王九娜 向大偉 唐俊杰 李根 趙玲 秦文 趙紅斌

（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，蘭州 730050）

復(fù)合紅景天苷支架材料對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響

王九娜 向大偉 唐俊杰 李根 趙玲 秦文 趙紅斌

（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，蘭州 730050）

探討復(fù)合紅景天苷微球的膠原蛋白材料支架對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響及作用。將紅景天苷制作成微球復(fù)合到膠原蛋白中，掃描電鏡觀(guān)察材料支架的表征，接種大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后掃描電鏡觀(guān)察細(xì)胞與材料的黏附性，CCK-8法測(cè)細(xì)胞在材料上的增殖情況，HE染色檢測(cè)細(xì)胞在材料上的增殖及形態(tài)，S100免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化情況。結(jié)果顯示，細(xì)胞接種到材料上，在材料上黏附并生長(zhǎng)。同種材料，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，材料上的細(xì)胞顯著增殖（P ＜0.05）。神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白S100表達(dá)為陽(yáng)性。復(fù)合紅景天苷微球的膠原蛋白具有良好的生物相容性，紅景天苷微球不影響細(xì)胞在材料上的增殖，且可有效誘導(dǎo)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化。

紅景天苷；膠原蛋白；材料支架；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，天然高分子生物材料及人工合成高分子材料日益受到人們的重視。膠原蛋白作為一種天然高分子生物材料，已被證實(shí)可以用作組織工程支架。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，是構(gòu)成動(dòng)物機(jī)體的重要功能物質(zhì)。膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量最高的結(jié)構(gòu)蛋白，占動(dòng)物體內(nèi)總蛋白量的25%-33%［1］，其中以結(jié)締組織最多，富含脯氨酸、甘氨酸和羥脯氨酸，能與各種細(xì)胞結(jié)合并構(gòu)成性能各異的組織，可形成細(xì)胞外支架，維持組織和器官形態(tài)的完整性，對(duì)細(xì)胞、組織乃至器官行使正常功能并對(duì)外傷修復(fù)有重大影響。膠原蛋白的種類(lèi)很多，一般皮膚和骨骼中的是Ⅰ型膠原蛋白。膠原分子鏈上含有大量的親水基團(tuán)，與水結(jié)合的能力很強(qiáng)。近年來(lái)，膠原蛋白已廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)保健品、化妝品、生物肥料等領(lǐng)域，而且在醫(yī)藥工業(yè)和醫(yī)學(xué)臨床的研究和應(yīng)用中發(fā)揮著巨大作用，同時(shí)在藥物釋放等方面存在著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

紅景天苷（Salidroside）是景天科紅景天屬紅景天的主要有效成分。紅景天為多年生草本植物，主要生長(zhǎng)在海拔1 600-4 000米的高寒、干燥、缺氧、強(qiáng)紫外線(xiàn)照射、晝夜溫差大的地區(qū)，具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和生命力。紅景天具有很多藥理作用，包括抗病毒活性［2］、抗癌性［3］、保肝藥［4］、治療糖尿?。?］以及抗氧化作用［6］。近些年，大量體外研究［7-9］表明紅景天苷具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及保護(hù)神經(jīng)的作用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直致力于對(duì)紅景天苷的研究。我們課題組亦對(duì)紅景天苷進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究報(bào)道［10，11］。

本研究以膠原蛋白為支架材料，并復(fù)合紅景天苷微球，探討與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 紅景天苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度為99.8%），殼聚糖（浙江金殼生物化學(xué)有限公司），司盤(pán)80（廣州市西陸化工有限公司），京尼平（和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，日本），DMEM-F12培養(yǎng)基（Gibcol公司，美國(guó)），胎牛血清（杭州四季青公司），DAPI（Sigma公司，美國(guó)），F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（Abcam公司，美國(guó)），S100（兔抗，Abcam公司，美國(guó)），胰酶（Gibcol公司，美國(guó)），CCK-8（Sigma公司，美國(guó)）。

1.1.2 主要儀器 低速離心機(jī)（LD4-2A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)），37℃烘箱（HH·B11·360-BS-II，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng)），冷凍干燥機(jī)（LGJ，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)），恒溫振蕩器（ZD-85，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)），掃描電子顯微鏡（JSM-5600，日本電子光學(xué)公司），電子天平（AE200，上海威足醫(yī)療儀器廠(chǎng)），酶標(biāo)儀（ABI7300，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），37℃ CO2培養(yǎng)箱（HF90/HF240，SMART CELL），熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性Wistar大鼠，體重200±15 g，由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供，符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 紅景天苷微球的制備 采用乳液法制備紅景天苷微球。將250 mg殼聚糖溶于10 mL 2%的乙酸溶液，20 mg紅景天苷溶于1 mL水中，二者混合均勻，制成水液。將100 mL液體石蠟與2 mL司盤(pán)80置于錐形瓶中，放在磁力攪拌器上攪拌（450 r/min）。水液裝入分液漏斗后對(duì)準(zhǔn)攪拌中心，使水液滴下，被打散成均勻的微球，約每30-40 s滴一滴。待水液滴完后，再逐滴加入5% 三聚磷酸鈉25 mL，持續(xù)攪拌至形成穩(wěn)定的微球顆粒。靜置1 h，棄上清，2 000 r/min離心30 min，棄上清，分別用石油醚和異丙醇洗滌3次，棄上清后，-20℃冰箱過(guò)夜，真空冷凍干燥機(jī)凍干12 h，密閉封裝。

1.2.2 材料的制備 將自制膠原蛋白（從豬皮中提?。┗驈?fù)合了紅景天苷微球的膠原蛋白（每40 g膠原蛋白中加入30 mg紅景天苷微球）裝入到10 mL的注射器中，注入到24孔板中，蓋上蓋子，其間防止出現(xiàn)氣泡，置于-20℃冰箱里過(guò)夜，真空冷凍干燥機(jī)里凍干72 h，得到空白材料和加藥材料。將每個(gè)圓柱體材料分割成4個(gè)，用1%京尼平37℃交聯(lián)30min，每10 min翻轉(zhuǎn)1次，無(wú)水乙醇浸泡5 min，蒸餾水洗3遍，10 min/次，-20℃冰箱里過(guò)夜，真空冷凍干燥機(jī)凍干24 h，60Coγ射線(xiàn)滅菌法滅菌，自封袋分裝并密封常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞的提取與培養(yǎng) 取雌性Wistar大鼠1只，體重200±15 g，脫頸處死，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒10 min，在超凈工作臺(tái)里取其后腿的股骨及脛骨，去掉肌肉，分別用剪刀剪去一端，完全培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%肽牛血清）沖洗骨髓腔至其發(fā)白，細(xì)胞篩過(guò)濾，得到分散單個(gè)核細(xì)胞，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，隔日換液，培養(yǎng)得到貼壁細(xì)胞。流式細(xì)胞法鑒定提取細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。取第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞在支架材料上的黏附 材料經(jīng)過(guò)60Coγ射線(xiàn)滅菌法滅菌后，無(wú)菌環(huán)境下，將空白材料和加藥材料各取一塊，放入培養(yǎng)皿中，加入4 mL 0.01mol/L PBS浸泡，37℃ CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜。取第4代BMSCs，待生長(zhǎng)至80%融合，棄原液，用0.01 mol/L PBS洗2遍，0.25%的胰酶消化30 s左右，完全培養(yǎng)基終止消化，用槍輕輕吹打，混合均勻，調(diào)整細(xì)胞密度為2×109個(gè)/L，每塊材料接種2 mL，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，補(bǔ)加完全培養(yǎng)基至4 mL，37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換液。

細(xì)胞與材料共培養(yǎng)3 d后將材料取出，2.5%戊二醛固定。材料固定24 h后，棄戊二醛，0.01 mol/L PBS洗2遍，10 min/次，丙酮-醋酸異戊酯（1∶1）作用10 min，棄丙酮-醋酸異戊酯后，醋酸異戊酯作用30 min，無(wú)水乙醇洗3次，30 min/次。將材料置于-20℃冰箱冷凍過(guò)夜，冷凍干燥機(jī)凍干48 h，制樣，噴金，掃描電鏡進(jìn)行觀(guān)察。

1.2.5 CCK-8法測(cè)細(xì)胞在材料上的增殖 材料經(jīng)過(guò)60Coγ射線(xiàn)滅菌法滅菌后，無(wú)菌環(huán)境下剪成3 mm×3 mm×1 mm的長(zhǎng)方體狀，放入96孔板，分成8組。第1組為空白材料+完全培養(yǎng)基，第2組為加藥材料+完全培養(yǎng)基，第3組為空白材料+完全培養(yǎng)基+紅景天苷（藥物終濃度為100 μg/mL），第4組為完全培養(yǎng)基，第5-8組為第1-4組對(duì)應(yīng)的加細(xì)胞組，每組25孔。加細(xì)胞組每孔接BMSCs約2×104個(gè)，置37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換液。細(xì)胞與材料共培養(yǎng)24 h，每組取5個(gè)孔，將待測(cè)孔的材料轉(zhuǎn)移到新孔，加100 μL完全培養(yǎng)基，無(wú)細(xì)胞組原液吸去，加100 μL完全培養(yǎng)基，各待測(cè)孔加入CCK-8 10 μL，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育3 h，將各孔的液體轉(zhuǎn)移至另一96孔板中，酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處的吸光值。細(xì)胞與材料共培養(yǎng)48 h，72 h，5 d，7 d，同樣的方法，每組取5個(gè)孔測(cè)450 nm處的吸光值。

1.2.6 細(xì)胞-支架材料復(fù)合培養(yǎng) 材料經(jīng)過(guò)60Coγ射線(xiàn)滅菌法滅菌后，無(wú)菌環(huán)境下將材料裁成長(zhǎng)方體狀（13 mm×5 mm×2 mm），放入12孔板，分為3組：（1）空白材料組+完全培養(yǎng)基；（2）加藥材料組+完全培養(yǎng)基；（3）空白材料+完全培養(yǎng)基+紅景天苷（藥物終濃度為100 μg/mL）。每組接種大鼠BMSCs約2×105個(gè)，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞與材料共培養(yǎng)7 d及14 d時(shí)，3組材料各取出一個(gè)，10%福爾馬林固定。固定7 d后，將材料取出，用自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行脫水，常規(guī)石蠟包埋并切片，進(jìn)行HE染色、S100免疫熒光化學(xué)染色。

1.2.7 免疫熒光化學(xué)染色 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，0.01% tritonX-100作用10 min，0.02 mol/L PBS 洗3次，每次3 min；3% H2O2作用10 min，0.02 mol/L PBS 洗3次，每次3 min；5% BSA封閉20 min，棄多余封閉液，滴加S100（1∶200稀釋?zhuān)┮豢?，濕?℃過(guò)夜，0.02mol/L PBS 洗，每次5 min；加入FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶1 000稀釋?zhuān)?7℃濕盒避光作用30 min，0.02 mol/L PBS洗3次，5 μg/mL DAPI室溫避光染核10 min，0.02 mol/L PBS洗3次，每次5 min，50%甘油磷酸緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件Spass17.0進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P ＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 材料的表征

掃描電鏡結(jié)果（圖1）顯示，材料呈海綿多孔狀，相互連通，交織成網(wǎng)狀，孔隙約為50-150 μm。純膠原蛋白材料表面相對(duì)光滑，復(fù)合紅景天苷微球材料可見(jiàn)到嵌入于材料中的紅景天苷微球。

2.2 細(xì)胞在材料上的黏附性

材料與細(xì)胞共培養(yǎng)3 d后，掃描電鏡結(jié)果（圖2）顯示，細(xì)胞較均勻地貼附在材料表面，細(xì)胞核大小均一，細(xì)胞在材料上黏附并生長(zhǎng)，材料與細(xì)胞具有良好的生物相容性。

2.3 細(xì)胞在材料上的增殖

CCK-8法測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果見(jiàn)表1。細(xì)胞接種到材料上，同種材料，隨著時(shí)間，材料上的細(xì)胞顯著增殖（P ＜0.05）。同一時(shí)間，接種到材料上的細(xì)胞增殖與單純的細(xì)胞增殖相比有顯著差異（P ＜0.05）。復(fù)合紅景天苷微球材料細(xì)胞的增殖與空白材料或在培養(yǎng)基里直接加入紅景天苷組無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。

2.4 HE染色

細(xì)胞與材料共培養(yǎng)7 d，14 d HE染色結(jié)果見(jiàn)圖3，7 d時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞在材料表面黏附，生長(zhǎng)和增殖。細(xì)胞呈梭形，形態(tài)良好，大小均一。14 d與7 d相比較，材料上的細(xì)胞明顯增多。該結(jié)果提示細(xì)胞可以在材料上黏附、生長(zhǎng)并增殖，材料與細(xì)胞具有良好的生物相容性。

圖 1 芯層材料的掃描電鏡

圖2 材料接種細(xì)胞3d后掃描電鏡

表1 細(xì)胞在不同材料上的增殖（±s）

表1 細(xì)胞在不同材料上的增殖（±s）

注：同一種材料a表示P ＜0.05 vs其他組，同一時(shí)間b表示P ＜0.05 vs其他組

類(lèi)別24 h48 h72 h5 d7 d空白材料組0.37±0.010.47±0.02a0.901±0.03a1.28±0.03a1.95±0.05a復(fù)合紅景天苷微球組0.36±0.010.47±0.01a0.89±0.01a1.30±0.01a1.94±0.05a空白材料+紅景天苷組0.33±0.010.47±0.01a0.90±0.03a1.30±0.02a2.02±0.08a細(xì)胞組0.87±0.04b1.21±0.03ab2.15±0.05ab2.70±0.12ab3.23±0.06ab

2.5 S100免疫熒光化學(xué)染色

S100免疫熒光化學(xué)染色見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示空白材料組S100表達(dá)為陰性，復(fù)合紅景天苷微球材料組與空白材料+紅景天苷組S100表達(dá)為均陽(yáng)性。14 d與7 d相比較，材料上S100表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多。該結(jié)果顯示，膠原蛋白復(fù)合紅景天苷微球能有效的誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并增殖。

3 討論

作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，膠原蛋白常常被用作組織工程支架材料。用膠原蛋白制作的支架材料呈海綿多孔狀，孔隙之間相互連通，交織成網(wǎng)狀，有利于細(xì)胞的黏附。但膠原蛋白力學(xué)性能差，易降解，本研究用1%的京尼平將材料進(jìn)行交聯(lián)，改變了膠原蛋白的力學(xué)性能。姜東林等［12］發(fā)現(xiàn)經(jīng)京尼平交聯(lián)后，膠原蛋白具有更好的力學(xué)性能、生物相容性及更低的生物降解速率，且不影響細(xì)胞在材料上的增殖。我們此前也進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究報(bào)道［13］。

BMSCs是存在于骨髓中的一種干細(xì)胞，在體外可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等中胚層來(lái)源的細(xì)胞，還可跨胚層分化為具有神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞表型的細(xì)胞。BMSCs不僅取材方便，不存在倫理道德問(wèn)題，而且在體外容易培養(yǎng)，增殖速度快，不會(huì)出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)［14］。在膠原蛋白材料支架上三維培養(yǎng)細(xì)胞與二維培養(yǎng)細(xì)胞相比較，同一時(shí)間，細(xì)胞的增殖有顯著差異，說(shuō)明支架材料對(duì)細(xì)胞的增殖有影響。但在膠原蛋白中復(fù)合紅景天苷微球材料組與膠原蛋白材料組相比，同一時(shí)間，細(xì)胞的增殖無(wú)顯著差異，紅景天苷不影響大鼠BMSCs在材料上的增殖。這與白海等［15］的報(bào)道紅景天苷可影響B(tài)MSCs增殖，一定濃度下的紅景天苷可促進(jìn)BMSCs增殖不一致。范東艷等［16］研究發(fā)現(xiàn)，10 μg/mL紅景天苷可促進(jìn)BMSCs增殖分化，又不影響細(xì)胞增殖分化等生物學(xué)特性。林海泓等［17］研究證明紅景天苷對(duì)hMSCs有明顯促進(jìn)增殖的作用，對(duì)其的分化影響不明顯。但這些研究報(bào)道均是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行二維培養(yǎng)，本研究是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行材料支架上培養(yǎng)，且復(fù)合了紅景天苷微球，微球發(fā)揮了一個(gè)緩釋的效果。但不同的培養(yǎng)是否會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步研究。

圖 3 不同材料接種細(xì)胞7 d及14 d HE染色

圖4 不同材料接種細(xì)胞7 d及14 d S100免疫熒光化學(xué)染色

傳統(tǒng)中藥丹參、川芎嗪、黃芩甙等傳統(tǒng)中藥制劑［18-20］可誘導(dǎo) BMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化。S100免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示，復(fù)合紅景天苷微球材料組和空白材料+紅景天苷組中，神經(jīng)標(biāo)志性蛋白S100表達(dá)為陽(yáng)性，該結(jié)果表明復(fù)合紅景天苷微球的膠原蛋白可有效誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。姜紅［21］，李云玲［22-24］等均對(duì)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化作過(guò)研究報(bào)道。張維燁等［25］用紅景天苷藥物血清誘導(dǎo)從新生Wistar大鼠中獲得的神經(jīng)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)紅景天苷藥物血清可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，并促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育。也有研究證明紅景天苷能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而對(duì)損傷的神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用［26］。將紅景天苷用于神經(jīng)修復(fù)，發(fā)展前景十分廣闊。

4 結(jié)論

復(fù)合紅景天苷微球的膠原蛋白支架材料具有良好的生物相容性。紅景天苷微球復(fù)合到膠原蛋白中，發(fā)揮了良好的緩釋作用且可有效誘導(dǎo)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化。

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（責(zé)任編輯李楠）

The Effect of Scaffold Combined with Salidroside on Rat Bone Mesenchymal Stem Cells

WANG Jiu-na XIANG Da-wei TANG Jun-jie LI Gen ZHAO Ling QIN Wen ZHAO Hong-bin
（Institute of Orthopedics，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area，Lanzhou 730050）

The objective of this work is to investigate the effect of collagen scaffolds combined with salidroside microspheres on rat bone mesenchymal stem cells（rBMSCs）. The salidroside was made into microspheres that combined into the collagen. The surface character of material was observed by scanning electron microscopy（SEM）. The material was implanted with rBMSCs and observed for the cell adhesion on the material by SEM. The cell proliferation on the material was measured by CCK-8， and the cell proliferation and morphology on the material were detected by HE staining. S100 immunofluorescence was used to detect the differentiation of stem cells into nerve cells. Cells were seeded onto the scaffold， adhered and grew well on materials. While the time increased， the cells on the same material were significant proliferation（P＜ 0.05）. The expression of nerve cell marker protein S100 was positive. Conclusively， collagen combined with salidroside microspheres had good biocompatibility， salidroside microspheres did not affect cell proliferation on the material， and it could induce effectively rBMSCs into nerve cells.

salidroside；collagen；scaffold；bone marrow mesenchymal stem cells

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.033

2015-06-16

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81470087）

王九娜，女，碩士研究生，研究方向：組織工程；E-mail：ljty2012@163.com

趙紅斌，男，教授，研究方向：材料與組織工程；E-mail：zhao761032@163.com