PVDF膜用5%奶粉的TBST封閉2 h，隨后加入1 mL單抗（1∶500）室溫孵育2 h，TBST洗3次；膜放入5 mL封閉液，加入1 mL HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫振蕩孵育1 h，結(jié)束后用TBST洗滌3次。用增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒（TIANGEN）對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色。

1.2.5 HPLC檢測(cè)胸苷磷酸化酶的催化活性 配制不同濃度β-胸苷和胸腺嘧啶的標(biāo)準(zhǔn)品，分別制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，以0.5 mL誘導(dǎo)96 h的GS115-LA細(xì)胞作為全細(xì)胞催化劑，GS115細(xì)胞作為對(duì)照，用50 mmol/L PBS（pH7.5）緩沖液配制含30 mmol/L胸苷的10mL反應(yīng)體系，50℃振蕩2 h，進(jìn)行催化反應(yīng)。反應(yīng)樣品20倍稀釋后用Waters 600E高效液相色譜儀檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果。檢測(cè)條件為：紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫25℃，色譜柱 PLATISILTM ODS C18（5 mm，250×0.46 mm），流動(dòng)相乙腈∶水=10∶90，進(jìn)樣量10 mL，流速1 mL/min。

2 結(jié)果

2.1 deoA基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選

編碼TP的deoA 基因（EU275208.1）開(kāi)放閱讀框?yàn)? 323 bp，編碼439個(gè)氨基酸，微生物來(lái)源的TP大小約47 kD。本實(shí)驗(yàn)利用了touch down PCR技術(shù)，設(shè)置退火溫度由70℃梯度降落至60℃，將linker和flag序列分別加到deoA基因的上下游。

圖1-A顯示了約1 392 bp的降落PCR產(chǎn)物條帶，測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組質(zhì)粒上E. coli K12來(lái)源的deoA基因序列和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已有序列一致，deoA基因上下游分別有l(wèi)inker和flag的核苷酸序列。

圖1-B為不同濃度G418-MD板上的酵母轉(zhuǎn)化子基因組以deoA-pKFS-F1、deoA-pKFS-R1為引物的PCR結(jié)果。為降低假陽(yáng)性的影響，根據(jù)FS部分片段設(shè)計(jì)了FS-F、FS-R引物。以圖1-B中的陽(yáng)性克隆對(duì)應(yīng)的基因組為模板，用pPIC9K通用引物5' AOX1、3'AOX1引物和FS-F、FS-R引物分別進(jìn)行PCR，鑒定結(jié)果如圖1-C、D。FS片段對(duì)應(yīng)的基因序列為2 622 bp，F(xiàn)S-deoA基因序列約4 024 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，未出現(xiàn)移碼突變。根據(jù)PCR結(jié)果，選出了拷貝數(shù)較高的5 mg/mL G418-MD板上的酵母轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的實(shí)驗(yàn)。

2.2 免疫熒光檢測(cè)酵母

取誘導(dǎo)96 h的酵母轉(zhuǎn)化子和野生酵母做免疫熒光檢測(cè)（FITC，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm），圖2-A顯示酵母轉(zhuǎn)化子在AlexaFluor 488熒光下被標(biāo)記為綠色，部分野生酵母細(xì)胞有微弱的自熒光。結(jié)果表明Flo1蛋白N端亞基可以作為表面展示的錨定蛋白，帶有flag標(biāo)簽的TP被成功錨定在細(xì)胞壁上，呈不均勻的分布狀態(tài)。

2.3 Western blot檢測(cè)融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)的酵母轉(zhuǎn)化子破壁，提取細(xì)胞壁蛋白做Western blot。Western blot結(jié)果（圖3）證實(shí)畢赤酵母在甲醇誘導(dǎo)的第3、4天是外源蛋白表達(dá)關(guān)鍵期，表達(dá)量相對(duì)較高。

圖1 deoA序列的PCR擴(kuò)增和陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子鑒定

圖2 酵母的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

E. coli來(lái)源的TP為47 kD，F(xiàn)S-TP融合蛋白共有1 338 aa，理論分子量大小約為141 kD，而圖3所檢測(cè)到的蛋白條帶約70 kD，與理論預(yù)測(cè)不太相符。這種情況在其它文獻(xiàn)中也有報(bào)道［12，13］，酵母細(xì)胞在翻譯表達(dá)外源蛋白時(shí)，若出現(xiàn)連續(xù)兩個(gè)或兩個(gè)以上的堿性氨基酸相鄰的結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)很容易被一些酵母本身表達(dá)的蛋白酶如Kex2切斷，導(dǎo)致外源蛋白不完整。經(jīng)過(guò)序列分析，融合蛋白存在一處“RKKR”結(jié)構(gòu)，若經(jīng)Kex2蛋白酶切割會(huì)得到大小為65 kD左右的融合蛋白，經(jīng)過(guò)酵母的翻譯后修飾如糖基化等過(guò)程，可能導(dǎo)致表觀分子量呈現(xiàn)為70 kD左右；另一方面，畢赤酵母表達(dá)分泌蛋白的機(jī)制比較復(fù)雜，酵母自身分泌的胞外酶以及細(xì)胞裂解后釋放的胞內(nèi)酶，或破壁過(guò)程中的一些處理如超聲等也許會(huì)導(dǎo)致外源蛋白降解。融合蛋白表觀分子量變低的原因還需要進(jìn)一步研究。

2.4 TP的催化活性檢測(cè)

圖4為反應(yīng)體系稀釋20倍后的HPLC檢測(cè)結(jié)果，出現(xiàn)了產(chǎn)物胸腺嘧啶的色譜峰，以GS115原始菌株做對(duì)照的反應(yīng)體系則未檢測(cè)到產(chǎn)物峰的出現(xiàn)。計(jì)算得β-胸苷的轉(zhuǎn)化率為7.5%。胸腺嘧啶和胸苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間分別是7.079 min和9.692 min。分別在波長(zhǎng)為264.1 nm和266.5 nm處有最大吸收峰，圖4中的兩個(gè)峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)分別與胸腺嘧啶和胸苷的標(biāo)準(zhǔn)品相一致，保留時(shí)間分別是7.761 min和10.444 min。

圖3 融合蛋白的表達(dá)分析

圖4 HPLC檢測(cè)圖

3 討論

本研究利用表面展示TP的酵母細(xì)胞作為全細(xì)胞催化劑，分別在30℃、40℃、50℃、60℃的反應(yīng)溫度下，以50 mmol/L pH7.5的磷酸鹽緩沖液配制反應(yīng)體系，以胸苷為底物進(jìn)行催化反應(yīng)，結(jié)果表明50℃是最優(yōu)反應(yīng)溫度，在此溫度下胸苷的轉(zhuǎn)化率最高為7.5%。為探索不同pH值對(duì)反應(yīng)的影響，制備了pH值為6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸鹽緩沖液，在50℃條件下進(jìn)行了催化反應(yīng)，結(jié)果表明pH7.5是最優(yōu)反應(yīng)pH值。但相比于表達(dá)TP的重組E. coli工程菌［14］，畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的催化效率仍相對(duì)較低，文獻(xiàn)利用E. coli BL21菌株共表達(dá)了TP和尿苷磷酸化酶（UP），在50℃時(shí)，將E. coli重組菌株與30 mmol/L尿嘧啶和60 mmol/L β-胸苷混合反應(yīng)1 h，TP和UP共同催化生成了2-脫氧尿苷，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到61.6%。

Flo1蛋白的N端亞基可以非共價(jià)錨定TP的N端，使TP蛋白C端游離。微生物來(lái)源的TP為同源二聚體，每個(gè)亞基有一個(gè)磷酸根結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)脫氧核苷結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)TP被錨定在細(xì)胞壁表面時(shí)，錨定蛋白可能影響到TP的空間構(gòu)象和TP亞基之間的相互作用，繼而阻礙TP對(duì)核苷類底物的催化，導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化率較低。本實(shí)驗(yàn)室正在嘗試?yán)昧硗獾腻^定蛋白和酵母展示系統(tǒng)來(lái)展示TP。

酵母表面展示TP還有待更深入的研究，需要選用更適合的錨定蛋白和展示系統(tǒng)，以進(jìn)一步提高TP的活性和表達(dá)量。此外，利用畢赤酵母密碼子偏好性［15］，對(duì)deoA基因序列進(jìn)行優(yōu)化，并將畢赤酵母表面展示技術(shù)作為篩選手段進(jìn)行定向進(jìn)化［16］，或許可以提高TP在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量，進(jìn)而篩選出催化能力更高的TP和穩(wěn)定性高的展示系統(tǒng)，為開(kāi)發(fā)高穩(wěn)定性、高活性的表面展示TP全細(xì)胞催化劑奠定了基礎(chǔ)。

本研究還嘗試以5-氮雜胞苷為底物，但未能成功催化生成5-氮雜胞嘧啶，說(shuō)明TP有一定的底物選擇特異性，無(wú)法單獨(dú)催化胞嘧啶核苷類衍生物的生成。有文獻(xiàn)報(bào)道TP可以催化嘧啶類脫氧核苷酸或5-位取代的尿嘧啶類化合物，但脫氧胞苷類和6-C被甲基或酮基取代的核苷類化合物除外，另外TP也不能以尿嘧啶和胸腺嘧啶的氮雜類衍生物為底物［17，18］。

在催化合成核苷類衍生物的過(guò)程中，可嘗試?yán)媒湍副砻嬲故鞠到y(tǒng)同時(shí)展示兩種核苷磷酸化酶，進(jìn)行雙酶反應(yīng)［19］，提高全細(xì)胞催化劑對(duì)核苷類化合物的底物適應(yīng)性，來(lái)催化合成更多的非天然核苷類似物。

4 結(jié)論

本研究利用酵母表達(dá)質(zhì)粒pKFS，首次構(gòu)建了胸苷磷酸化酶的畢赤酵母表面展示系統(tǒng)。通過(guò)兩步法的發(fā)酵方法，誘導(dǎo)酵母表達(dá)外源蛋白TP，確定了甲醇誘導(dǎo)的第3、4天是酵母表達(dá)外源蛋白TP的高峰期。并將展示TP的酵母細(xì)胞作為全細(xì)胞催化劑，以胸苷為底物催化合成了胸腺嘧啶。

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（責(zé)任編輯李楠）

Construction of Pichia pastoris Surface Display Technology as Wholecell Biocatalyst for Thymidine Phosphorylase

WANG Jie YU Lei YANG Dong LI Jie WANG Hong-zhong
（School of Life Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084）

Thymidine phosphorylase（TP）extensively involves in nucleoside metabolism and catalyzes the formation of many nucleoside analogs（NA）. A yeast cell surface display system for TP was firstly constructed in this study as whole-cell biocatalyst. A deoA gene encoding TP was cloned from Escherichia coli K12 strain and inserted into the yeast expression vector pKFS. Recombinant vector was linearized and electro-transformed into Pichia pastoris GS115 cells. High copy transformant was induced by methanol for 96 h， and the results of immunofluorescence indicated that TP successfully displayed on the surface of P. pastoris. β-thymidine was used as substrate and recombinant GS115 cells as whole-cell biocatalyst， HPLC analysis demonstrated that TP on the surface of P. pastoris had catalytic activity， and catalyzed the production from β-thymidine to thymine.

thymidine phosphorylase；whole-cell catalysis；Pichia pastoris；surface display

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.032

2015-03-31

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21176138，21476124）

王潔，女，碩士，研究方向：生物轉(zhuǎn)化及生物催化；E-mail：wangjie08beijing@163.com

王洪鐘，男，博士，副教授，研究方向：生物轉(zhuǎn)化及生物催化；E-mail：hzwang@mail.tsinghua.edu.cn